用于检测与胃癌相关的ndrg4基因甲基化程度的试剂盒及其应用
【专利摘要】本发明公开了用于检测与胃癌相关的NDRG4基因甲基化程度的试剂盒及其应用，特点是一对NDRG4基因甲基化特异性扩增引物对及甲基化特异性测序引物，具体核苷酸序列如下：上游引物：5'? AGGGTTGGGGGTTTTAGA?3'；下游引物：5'?Biotin?CACCCTCTACCAAAAACTCAAAACTCAATT?3' ；测序引物：5'?GGGGTTTTAGAGTGTAT?3'，优点是检测简单方便、针对性强、检测准确率和效率高，用于制备胃癌早期诊断的试剂或试剂盒。
【专利说明】
用于检测与胃癌相关的NDRG4基因甲基化程度的试剂盒及其 应用
技术领域
[0001] 本发明设及一种辅助胃癌早期诊断的方法，尤其是设及一种用于检测与胃癌相关 的NDRG4基因甲基化程度的试剂盒及其应用。
【背景技术】
[0002] 胃癌是起源于胃上皮的恶性肿瘤，为世界范围内最常见的恶性肿瘤之一。其发病 率和病死率高居全球第4位和第3位，是一种严重威胁人类生命健康的疾病。在中国，胃癌的 发病率达29.9/10万，死亡率达22.3/10万。与世界各国相比，中国胃癌人群中男、女性世界 癌症死亡率高居于首位。随着医疗手段的发展及健康观念的普及，尽管胃癌的发病率和死 亡率呈下降趋势，但总体预后仍然较差。因胃癌患者的起病症状不典型和胃的解剖位置的 特点等原因，使得胃癌的早期诊断和及时治疗受到较大的限制，临床发现的胃癌多处于晚 期，从而使患者失去最佳治疗时期。同时临床亦有大量事实证明，恶性肿瘤若在病变初期就 给予及时治疗，其治愈率可迅速提高。从疾病筛查和预防角度来看，胃癌发病机制的研究， 尤其是应用于早期诊断方面的生物标记物相关研究迫在眉睫。
[0003] 胃癌的发生发展是一个多因素、多阶段、多基因异常表达累积的病变过程。近年来 研究发现，除了遗传学改变，表观遗传学改变亦参与了胃癌的发生发展过程。表观遗传学修 饰是指不设及基因组的碱基序列改变，却能导致可遗传性的表型变异，主要包括DNA甲基化 修饰、组蛋白修饰、RNA编辑等。DNA甲基化是最常见的表观遗传修饰，异常的DNA甲基化水平 将导致基因表达异常。肿瘤基因组CpG岛甲基化的改变W高甲基化为主。近年来，随着表观 遗传学研究的逐渐开展和深入，基因体区的甲基化变化在调控基因表达过程中也发挥了关 键作用，研究人员发现，3'端CpG位点的甲基化与基因表达的关系最为密切，掲示其为胃癌 发生的另一重要机制。因此，抑癌基因基因体区CpG岛高甲基化的发生也可作为胃癌早期诊 断的生物标志物。另外，与遗传学改变不同，甲基化过程不改变DNA的一级结构，通过逆转甲 基化过程，沉默的抑癌基因可能重新表达，运也为胃癌的治疗提供了一条新途径。
[0004] N-myc下游调控基因4(N-Myc downstream regulated gene 4，NDRG4)属于NDRG家 族成员之一，能通过调节祀基因的转录发挥生物学作用。目前，NDRG4与肿瘤相关性的研究 备受重视。有研究表明，NDRG4的表达水平随着胶质瘤恶性程度的升高而降低，提示NDRG4基 因的抑癌效应具有肿瘤细胞来源特异性。另外，NDRG4基因在结肠癌组织中的表达较正常结 肠组织明显降低，且其表达量增加可减少肿瘤细胞的增殖及侵袭，提示该基因甲基化可作 为临床对肿瘤早期诊断的候选指标。
[0005] 本项目采用焦憐酸测序方法检测胃癌患者癌组织与癌旁组织DNA中NDRG4基因3' 端CpG岛的甲基化水平，提供操作简便、特异性好、周期短、检测结果稳定可靠的甲基化定量 检测方法，同时为患者的治疗随访和预后评估提供科学依据。目前，国内外还没有公开任何 关于在胃癌中运用焦憐酸测序法检测NDRG4基因3'端CpG岛甲基化程度的检测试剂盒的相 关研究报道。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种检测简单方便、针对性强、检测准确率和 效率高的用于检测与胃癌相关的NDRG4基因甲基化程度的试剂盒及其应用。
[0007] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：一种用于检测与胃癌相关的 NDRG4基因甲基化程度的试剂盒，包括一对NDRG4基因甲基化特异性扩增引物对及甲基化特 异性测序引物，具体核巧酸序列如下： 上游引物：5'- AGGGTTGGGGGTTTTAGA-3' ； 下游引物：5'-Biotin-CACCCTCTACCAAAAACTCAAAACTCAATT-3' ； 测序引物：5 ' -GGGGTTTTAGAGTGTAT-3 '。
[000引还包括甲基化特异性PCR反应体系，其组成为:Zymo化q PreMix 10.0 ul;浓度为5 liM的上、下游引物各1.0 μ1;此0 6.5 μ1，甲基化修饰的DNA样本模板1.5 yl;PCR反应条件 如下：95°C预变性lOmin; 95°C变性303,55.4°(：退火403,72°(：延伸1111111，共45个循环的退 火反应;然后延伸反应72°C 7min。
[0009] 上述用于检测与胃癌相关的NDRG4基因甲基化程度的试剂盒的用途，其特征在于： 用于制备胃癌早期诊断的试剂或试剂盒。
[0010] 与现有技术相比，本发明的优点在于:本发明用于检测与胃癌相关的NDRG4基因甲 基化程度的试剂盒及其用途，所述的检测试剂盒包含用于检测NDRG4基因3'端CpG岛甲基化 的一对特异性扩增引物及一个甲基化特异性测序引物。该试剂盒通过焦憐酸测序技术检测 人体组织中是否存在胃癌早期NDRG4基因甲基化修饰变化。此技术的基本原理:采用生物素 标记的引物进行PCR扩增，将PCR产物纯化并变性为单链后，向其中加入四种酶的混合物： DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、巧光素酶及Ξ憐酸腺巧双憐酸酶。在测序过程中，每次加入一种 类型的dNTP，若该dNTP能与模板链互补配对，则在四种酶的作用下发生一系列的反应，最终 将巧光信号转换成电信号体现出来，显示为一个个高度不一的峰，峰的高度与碱基的个数 成正比。反之，当dNTP不能与模板链结合时，将直接被Ξ憐酸腺巧双憐酸酶降解，相应的将 不会显示峰值。原始数据会被软件自动转化为序列信息，通过软件直接显示的NDRG4基因甲 基化率判断受试者患胃癌的风险。该试剂盒可解决样本中DNA含量少、丢失率高、带有致癌 污染物等缺陷，相对传统胃癌检测技术具有发现早，灵敏度高，周期短、简单、方便，检测效 率高，针对性强，检测结果准确可靠、灵活快速和经济节约的优点，有利于胃癌的早期发现 和及时治疗。
【附图说明】
[00川图巧根据TCGA数据中450K甲基化忍片和mRNA测序数据的相关性确定了 NDRG4基 因3'端CpG岛被检测序列所在全基因组的位置，W及所检测的5个CpG点之间的关联性分析 结果(例如CpGl与CpG2的相关系数为0.88，CpG2与CpG3的相关系数为0.66); 图2为癌组织甲基化水平检测结果示例，如图示CpGl到CpG5的甲基化程度分别为38%， 29%，38%，36%，44%;图中阴影部分显示的是对应CpG位点的信号强度，结合该位点附近碱基 种类可分析得到其甲基化水平(即阴影框对应的上方数字）； 图3为癌旁组织甲基化水平检测结果示例，如图示CpGl到CpG5的甲基化程度分别为 13%, 9% a 7% a 2% a 9%； 图4为NDRG4基因甲基化水平在癌组织与癌旁组织的比较； 图5为NDRG4基因甲基化在诊断胃癌时的ROC曲线。
【具体实施方式】
[0012] W下结合附图实施例对本发明作进一步详细描述。
[001引1、研究对象和样本的收集 收集浙江省杭州市某医院2007年12月至2010年2月普外科手术切除的胃癌组织W及相 应配对的癌旁正常组织各110例，其中癌组织取自肿瘤组织的中屯、位置，癌旁组织距离癌组 织5cmW上且为非癌组织，所有病例手术前均未行放疗和化疗并经病理组织学检查证实。患 者年龄21~83岁，其中男性76例，女性34例;有吸烟史30例，无吸烟史80例;有饮酒史28例，无 饮酒史82例；肿瘤大小：>6cm 43例，<6cm 67例。根据美国癌症联合委员会(AJCC)胃癌TOM 分期：I和II期17例，III和IV期93期;无淋己结转移16例，有淋己结转移94例；组织分化程 度：高分化或中分化47例，低分化或无分化63例。所取标本离体后立即于液氮罐转运，然后 存在于-80 °C冰箱。
[0014] 纳入标准:①初治的胃癌患者;②胃部病变均经病理证实;③胃部病灶要求为原发 病灶，而非转移病灶;④术前未行放化疗;⑤无其他恶性肿瘤病史。
[0015] 排除标准:①无法得到病理证实的胃部病变;②有严重的未控制的内科疾病或急 性感染者;③妊娠或哺乳期妇女。
[0016] 预设最长随访时间5年，W胃癌患者死亡为终点事件，生存时间从术日算起。
[0017] 所有入组对象均告知并签署知情同意书。
[001引 2、全基因组DNA的提取 采用QIAamp DNA Mini Kit(Qiagen，Hilden，德国）DNA提取试剂盒提取组织全基因 组DNA，再通过化noDropSOOO超微量分光光度计（Thermo Fisher Scientific,美国）检测 所得DM的浓度，W供NDRG4基因甲基化水平的检测。
[0019] 3、甲基化修饰 采用EZ DNA Methylation Gold? Kit甲基化转化试剂盒（Zymo research,美国），严 格按照试剂盒说明步骤进行操作。经此步后，DNA序列中未甲基化的胞喀晚(C)转变为尿喀 晚化）。
[0020] 4、TCGA数据库450K甲基化和mRNA测序数据的相关性分析 下载TCGA数据库中胃癌患者癌组织Illumina Human Methylation 450K甲基化忍片数 据和11 lumina化Seq_RNA-SeqV2基因表达数据。提取NDRG4基因基因体区所有CpG位点的甲 基化数据和基因表达数据做相关性分析，可见图1中与基因表达高度负相关的CpG位点富集 于靠近3 '端的CpG岛（CpG: 41)，因此，发明人用焦憐酸测序法检测NDRG4基因 3 '端CpG岛的甲 基化水平。
[0021] 5、焦憐酸测序法 本实验采用焦憐酸测序技术对基因 3'端CpG岛的5个CpG位点（图2)进行了 DNA甲 基化水平分析。此技术的基本原理:采用生物素标记的引物进行PCR扩增，将PCR产物纯化并 变性为单链后，向其中加入四种酶的混合物:DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、巧光素酶及Ξ憐酸 腺巧双憐酸酶。在测序过程中，每次加入一种类型的dNTP，若该dNTP能与模板链互补配对， 则在四种酶的作用下发生一系列的反应，最终将巧光信号转换成电信号体现出来，显示为 一个个高度不一的峰，峰的高度与碱基的个数成正比。反之，当dNTP不能与模板链结合时， 将直接被Ξ憐酸腺巧双憐酸酶降解，相应的将不会显示峰值。本次研究采用PyroMark Assay Designs.0软件进行引物设计，NDRG4基因 3'端CpG岛甲基化水平的甲基化特异性引 物对及测序引物序列如下： 上游引物：5'- AGGGTTGGGGGTTTTAGA-3' ； 下游引物：5'-Biotin-CACCCTCTACCAAAAACTCAAAACTCAATT-3' ； 测序引物：5 ' -GGGGTTTTAGAGTGTAT-3 '。
[0022] 20 μ1的甲基化特异性PCR反应体系的组成为:ZymoTaq PreMix 10.0 ul;上、下游 引物各1.0 μΚ5 μΜ);此0 6.5 μ1，甲基化修饰的DNA样本模板1.5 yLPCR反应条件如下： (1)95°C 预变性 10min;(2)95°C变性3〇3,55.4°(：退火4〇3,72°(：延伸1111111，共45个循环的退 火反应;然后延伸反应72°C 7min。
[0023] 焦憐酸测序的前期准备:在PSQ96板中预先加入45μ1含有0.3ιχΜ上述甲基化特异性 测序引物的退火缓冲液(PyroMark Annealing Buffer; Qiagen);将需要使用的混匀的琼 脂糖珠总量（每样本3μ1)转移到一个微量离屯、管中；在琼脂糖珠中加入结合缓冲液 (PyroMark Binding Buffer; Qiagen)，使得平均每个样品约有50μ1的体积，将混合物混 匀；将W上混合物加入PCR产物(5化1反应体积）中，每样本50μ1;将PCR产物在常溫下混匀 lOmin，使得磁珠与生物素结合;在真空预备工作站中，四个样品板中依次加入180ml的高纯 水、70%乙醇、洗涂缓冲液（PyroMark Wash Buffer; Qiagen)和120ml的变性缓冲液 (PyroMark Denaturation Solution; Qiagen);打开真空预备工作站的累，将真空准备工 具在高纯水中清洗30s;然后将真空准备工具（PyroMark Vacuum Prep Filter Probes; Qiagen)移到PCR板中，抓取琼脂糖珠(在磁珠与PCR产物结合后Ξ分钟内完成此操作）;拿起 PC財反，检查是否大部分磁珠都被吸附在了真空准备工具上;将真空准备工具放入70%乙醇 中5s;然后移到变性缓冲液中5s;再移到洗涂缓冲液中清洗5-lOs;关掉累;将真空准备工 具放入含有测序引物的板中，摇动，释放琼脂糖珠(测序引物也可最后加入）;使用高纯水清 洗真空准备工具;将放有样品的PSQ96板放在加热板上加热到80°C 2min，再冷却到室溫，随 后放在巧roMark Q24焦憐酸测序仪上。
[0024] 焦憐酸测序：在PyroMark Q24焦憐酸测序仪上，采用Pyromark Gold Q24试剂盒 (Pyromark Gold Q24 Reagents; Qiagen; #978802)对PSQ96板中的样本进行测序，然后应 用巧roMark CpG软件对结果进行甲基化分析（甲基化水平检测结果示例见图2和图3)。
[0025] 6、焦憐酸测序结果计算 应用PyroMark CpG软件对结果进行甲基化分析。图巧日图3中所示百分数为对应NDRG4 基因 CpG位点的甲基化程度，图2所示癌组织中CpGl到CpG5的甲基化程度分别为38%，29%， 38%，36%和44%;图3所示癌旁组织中CpGl到CpG5的甲基化程度为13%，9%，17%，12%和19%。由 于5个CpG位点之间的甲基化率相关系数较高(相关系数均大于0.6，P值小于0.001)，发明人 取其均值代表整体甲基化水平进行后续分析。
[00%] 7、结果分析 本次实验采用SPSS 18.0对数据进行整理分析。发明人对3 '端CpG岛甲基化水平进行配 对t检验，发现:癌组织中NDRG4基因甲基化水平高于癌旁组织，且差异有统计学意义(P值小 于0.001，见图4)。为了定量地反映 NDRG4基因甲基化诊断胃癌风险的准确性大小，发明人进 一步分析了其受试者工作特征曲线(ROC曲线）。图5显示，焦憐酸测序检测NDRG4基因甲基化 诊断胃癌风险的ROC曲线下面积(AUC)为0.635，与0.5相比差异有统计学意义(P = 0.001)， 提示用焦憐酸测序该基因甲基化用于胃癌早期诊断的准确性较高。因此，可W找出最佳诊 断分界点用于实际诊断。一般可W将正确诊断指数最大的分界点确定为最佳诊断分界点， 即图5中最靠近坐标图左上方的点为敏感性和特异性均较高的临界值，该点对应的纵坐标 为敏感性，横坐标为（1-特异性）。因此，焦憐酸测序检测NDRG4基因甲基化用于诊断胃癌的 敏感性为39.1%，特异性为90.0%。
[0027] 发明人W癌组织甲基化率均数20%为临界值(此临界值与最佳诊断分界点相近）， 将甲基化水平分为高甲基化和低甲基化，发现:携带高甲基化NDRG4基因的人群患胃癌的危 险性为不携带高甲基化NDRG4基因的6.413倍(P = 5.08E-7，见表l)。
[0028] 表1 NDRG4基因 3'端CpG岛甲基化水平在癌组织与癌旁组织间的比较
注：P值小于0.05,具有统计学意义。
[00巧]表2中只对癌组织进行比较，发现NDRG4基因3 '端CpG岛甲基化差异与不同的危险 因素(性别、肿瘤部位、肿瘤大小、淋己结转移情况、TNM分期、吸烟饮酒史)无关(P值均大于 0.05)，但年龄小于50岁的胃癌患者NDRG4基因甲基化率(63.64%)要高于年龄大于50岁的胃 癌患者（24.68%)，且差异有统计学意义(P < 0.001);肿瘤分化程度低的患者NDRCM基因甲 基化率(47.62%)要高于分化程度高的患者(21.28%)，且差异有统计学意义(P = 0.004)。因 此，NDRG4基因3'端CpG岛高甲基化是胃癌发生的危险因素。
[0030]表2 NDRG4基因甲基化水平与胃癌患者临床特征的关系
注：P值小于0.05,具有统计学意义。
[0031] 本发明试剂盒利用焦憐酸测序法检测胃癌患者组织样本中NDRG4基因甲基化程 度，具有W下显著特点：（1)操作简便，周期短。该试剂盒可同时测定96个样本，大大缩短检 测时间，适合医院或研究所大规模推广应用。（2)稳定性。该试剂盒在-20°C溫度下可保存12 个月，其灵敏度和特异度都没有下降。本项目开发计划采用分析胃癌患者术后癌组织与癌 旁组织DNA中的NDRG4基因甲基化程度，结合现代的生物信息技术和统计学原理，提供操作 简便、灵敏度高、周期短、检测结果稳定可靠的甲基化定量检测方法，同时为患者的治疗随 访和预后评估提供科学依据。
[0032] 在本发明中，所述DNA样本可W来源于任何生物样品；更优选地，所述待测DNA选自 组织(包括石蜡包埋组织）、细胞、血液、血清、血浆、唾液、精液、尿液，粪便及其他分泌物。
[0033] 上述说明并非对本发明的限制，本发明也并不限于上述举例。本技术领域的普通 技术人员在本发明的实质范围内，作出的变化、改型、添加或替换，也应属于本发明的保护 范围，本发明的保护范围W权利要求书为准。
【主权项】
1. 一种用于检测与胃癌相关的NDRG4基因甲基化程度的试剂盒，其特征在于:包括一对 基因甲基化特异性扩增引物对及甲基化特异性测序引物，具体核苷酸序列如下： 上游引物：5'_ AGGGTTGGGGGITTTAGA-3' ； 下游引物：5 '-Biotin-CACCCTCTACCAAAAACTCAAAACTCAATT-3 ' ； 测序引物：5 ' -GGGGITTTAGAGTGTAT-3 '。2. 根据权利要求1所述的用于检测与胃癌相关的NDRG4基因甲基化程度的试剂盒，其特 征在于包括甲基化特异性PCR反应体系，其组成为:ZymoTaq PreMix 10.0 ul;浓度为5 μΜ 的上、下游引物各1.0 μ1;Η20 6.5 μL，甲基化修饰的DNA样本模板1.5 yl;PCR反应条件如 下：95°C预变性lOmin; 95°C变性3〇8,55.4°(：退火4〇8,72°(：延伸11^11，共45个循环的退火 反应;然后延伸反应72°C 7min。3. -种根据权利要求1所述的用于检测与胃癌相关的NDRG4基因甲基化程度的试剂盒 的用途，其特征在于:用于制备胃癌早期诊断和预后评估的试剂或试剂盒。
【文档编号】C12Q1/68GK106011263SQ201610496772
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2016年6月28日
【发明人】段世伟, 陈晓颖
【申请人】宁波大学