专利名称：参与显花植物花粉自交不亲和性异交亲和性控制的蛋白及其编码基因和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物基因工程领域。具体地说，本发明涉及与显花植物，如茄科类自交不亲和性花粉异交亲和性控制的相关蛋白质及其编码基因SSK1，以及利用转基因RNAi下调花粉中该基因的表达所起到的花粉异交亲和性丧失的功能；同时还涉及对该基因所编码的蛋白序列比较分析等。
背景技术：
转基因技术是DNA重组技术之一，转基因植物自1983年首次在烟草中获得成功以后，至今已有35科120多种植物中获得成功。由于转基因技术可以通过外源基因的导入， 使得作物具有其原本没有的优良的品质和属性，因此可以提高作物产量，改善品质，减少除草剂和杀虫剂等农药的使用量，进而可以节省大量的劳动力，是解决全球粮食问题和农业可持续发展的一个重要的手段。自20世纪80年代以来，随着生物基因工程技术和相关技术的发展，转基因作物已经在生产上大面积的推广应用。据2009年2月23日年农业生物技术国际服务组织(ISAAA)发布的《2008年度全球生物技术作物商业化现状报告》统计结果显示，全球转基因作物的种植面积有1. 02亿hm2，种植国家有22个[1]。但是，转基因技术同样也是一把“双刃剑”。在作物转基因技术带给人们巨大的科学发展、经济效益和社会效益的同时，同样也对生态环境和人类健康等多方面可能造成的潜在的危险 。这些关于转基因生物安全性的问题受到越来越多的关注。目前认为转基因作物所可能带来的安全性问题主要表现在如下几个方面。第一，转基因作物可能造成环境和健康的生物安全性问题。转基因作物通常带有抗性筛选基因，有人认为这些抗性标记有可能影响人类抗生素药物的治疗效果。另外目前转基因作物所带有转入的目标基因大多为抗虫、抗病类基因，转基因的方法也通常为病原菌或是病毒介导，因此带有这些基因的病原菌和病毒的外流有可能产生新的致病性病毒^。第二，转基因作物可能造成生态安全性风险。具有抗除草剂的抗性转基因作物的抗性基因可能通过物种间的基因流动转移至杂草或是近缘野生型品种上，使得这些杂草和野生种具有抗除草剂的抗性，多次转移后可能成为 “超级杂草”，进而破坏生态系统tt_6]。此外，作为外来品种的转基因作物，通常具有“选择优势”，可能会影响植物基因库的遗传结构，导致野生等位基因的以及其它遗传资源的丢失， 进而影响生态系统中物种的种类和种群的数量，使得生物多样性的丧失[6]。第三，转基因作物有可能产生转基因食品安全性的问题。已有研究报道提示，转基因作物在饲喂小鼠时可以造成潜在的危害[7’8]。总而言之，这上述的转基因实验和作物的潜在的风险提示我们对于转基因实验和转基因作物的有效的安全性的控制是必须的M。转基因实验和转基因作物的造成风险的主要的原因是转基因在不同物种间和品种间的流动和转移，即基因漂流。基因漂流(gene flow/dispersal)指的是基因通过花粉授粉杂交等途径在种群之间扩散的过程。转基因植物基因漂流的途径有三种。其一是通过转基因植物的种子或组织的扩散；其二是通过转基因植物的花粉向同种或近缘种植物杂交扩散；其三则是通过非同种生物间，例如植物的病原菌等发生基因的漂流。在这三种途径中， 通过花粉进行的基因漂流的速度最快，影响范围也最广。因此，对于降低植物转基因的漂流风险一个有效的方法是改变其转基因花粉的育性和亲和性。Mariani等人于1990年利用绒毡层特异启动子TA^启动子驱动重组B-葡萄糖醛酸酶或核糖核酸酶基因(RNase Tl或 barnase)在转基因烟草和油菜的绒毡层中表达从而选择性的破坏绒毡层，以获得雄性不育株_。该技术已经应用于小麦、水稻和番茄等经济作物[11_14]。随后，也有利用RNAi技术抑制花粉发育相关的基因进而构建雄性不育株的研究报道[15]。由此可见，通过转基因方法产生雄性不育系而限制转基因植物基因漂流有效的方法。但是，目前在构建了雄性不育系的这些株系中，尽管产生的雄性不育系显著的限制了转基因的漂流，但同时也使得得到的转基因株系没有办法自交，因此也无法得到相应的纯合体，不利于育种。因此，找到一种既可以抑制转基因的漂流，但却可以不影响自交的方法对于分子育种有一定的意义。自交不亲和性是自然界中天然存在的一种种内生殖隔离障碍，指的是显花植物自己的雌蕊可以特异性的识别自己的花粉，从而可以抑制其完成传粉受精的过程[16]。目前研究发现，茄科、车前科、玄参科和蔷薇科的植物大多具有自交不亲和性，它们所采用的自交不亲和性为核酸酶类型的配子体自交不亲和性。在这些植物中，控制花柱和花粉的自交不亲和性的因子分别为S-核酸酶(S-RNase)和SLF，花柱因子S-核酸酶起到的是细胞毒性的作用，而花粉因子SLF的主要作用是抑制异己的S-核酸酶的毒性作用从而保证花粉在异花授粉时可以不被抑制而完成传粉受精的过程[16’17]。植物的自交不亲和性只是涉及到花粉在传粉过程中花粉的萌发以及花粉管的生长，而并不影响花粉本身的发育以及植株的其它的性质，因此一方面利用转基因的方法改变花粉的自交不亲和性可以产生新类型的雄性不育系，以有效的抑制转基因的漂流，降低转基因实验和转基因作物可能造成的风险；另外一方面也可以同时改变花柱的自交不亲和性使得产生的这类新型的雄性不育系可以完成自交产生纯合体，因此有利于通过该方法建立茄科类经济作物优秀品质、性状控制的基因库， 从而利于育种工作的进行。
发明内容
本发明从核酸酶类型的配子体自交不亲和性的研究和利用出发，从茄科的杂交矮牵牛(Petunia hybrida)中研究发现并克隆了一个参与控制核酸酶类型配子体自交不亲和性的因子，命名为PhSSKl (PhSLF-interacting-Skpl-Likel)。研究表明，该基因通过与自交不亲和性的花粉因子相作用，协助花粉因子完成在异花授粉后传粉受精过程的正常进行， 该基因是花粉特异表达的基因，不具有基因型特异性。通过RNAi显著下调花粉中该基因的表达可以有效抑制带有转基因片段花粉在与具有正常自交不亲和性的杂交矮牵牛授粉时的亲和性；同时，却并不抑制该类型花粉在授粉花柱自交不亲和性功能丧失的突变体矮牵牛时的亲和性。因此该方法是一类新的可以抑制转基因漂流的控制技术，同时该方法还适用于茄科类的新型的构建雄性不亲和系的技术。针对上述内容，本发明的目的是提供一个新的参与控制茄科类自交不亲和性花粉特异的基因。本发明所提供基因，名称为PhSSKl (PhSLF-interacting SKPl-Likel)，来源于杂交矮牵牛(Petunia hybrida)，是下列核苷酸序列之一
1) DNA 序列；2)编码蛋白质序列的多核苷酸；3)与限定的核苷酸序列能够在高严谨条件下杂交的核苷酸序列；4)与限定的氨基酸序列具有75%以上同源性，且编码相同功能蛋白质的氨基酸序列。本发明的另一个目的是提供WiSSKl基因所编码蛋白质，来源于杂交矮牵牛，是下列蛋白质序列之一1)由WiSSKl基因编码的蛋白质序列；2)与限定氨基酸序列具有75%以上的同源性，且具有相同功能蛋白质的氨基酸序列。3)具有限定氨基酸残基序列的蛋白质，或者是将限定氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失或添加且具有与限定氨基酸残基序列相同活性的由限定蛋白质衍生的蛋白质。。本发明的第三个目的是提供一种WiSSKl-RNAi的转基因载体，用于构建一种通过抑制花粉的亲和性的雄性不亲和性的转基因材料，该材料可以有效避免转基因漂流，便于建立优良品质、属性控制的种质基因库。含有本发明基因的表达载体及细胞系或转基因植物均属于本发明的保护范围。其中的细胞系可以是真核的也可以是原核的。具体表述如下1、一种参与显花植物花粉自交不亲和性异交亲和性控制的相关蛋白质或其功能类似物，其中所述蛋白质具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，所述功能类似物是SEQID NO 2所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列且具有与所述蛋白质相同的功能的类似物，或者与SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列具有至少75%的同源性的功能类似物。2、根据以上1所述的蛋白质或其功能类似物，其具有SEQ ID NO 2所示的氨基酸序列。3、一种编码以上1或2所述的蛋白质或其功能类似物的基因。4、根据以上3所述的基因，其具有SEQ ID NO 1所示的核苷酸序列。5、一种基因，其是以上3或4所述基因的核苷酸序列经过取代，缺失或添加一个或多个核苷酸且与以上3或4所述基因具有相同功能的突变体、等位基因或衍生物。6、一种含有以上3、4或5所述的基因或其片段的载体。7、以上6所述的载体，其为植物表达载体。8、以上7所述的载体，其为WiSSKl-RNAi转化载体。9、一种宿主细胞，该细胞含有以上3、4或5所述的基因序列或其片段。10、一种宿主细胞，该细胞含有以上6-8中任一项所述的载体。11、根据以上10的宿主细胞，该细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。12、一种在显花植物中造成花粉异交亲和性丧失的方法，包括用以上8中所述的载体转化植物细胞，和将转化的植物细胞培育成植株。13、按照以上12所述的方法，其中所述的转化包括转化RNAi干扰法。
14、按照以上12所述的方法，其中所述显花植物是茄科植物，包括杂交矮牵牛。
下面将结合附图对本发明进行进一步详细描述。图IPhSSKl基因的DNA序列。图2WiSSKl基因编码的氨基酸序列。图3PhSSKl基因的基因型分析和表达谱分析。(A)不同基因杂交矮牵牛中W1SSKl 的DNA印迹杂交分析。待检测DNA分别经EcoR V和EcoR I单酶切消化，并分别使用WiSSKl 基因全长以及部分片段(l_789bp)为探针进行杂交分析，右侧的数字为条带的分子量大小，单位为Kb。(B)杂交矮牵牛中各个组织中WiSSKl表达的RT-PCR分析，Tubulin为对照。 (C)各个基因型杂交矮牵牛中WiSSKl表达的组织特异性分析。纵坐标为W1SSKl mRNA的相对量。(D)各个基因型杂交矮牵牛不同组织中WiSSKl蛋白的免疫印迹检测。抗体为W1SSKl 的抗体，丽春红染色为上样对照。图4PhSSKl_RNAi转化载体的构建示意图。其中NOS转录终止子为原始ρΒΙΙΟΙ载体上的转录终止子。PhSSKl基因组DNA中白色的区域为WiSSKl基因的两个外显子，灰色的区域内含子。图5PhSSKl_RNAi转基因Ttl代植株的分子分析。㈧Ttl代植株的DNA印迹杂交分析。待检测DNA经EcoRV单酶切消化，使用WiSSKl基因全长为探针进行杂交分析，黑色箭头所指出的条带为受体植株内源的WiSSKl基因，右侧的数字为条带的分子量大小，单位为 Kb。(B) T0代植株花粉WiSSKl的qRT-PCR分析，纵坐标为WiSSKlmRNA的相对含量(野生型受体花粉的WiSSKl的mRNA量为1)。PhSKPl_2是另外一个从矮牵牛花粉中克隆得到的 SKPl同源基因，在此作为WiSSKl下调的实验对照。(C)左侧图为Ttl代植株花粉中WiSSKl 蛋白的免疫印迹分析，Tubulin为上样对照。右侧的柱状图为蛋白免疫印迹结果经定量软件Quantity One分析定量的相对蛋白含量，计算时选用Tubulin为参照蛋白。图6PhSSKl_RNAi转基因T1代植株的分子分析。(A)检测植株的DNA经EcoRV单酶切消化，以WiSSKl基因全长为探针进行DNA印迹杂交分析。黑色箭头指示的是植株内源的W1SSKl拷贝，各个图右侧的数字表示片段的分子量的大小，单位为Kb。(B)T1代植株花粉WiSSKl的qRT-PCR分析，纵坐标为WiSSKl mRNA的相对含量。PhSKPl_2为实验的对照。图7PhSSKl_RNAi转基因植株为父本与杂交后代的基因型分析。图中包含有 4张小图，每张小图为单个转基因植株的分析结果。T-DNA为I^hSSKl-RNAi转基因片段，Sv 和分别代表检测的不同单倍型S-核酸酶。检测的前两泳道为测交的母本和父本对照。。图8亲和种矮牵牛(St^)的花柱自交不亲和性功能分析。(A)亲和种矮牵牛&& 和不亲和矮牵牛S1S1A3Ai和SvSv花柱中S-核酸酶的核酸酶活性胶分析。左侧的数字表示蛋白质的分子量大小，单位为KD，黑色箭头所指示的为活性核酸酶的条带。￠) 中S-核酸酶的免疫印迹分析。Str核酸酶为大肠杆菌(E.coli)表达蛋白，其余四道为个基因型植株的花柱总蛋白的检测结果。左侧的数字表示蛋白质的分子量大小，单位为KD。黑色方框所指示的为检测到的S-核酸酶(S-RNase)，星号所示的为花柱蛋白中检测到的非特异的条带。上样对照为考马斯亮蓝染色的蛋白胶。图9PhSSKl_RNAi转基因植株为父本与&&杂交后代的基因型分析。图中包含有4张小图，每张小图为单个转基因植株的分析结果。T-DNA为W1SSKl-RNAi转基因片段，S。、 Sv和分别代表检测的不同单倍型的S-核酸酶。检测的前两泳道为测交的母本和父本对照。。序列说明SEQ ID NO :1 是 PhSSKl 基因的 DNA 序列；禾口SEQ ID NO 2是PhSSKl基因编码的氨基酸序列。
具体实施例方式以下本文将通过具体的实施例来描述发明，但是所述实施例仅是为了举例说明， 而并非对本发明的限定。实施例11、矮牵牛材料温室中生长的基因型为S3lS3l> S3S3> SvSv, S3lSv和&&的杂交矮牵牛，这里S 代表的为植物自交不亲和性位点(S位点)的基因型，下标^，3，v和。分别代表不同的单倍型。其中SSp S3S3, s%sv购自美国北伊利诺伊大学生命科学系和植物分子生物学中心，
和SvSv基因型为我们通过对杂交矮牵牛进行剥蕾强制授粉(即在花发育早期，在S-核酸酶尚未表达前，即在矮牵牛花蕾长度约为3厘米左右，将其剥开进行强制收粉)得到的， 4 为购自北京中农新泰科农业技术公司。在上述矮牵牛材料中，S1S1, S3LS3L> S3S3> SvSv和 S3lSv为具有正常自交不亲和性的杂交矮牵牛，&&为花柱自交不亲和性功能丧失的自交亲和的杂交矮牵牛。2、PhSSKl基因的克隆经过对国际茄科基因组计划网站(SGN，SOL Genomics Network, http:// solgenomics.net/)上发布了一万余条矮牵牛的EST及其编码蛋白的分析，发现其中一个被预测来源于雄蕊组织的单基因编码的蛋白与一个从车前科金鱼草中鉴定克隆得到的参与到核酸酶类型的自交不亲和性的花粉因子AhSSKl相似，在系统进化上也有紧密的联系， 将其命名为WiSSKl。经过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术(RACE)，我们得到了 WiSSKl的全长编码序列。具体步骤如下，提取杂交矮牵牛花粉的总RNA，进行反转录得到cDNA， 然后采用5，的特异引物(引物序列为5，-ATAAAGCTTATGGCATCAGAAAAGAAAATG-3，)禾口 3， 的 CDSIII 引物(引物序歹Ij :5，-ATTCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACATG-3’ )进行 PCR 扩增，反应条件为 94°C 5min ；94°C 30s, 56°C 30s, 72°C 90s，;35 个循环；72°C lOmin，切胶回收测序得到了 WiSSKl基因全长。WiSSKl基因全长有113^ρ，有两个外显子和一个内含子，编码179氨基酸残基组成的蛋白质(图1和图2 ；SEQ ID NO 1和2)。3, PhSSKl的基因型分析和表达谱分析分别提取了 S1S1J3LS3L和4 基因型矮牵牛的基因组DNA，进而用EcoRV和EcoRI 酶切消化，以WiSSKl基因组全长为探针进行了 DNA印迹杂交分析，检测结果显示WiSSKl基因在各个基因型的杂交矮牵牛中不具有单倍型特异性。通过RT-PCR、qRT-PCR和蛋白质免疫印迹杂交的方法检测WiSSKl在矮牵牛各组织中的表达情况。PhSSKl RT-PCR的引物为正向引物5' -CAA TCG TAA GAC CATAGT AAA-3 ‘，反向引物 5' -GGA ATT ATT GGT CGA CCC TGT-3 ‘，反应条件为 94°C 5min ；940C 30s, 580C 30s, 72°C 90s, 30 个循环；72°C IOmin,电泳检测。qRT-PCR 的引物为正向引物 5' -GAC ACT AAA ATC AAA CGA TGA CCA A_3'，反向引物为 5' -TCA TGT TCT TGA GCA TTT CAG ATT G-3'，反应条件为 95°C，IOmin ;95°C，15s，60°C，lmin，40 个循环。蛋白质免疫印迹杂交使用的抗体为兔源的WiSSKl的抗体(购自中国科学院遗传与发育生物学研究所动物中心)。mRNA和蛋白质检测的结果显示该基因为一个花粉特异表达的基因(图 3)。实施例21、PhSSKl-RNAi转化载体的构建为了研究W1SSKl的生物学功能，我们构建了用于通过RNAi干扰的方法降低矮牵牛花粉中WiSSKl表达的双源转化载体。构建的过程如下采用的原始载体为Clontech公司的PBIlOl双源转化载体，该载体的大小为12. 2Kb ；通过HindIII和)(baI连入了花粉特异的表达基因Lat52的启动子[18]；由于WiSSKl本身具有一个500bp (沈5_76幻的内含子， 因此，在构建RNAi载体时保留WiSSKl基因序列1-789，以其⑶S序列在NCBI数据库中进行 BLAST比对，选取WiSSKl编码序列下游从1489，长为289bp的特异区段的反向互补序列构建形成siRNA的区段，整个PhSSK-RNAi转录区通过XbaI和kal双酶切接入ρΒΙΙΟΙ载体； 转录终止使用载体PBIlOl上的原始的NOS转录终止子(图4)。在整个构建的过程中使用的工程菌株为E. coli DH5 α (购自hvitrogen生物公司)。2、转基因Ttl代植株的获得和鉴定通过叶盘转化的方法用构建好的W1SSKl-RNAi载体转化具有严格自交不亲和性的矮牵牛，受体的基因型为S3Jp具体转化步骤如下用W1SSKl-RNAi载体转化农杆菌，然后进而将带有转基因载体的农杆菌菌液与消毒后切成小块的杂交矮牵牛叶片共培养，进而诱导，筛选愈伤，培养得到转基因植株。进而，分别提取了野生型受体植株和转基因株系的基因组DNA，用EcoRV进行完全的酶切消化，以W1SSKl基因的全长序列作为探针进行杂交分析。鉴定得到了 7个独立的转基因株系，分别命名为B、El、J2、K4、H6、J4和M8。进而，我们检测了这7株转基因株系的花粉中W1SSKl的表达情况。通过 qRT-PCR(所需引物和反应条件与实施例1中的qRT-PCR引物和反应条件相同)和蛋白质免疫印迹分析(WiSSKl抗体(购自中国科学院遗传与发育生物学研究所动物中心))的结果显示，转基因PhSSKl-RNAi显著下调了 Ttl代植株花粉中PhSSKl的表达。此外，通过qRT-PCR 还检测了花粉中另外一个Skpl-Iike的基因，PhSKPl-2的表达。使用的引物序列为正向引物 5' TGG ATC TCA CAT GCC AGA CTG T 3'，反向引物 5' TTC TTAATG TTG AAC GTC TTC CTT ATC T 3'，反应条件按照96°C 10分钟；96°C 15秒，60°C 1分钟，40个循环，进行。检测结果显示该基因表达并不受到转基因的影响，因此表明转基因WiSSKl-RNAi载体是特异性的下调WiSSKl的表达，没有“误击”现象的存在(图5)。我们对得到的转基因Ttl代植株的表型进行了分析，结果显示WiSSKl-RNAi转基因并没有引起转基因植株整个植株生长发育发生显著的改变，花柱授粉行为和结实情况也没有受到影响。但是，对于花粉授粉行为的检测中发现，尽管花粉在自交授粉时仍然表现为严格的自交不亲和性，但是在通常是异交亲和授粉的情况下，转基因的花粉却表现出不亲和和结实情况显著下降的授粉行为的异常，提示转基因下调花粉中WiSSKl表达后影响了花粉的育性或者是自交不亲和性，或者二者兼有之。
3、转基因T1代植株的获得和鉴定为了检测W1SSKl-RNAi转基因后对于花粉亲和性和育性的影响，我们选择转基因植株J2和K4作为研究对象。选用基因型为SvSv的自交不亲和野生型植株作为父本与上述两株转基因植株杂交得到T1代植株。所得到的1\代植株的基因型均为i^Sv。随后我们对得到的T1带植株进行了 DNA印迹杂交分析，检测了 5株K4的后代和12株J2的后代。由于这些T1代的父本均为SvSv，因此它们分别命名为VJ和VK。DNA印迹杂交分析中以WiSSKl 基因全长为探针进行检测。检测结果显示12株VJ中有9株(VJ2、VJ4、VJ5、VJ6、VJ7、VJ8、 VJ10、VJ11和VJ12)带有转基因拷贝，5株VK中的3株(VK1、VK2和VK3)带有转基因片段， 这些带有转基因拷贝的T1代植株所带的转基因拷贝的带型与其母本一致，表明K4和J2中的转基因片段的插入是以4个转基因片段形成的一个连锁群插入的。随后我们对于得到的转基因T1代植株花粉中W1SSKl的表达进行了分析。以 qRT-PCR的方法(检测的方法和引物与实施例1中的qRT-PCR相同)检测了这些植株花粉中W1SSKl的mRNA含量。结果提示，在检测的转基因T1代的花粉中该基因的表达同样受到了显著的下调(图6)。4、显著降低花粉中W1SSKl的表达可以导致花粉异交亲和性或育性的丧失随后我们对于得到的转基因T1代植株花粉的授粉行为进行了检测分析。在自花授粉和异花授粉的时候转基因T1植株的花粉的授粉行为和结实情况没有受到显著的影响。 但是由于我们检测的转基因T1代植株为杂合体，因此为了进一步研究转基因花粉的授粉行为，我们对以转基因植株为父本与亲和授粉后的子代进行了基因型分析。分析方法为特异性引物进行PCR，共分析了 3个基因，其中T-DNA为转基因WiSSKl-RNAi的拷贝， PhS3L-RNase和WiSv-RNase分别为和Sv单倍型的S-核酸酶，用于植株的S基因型鉴定。 引物序列如下所示T-DNA(PhSSKl-RNAi)正向引物 5' -AGA CAC ACA CAA AGA GAA GGA G-3'，反向引物 5' -CAA CCC AAC CCG TTC ATT TAC-3 ‘ ；Ph&L-RNase (引物正向引物 5' -TGT GAC GAT CAC TGA AAT AAA T-3'，反向引物 5' CGA AGA AAG GAA TAT GTTCAT CC-3'； PhSv-RNase 引物正向引物 5' -GAT TAC GGA CGA AGC TGA TTG-3‘，反向引物 5' -GAA ACT TAA TTA TGG GTC CAT AAT CC_3'。所有的PCR 反应条件是94°C 5min ；94 °C 30s，58°C 30s, 72 °C 60s, 35 个循环； 72°C IOmin0然后PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测。我们共检测分析了 4个转基因T1代的后代，每个后代群体的个体数为M个(满足统计学的要求)，进而对于检测结果进行统计。分析结果显示，在后代群体中很少有带有转基因拷贝的个体，因此表明转基因植株中带有T-DNA的花粉在异交亲和授粉时不能正常完成传粉受精的过程，因此T-DNA不能传递到下一代的个体中。该结果提示自交不亲和性矮牵牛花粉中WiSSKl表达降低后会导致花粉亲和性或育性的下降，可以表现出类似雄性不育的特征(图7和表1，图7中仅显示了 M株后代个体中的20株，但表1中的统计学分析是基于全部M株后代个体进行的)。表1 PhSSKl-RNAi转基因植株T1代为父本与杂交后代的基因型分离统计
权利要求
1.一种参与显花植物花粉自交不亲和性异交亲和性控制的相关蛋白质或其功能类似物，其中所述蛋白质具有SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列，所述功能类似物是SEQID NO 2 所示的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或多个氨基酸或其他物种的同源序列且具有与所述蛋白质相同的功能的类似物，或者与SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列具有至少75% 的同源性的功能类似物。
2.根据权利要求1所述的蛋白质或其功能类似物，其具有SEQID NO :2所示的氨基酸序列。
3.一种编码权利要求1或2所述的蛋白质或其功能类似物的基因。
4.根据权利要求3所述的基因，其具有SEQID NO :1所示的核苷酸序列。
5.一种基因，其是权利要求3或4所述基因的核苷酸序列经过取代，缺失或添加一个或多个核苷酸且与权利要求3或4所述基因具有相同功能的突变体、等位基因或衍生物。
6.一种含有权利要求3、4或5所述的基因或其片段的载体。
7.权利要求6所述的载体，其为植物表达载体。
8.权利要求7所述的载体，其为WiSSKl-RNAi转化载体。
9.一种宿主细胞，该细胞含有权利要求3、4或5所述的基因序列或其片段。
10.一种宿主细胞，该细胞含有权利要求6-8中任一项所述的载体。
11.根据权利要求10的宿主细胞，该细胞为大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或植物细胞。
12.—种在显花植物中造成花粉异交亲和性丧失的方法，包括用权利要求8中所述的载体转化植物细胞，和将转化的植物细胞培育成植株。
13.按照权利要求12所述的方法，其中所述的转化包括转化RNAi干扰法。
14.按照权利要求12所述的方法，其中所述显花植物是茄科植物，包括杂交矮牵牛。
全文摘要
本发明公开了参与显花植物，如茄科类植物花粉自交不亲和性异交亲和性控制的相关的蛋白质及其编码基因，以及通过转基因下调该基因的表达在防止转基因漂流和建立品种的种质基因库方面的应用。本发明提供PhSSK1-RNAi载体和含有该载体的宿主细胞。本发明的基因在揭示显花植物，如茄科类自交不亲和性的分子机理具有重要理论意义，通过转基因RNAi下调花粉中该基因的表达可以导致花粉在异花授粉时亲和性的丧失，对于防止茄科类转基因植物中转基因的扩散和构建茄科经济作物如马铃薯和番茄等材料的优秀性状控制基因库有重要的作用和意义。
文档编号C12N15/82GK102234324SQ201010162148
公开日2011年11月9日 申请日期2010年4月28日 优先权日2010年4月28日
发明者李群, 薛勇彪, 赵仲华, 赵岚, 黄剑 申请人:中国科学院遗传与发育生物学研究所