专利名称：一种水稻OsMYB基因的编码序列和应用的制作方法
技术领域：
本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体涉及一种在水稻中表达的转录因子基因的克隆，转基因载体的构建，以及基因的应用。
背景技术：
水稻是我国最重要的粮食作物，同时也是农业生产中用水最多的作物。干旱严重影响了水稻的产量，如何减少水稻对水的依赖，使其具有节水抗旱的特性，对我国的粮食、 水和生态安全具有重要意义。利用分子生物学和基因工程技术进行分子育种，将抗旱相关基因转入优良的水稻品种中，改良其抗旱性，培育既抗旱又高产优质的农作物新品种是抗旱育种的有效途径之一。本研究通过水稻基因芯片的方法筛选到了多个干旱诱导基因如 (fls#7i )，通过转基因技术调节这些基因的体内表达水平，可以改变水稻的抗旱能力。本申请中涉及的MYB转录因子是植物转录因子中最大的家族之一，以含有保守的 MYB结构域为共同特征，现在的研究证明，它广泛参加了植物次生代谢调控、细胞形态发生、 胁迫应答、分生组织形成及细胞周期控制等(乔孟等，2009; Xie et al.，2010)。MTO家族含有广3个由5广53个氨基酸组成的呈螺旋-转折-螺旋构象的不完全重复序列，根据结构域R (重复)数量分为3个亚族含有1个R结构域的Rl-MYB亚族，含两个R的R2R3-MYB 亚族和含3个R的R1R2R3-MYB亚族(Stracke et al.，2001)。植物中绝大多数MYB转录因子属于R2R3-MYB亚族，以N-端含有由两个MYB结构域构成的DNA结合功能域为共同特征 (Martin 禾口 Paz—Ares，1997)。植物中基因数目众多，近十年来人们对基因进行了大量而广泛的研究，在拟南芥、水稻、玉米和棉花中分别鉴定了 198、183、80和200个糾方基因，而在小麦中仅鉴定到23个糾方基因(Chen et al.，2005)，对其功能也有了深入的了解。大量研究结果表明 MYB基因参与植物生长过程中的多种生理生化反应，如调控次级新陈代谢植物，细胞形态发生，调控花和种子的形成，控制细胞循环等。此外，基因在抵御和应答逆境胁迫中也起着重要的作用，如水稻在胁迫信号转导网络中起重要的作用，过量表达的转基因拟南芥和番茄均表现强的抗低温及干旱作用(Vannini et al. ,2004; Candida et al. ,2007)； Abe等Q003)证明JiAT似参与干旱胁迫应答，Dai等Q007)发现AsMSI-J 过量表达能提高转基因拟南芥对低温、干旱、高盐等的抗性；Liang等000 发现AtMYB61参与调节气孔的开闭以减少水分散失。另有证据表明，保卫细胞中特异表达的基因参与了对干旱胁迫应答的负调控作用(Cominelli et al. 2005)。拟南芥的JiiffiG 和J转录因子，在逆境下表达增强，同时也增强了干旱应答基因《/」 J？和JMiffi/的表达。在干旱胁迫下，JiATG和JiAT似蛋白也作为ABA途径的转录激活子发挥功能(Abe et al.，2003)。
发明内容
本发明的目的在于提供一种受干旱诱导的转录因子凡其编码序列和含该核酸序列的载体及宿主。
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本发明的另一目的是提供编码水稻OsMYB蛋白的基因在提高植物抗逆性(包括但不限于抗旱、耐冷、抗盐等)中的应用。本发明的再一目的是提供编码水稻OsMYB蛋白的基因在调节植物抗逆性相关基因表达，增强水稻抗逆性的应用。为了实现以上目的，本发明的一方面提供了一个新的水稻转录因子的核苷酸顺序，它编码一个受干旱诱导的转录因子《sMS (0s05g044M00)，涉及调控其它基因的转录，主要表现是能够增加水稻的抗旱性。水稻AsMS (0s05g0442400)基因全长1198bp， 其OsMYB的开放阅读框为930bp，其中内含子(下划线标出)和cDNA编码区序列长 549bp (黑体标注)，如SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示，本基因编码182个氨基酸，如SEQ ID NO. 3 所示。本发明还提供了用于从水稻mRNA中通过反转录PCR克隆此转录因子OsMYB的引物序列，该扩增水稻OsMYB基因的引物为(SEQ ID NO. 4)
BamHI0s05g0442400(c)-Fl :CGCGGATCCATGGCGTTCTACCTCGGCAGCA SacI0s05g0442400(c) -R CGAGCTCTCATGGGGCAGTGATGTCGTG 前述的水稻OsMYB蛋白，其结构中含有2个SANT区域。本发明还提供含有上述水稻OsMYB基因的载体。本发明还提供含有上述水稻基因载体的宿主。优选地，所述宿主为真核细胞。更优选地，所述宿主为水稻。本发明还提供含有上述水稻OsMYB基因的转化植物细胞。本发明还提供上述水稻基因在提高植物抗逆性(包括但不限于抗旱、耐冷、 抗盐等)中的应用。本发明进一步提供上述水稻基因在调节植物抗逆相关基因表达，增强植物抗逆性中的应用。本发明还提供一种利用转基因技术将编码水稻转录因子的核苷酸序列转化到水稻中，以改变水稻抗旱性的能力的方法，具体步骤如下
(1)将水稻基因的编码区连接于植物表达载体，形成含有水稻基因的植物过表达载体。(2)将步骤1中的植物过表达载体转入农杆菌EHA105中，将含有表达载体的农杆菌侵染水稻愈伤，(在经过共培养、除菌、抗生素筛选和分化(大约4个月的时间)，获得水稻OsMYB基因的过表达的转基因植株。水稻中过表达OsMYB基因的转基因水稻能够提高水稻的抗旱能力。本发明还提供了一种用于检测转基因水稻中表达量的方法，主要利用荧光定量 PCR的方法。具体步骤为取转基因水稻的叶片，用TRIzoI法抽提水稻RNA，并用DNaseI消化DNA，然后反转录形成cDNA，以其为模板进行荧光定量PCR进行分析。荧光定量PCR引物核苷酸序列为(SEQ ID NO. 5)
qPCR-4424-F GGTCGGTGAAGACGCGGACTC qPCR-4424-R: TGTCGTGGATGCTCTTACGCTTG 。本发明还提供了一种在大肠杆菌表达系统中表达如前所述OsMTO蛋白质的方法，具体步骤如下把OsMYB基因(SEQ ID N0. 2)连接到pET3h载体中，转化到大肠杆菌BL21 (DE3) trxB—，于LB培养基中培养宿主菌(卡那霉素50mg/L)。37°C培养至0D600为0. 6 左右时加上0. ImM异丙基-D-硫代吡喃半乳糖苷进行诱导蛋白的表达，16°C诱导20小时。收集菌体，超声波破碎，离心收集上清，过镍柱分离纯化蛋白，最后SDS-PAGE分析蛋白的纯化情况。进一步，本发明中所述的水稻OsMYB蛋白，其为具有如SEQ ID NO. 3所示的氨基酸序列的多肽或其活性片段。本发明中，可选用本领域已知的各种载体，如市售的载体，包括质粒，粘粒等。在生产本发明的水稻OsMYB多肽时，可以将水稻OsMYB编码序列可操作地连接表达调控序列，从而形成水稻OsMYB蛋白表达载体。本发明中，可用荧光定量PCR技术分析水稻OsMYB基因的表达，即分析水稻OsMYB 的RNA转录物在细胞中的存在与否和表达量。本发明至少具有下列优点及有益效果
(1)本发明提供的水稻基因及其编码蛋白在植物抗逆性方面具有明显的作用， 能够明显降低在干旱土地上种植的各种农作物在生物产量上的损失，具有很大的应用价值。(2)利用转基因技术得到改良的含有本发明水稻基因的转化植物在干旱、 高盐等条件下，生长、生存状况明显优于野生型植物，表明了水稻基因能够明显提高植物的抗逆性。(3)本发明提供的水稻基因能够有效调节逆境相关的转录因子和蛋白，具有潜在的、巨大的应用价值。本发明中，术语“flsiifi 的开放阅读框”指编码完整的水稻OsMYB蛋白的核苷酸序列，如SEQ NO. 1中的核苷酸及其简并序列。该简并序列是指，位于SEQ ID NO. 2的核苷酸序列中，有一个或者多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与SEQ ID NO. 1的核苷酸序列的同源性低至约85%的简并序列也能编码出SEQ ID NO. 3所述的序列。该术语还包括在中度严谨条件下，更加的在高度严谨条件下与SEQ ID NO. 1中核苷酸序列的同源性至少85%，较佳的至少80%，更加的至少90%， 最佳的至少95的核苷酸序列。术语还包括能编码具有与天然水稻OsMYB基因相同功能的蛋白质的SEQ ID NO. 1 中开放阅读框序列的变异形式。这些变异形式包括(但不限于):若干个(通常为1-90个，最佳的1-10个)核苷酸的缺失、插入或取代，以及在5’和/或3’端添加数个(通常为60个以内，最佳的为5个以内)核苷酸。
图1干旱胁迫条件下水稻OsMYB的表达情况。图2水稻OsMYB的序列信息与同源性分析(AT 拟南芥；OS 水稻)。图3转基因植株的鉴定。其中，编号广6为不同的转基因水稻植株。图4不同处理(脱落酸、氯化钠、甘露醇)水稻苗期在培养基上的生长情况。图5水稻苗期干旱情况。图6水稻生殖期干旱花粉粒的育性分析。
图7 OsMYB过表达水稻中抗旱相关基因的表达谱。图8 OsMYB蛋白的原核表达分析。图9 OsMYB蛋白的瞬时表达定位。
具体实施例方式以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。以下实施例中未注明具体条件的实验方法，均按照常规条件，例如Sambrook等分子克隆实验室手册(New York :Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商建议的条件。实施例1干旱处理时水稻基因OsMYB在水稻品种日本晴的生殖发育期的芯片表达。1.胁迫处理
水稻日本晴种子催芽后，移栽到温室塑料盆的土中培养，在孕穗期(减数分裂时期)进行干旱处理。当盆中土层无水时开始断水，作为干旱处理的开始，待土壤水分降低到30%左右时，维持一个礼拜，取不同大小(2 3mm，3^4mm, 4^5mm, 5^7mm)的水稻花，分别收集并编号， 以正常生长条件下的水稻作为对照，做三次重复。2.基因芯片分析干旱条件下基因的表达
干旱条件下水稻基因表达分析由安捷伦公司代测。分析不同花发育时期基因在水稻品种日本晴的表达。结果显示OsMYB基因在干旱胁迫条件下上调，与用荧光定量PCR 验证芯片结果是一致的(图1所示)。
实施例2水稻OsMYB基因cDNA片段的克隆。1. RNA的提取取干旱处理的水稻花，在研钵中用液氮冷冻后研磨成粉状，加入盛有1 ml TRIZOL试剂(Promega)的EP管，充分振荡后，室温放置5分钟，于4°C，12000 rpm 离心IOmin后，上清液移至新的EP管中，加上200μ1氯仿混成乳状，室温静置5分钟，12000 rpm离心IOmin后，上清液移至新的EP管中，加入两倍体积异丙醇沉淀RNA，溶解后37°C用 DNaseI (Fermentas)消化降解残留DNA 1小时。然后在分光光度计上测定RNA含量。2.反转录按照TaKaRa公司的PrimeScript Reverse Transcriptase说明书进行操作离心管中加入水稻总 RNA 5 μ (5 μδ), Oligo (dT)17 Primer (50 Mmol/L) 1 μ ， dNTP (10 mmol/L) 1 μ ，并用双蒸水加至10 μ ；瞬时离心使液体集中于管底，65°C保温5 min，迅速在冰上冷却2 min以上。在上述混合物中加入5XPrimeScript Buffer 4 μ ， RNase 抑制剂(40 U/μΙ) 0. 5 μ , PrimeScript Reverse Transcriptase (200 U/μΙ) 0. 5 μ ，双蒸水加至20 μ ，离心使液体集中于管底，42°C保温1 h，70°C灭活15 min，冰上冷却， 得到水稻cDNA第一链。3. cDNA 的克隆
根据GenBank中水稻数据库信息中提供的序列信息，设计引物(SEQ ID N0. 4)，采用 RT-PCR方法进行cDNA全长克隆。通过RT-PCR得到一个包含有完整开放读框的编码区，长度为549bp ；回收，连接到pMD19-T载体上，并进行测序。测序结果在NCBI网站上进行BLAST分析，结果显示其与水稻注释基因0s05g0442400完全匹配。同时，其核苷酸序列与已知禾本科植物大麦的AK367954. 1有80%同源性，和玉米的基因L0C100285249有86%同源性，与高粱的基因 XM_002456635. 1有80%同源性。其结构中含有2个MYB结构域。实施例3水稻OsMYB的序列信息与同源性分析。本发明水稻AsMS全长编码区的长度为549bp，其序列如SEQ ID NO. 2所示。根据全长cDNA推导出水稻OsMYB的氨基酸序列，共182个氨基酸残基，分子量为20381. 5道尔顿，等电点(Pl)为7. 11，其序列如SEQ NO. 3所示。预测显示此蛋白为不稳定的疏水性蛋白。将此蛋白在GenBank进行BLAST比对，获得与此蛋白同源的蛋白，用Clustal X软件进行比对，然后用MEGA 4软件根据邻近法构建进化树(图2)。实施例4水稻OsMYB基因在水稻中过表达及转基因植株的鉴定 1.水稻基因的表达载体的构建
根据水稻基因的全长序列，设计扩增出完整编码阅读框的引物，并在上游和下游引物上分别引入限制性内切酶位点(这可视选用的载体而定)，以便构建表达载体。以实施例1中获得的扩增产物为模板，经PCR扩增后，将水稻基因的cDNA克隆至中间载体 (如PMD19-T简单载体，TAKARA)，进一步克隆到过表达载体(如pCAMBIA1301U)上，测序， 在保证阅读框架正确的前提下再将该过表达载体转入农杆菌中，并转化模式植物水稻日本晴。2.农杆菌介导法来进行水稻转基因。A.诱导愈伤组织
1)选取成熟饱满的种子，去掉内外颖，用纯净水洗3-4次，再用70%乙醇浸泡2min，用纯净水洗7-8次，用0. 1%的升汞处理15min，IOOrpm02)在超净台中弃去升汞，用无菌水洗数次，在无菌干净滤纸上吸干水分，置于N6D 培养基上，胚朝下或接触培养基，28°C，暗培养21天。12-15粒/组培瓶。B.继代培养
将愈伤周围的胚根、胚芽剥除干净，愈伤在干净滤纸上晾一下，转移至N6D继代培养基上，28 °C，暗培养7-10天。C.前培养
将继代的愈伤组织转移至前培养基上，28 0C，暗培养3-4天。D.农杆菌EHA105的培养
将上一部分实验中得到的正确克隆的农杆菌菌液涂布于YEB三抗平板(链霉素、利福平和卡那霉素抗性)上，28°C，暗培养约36小时。E.侵染与共培养
1)将前培养的愈伤在无菌滤纸上晾一下，并集中转移至平皿中。2)取灭菌小勺刮取农杆菌4-6勺于感染用的液体培养基中，搅拌至悬浮均勻(无大的菌块存在)。3)将愈伤转至离心管中，轻轻翻转混勻，静置15 20min，期间间隔5min混勻一次。4)将菌液倒出，愈伤置于无菌滤纸上吹干约1.5小时以上，保证菌液吸干，接至共培养培养基上，20 0C，暗培养2-3天。
F.除菌
1)将共培养的愈伤转移至50mL的离心管，用无菌水清洗3次以上，直至液体比较清亮。2)倒出无菌水，用含有500mg/L头孢霉素的N6D液体培养基清洗，每次lOOrpm， 15 20min，3 4 次。3)将愈伤倒在干净灭菌滤纸上，吸干吹干2小时以上，保证吸干。4)将干燥的愈伤转至除菌培养基上，28°C，暗培养，7 10天。G.筛选
将没有被农杆菌污染的愈伤转移至筛选培养基(N6D+50mg/L潮霉素B+250mg/L头孢霉素)上，28°C，暗培养。每15 20天可以更换一次培养基，筛选时间不得少于45天。H.分化
将经过筛选新长出来的愈伤转移至分化培养基(MS+2mg/L 6-BA+O. 2mg/L NAA+2mg/L KT+0. 2mg/L IAA+ 50mg/L潮霉素+250mg/L头孢霉素)28°C，16小时光培养。在进行分化培养前，可以先将愈伤暗培养几天以作为预分化。也需要定期的更换培养基。I.生根
将分化出来的转基因苗Olcm高)，剥除多余的愈伤组织，并剪去根(留约0. 5cm)，移至 1/2MS培养基中生根。28°C，16小时光培养。J.炼苗与移栽
生根结束后，可以除去生根培养基后，将苗泡于水中数日进行炼苗，然后移栽入土中生长。3.转基因植株的鉴定
剪取转基因水稻叶片，用CTAB法提取水稻叶片DNA，通过检测潮霉素基因的方法鉴定转基因情况(图3)。并用TRIZOL法抽取叶片RNA，反转录成cDNA (方法同实例2)，根据基因序列设计引物进行荧光定量PCR分析转基因水稻中OsMYB基因的表达情况，具体操作按照TAKARA公司试剂盒说明操作，荧光定量PCR仪为ABI Steponeplus .实施例5 OsMYB过表达转基因水稻植株的抗逆性鉴定
由于本基因是干旱诱导的，芯片分析表明，该基因在干旱条件下表达明显提高。因此对含水稻基因的过表达转基因水稻(日本晴)苗期和成株期水分胁迫实验，分析水稻基因OsMYB的抗逆(包括但不限于抗旱、抗盐等)作用。1苗期抗旱处理
把日本晴水稻种子和转基因水稻种子，剥去外壳后，用50%次氯酸钠溶液消毒20分钟后，播种在含有1/2MS以及分别含有ABA (4uM)、NaCl (150mM)、甘露醇(200mM)的1/2MS培养基中，这样水稻就一直会受到ABA、NaCl和甘露醇(作为干旱胁迫的模拟物)的胁迫，28°C 光照培养(16小时光照8小时黑暗)12天后，测定水稻的生长高度，以及在甘露醇中生长单个水稻的质量。水稻相对生长速率等于不同处理水稻的高度或长度/正常条件下生长水稻的高度或长度。结果显示，过表达基因的转基因水稻能够明显的增加在胁迫条件下的生长速率，特别是根的延长速率要明显的高于对照(图4)。把发芽好的水稻(日本晴和转基因水稻)每个盆中(黑土 蛭石=7:3)种植5-6棵的对照和转基因水稻，待水稻长到5叶期时在水稻大棚中让其水分自然蒸发进行干旱处理，大约干旱8天后，转基因水稻的叶片的存活程度明显较高。复水后3天，转基因水稻变绿存活率也明显比对照高。蒽酮法测定可溶性糖和酸性茚三酮法测定脯氨酸表明，在干旱条件下，转基因的水稻积累大量的可溶性糖和脯氨酸，表现出较强的抗旱性(图5)。2开花期抗旱处理
成株期水稻实行水分自然蒸发干旱法。水稻种植在含水稻土的方形盆中，待水分挥发至30%左右，保持3天，测定剑叶的脯氨酸含量，并用I2-KI进行染色观察水稻花粉的活性 取刚开颖但花药还未开裂的花并采集水稻成熟花药，将花药于载玻片上，加1滴蒸馏水，用镊子将花药捣碎，使花粉粒释放。晾干，大约IOmin ；加1 2滴I2-KI溶液，盖上盖玻片， 5min ；在显微镜下观察，观察2 3张片子，每片取3_5个视野，统计花粉的染色率，其中深蓝色的花粉为可育花粉，紫红或者黄色的为不育花粉，花粉育性等于可育花粉数/(可育加上不育花粉数)。结果显示，转基因的水稻花粉粒的育性在干旱条件下要明显高于对照组的水稻(图6)。实施例6应用荧光定量PCR方法检测转OsMYB基因水稻中抗逆基因表达的变化提取转OsMYB基因水稻叶片的RNA，反转录成cDNA，然后利用TAKARA公司的荧光定量
PCR kit进行荧光定量分析(具体操作参照相关公司的说明书)。然后根据-AACT分析基因的表达情况。具体分析的基因为现有报道的与抗旱相关的基因，分别为Zi^、ftffiS、/^G、 DR22等。结果显示(图7)此基因的过表达能够明显的增加Zi^和历？忽的表达，同时也说明此基因的抗旱性可能是通过转录调控抗旱相关基因来达到抗旱的目的。
基因名称基因号MYB0s05g0442400DR220s01g0733500DREBAY064403. 1LEA0s05g0542500 实施例7利用原核表达的方式表达OsMYB蛋白
把OsMYB基因连接到pET32a载体中，转化到大肠杆菌BL21 (DE3) trxB_，于LB培养基中培养宿主菌(卡那霉素50mg/L)。37°C培养至0D600为0.6左右时加上0. ImM异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷进行诱导蛋白的表达，16°C 20小时。收集菌体，超声波破碎， 离心收集上清，过镍柱分离纯化蛋白，最后SDS-PAGE分析蛋白的纯化情况。电泳结果显示 (图8)我们分离到了原核表达的OsMYB蛋白。实施例8烟草中分析水稻OsMYB基因的瞬时表达
把flslfi 基因连接到瞬时表达pEYFP载体上，转化农杆菌，用微型注射器沿着烟草叶脉把含有瞬时表达质粒的农杆菌注射到烟草叶片中，培养3天后，撕取注射位置的叶片在荧光显微镜下观察并拍照片，结果显示(图9)此蛋白定位在细胞核内，为细胞核蛋白。
权利要求
1.一种分离出的水稻《sMS基因，其特征在于为一种特定序列的DNA分子，长1198bp， 核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.一种如权利说明要求1所述的水稻基因的蛋白质分子，其特征在于氨基酸编码序列如SEQ ID NO. 3所示。
3.一种将权利要求1所述的水稻OsMYB基因的转化到水稻中，并改变水稻抗旱性的方法，其特征在于具体步骤如下(1)将编码具有水稻基因的开放阅读框可操作的连接入植物表达载体；(2 )将步骤(1)中的植物过表达载体转入农杆菌中，将含有表达载体的农杆菌侵染水稻愈伤，经过共培养、除菌、抗生素筛选和分化，获得水稻基因的过表达的转基因植株。
4.一种用于体外检测OsMYB基因在植物中表达量的方法，主要利用荧光定量PCR的方法，其特征在于具体步骤为取转基因水稻的叶片，用TRIzoI法抽提水稻RNA，并用DNaseI 消化DNA，然后反转录形成cDNA，以其为模板进行荧光定量PCR进行分析；荧光定量PCR弓丨物序列为SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列。
5.一种在大肠杆菌表达系统中表达如权利要求2所述OsMTO蛋白质的方法，其特征在于具体步骤如下把SEQ ID NO. 1的OsMYB基因连接到pET3h载体中，转化到大肠杆菌 BL21 (DE3) trxB",于LB培养基中培养宿主菌，37°C培养至0D600为0. 6左右时加上0. ImM异丙基- β -D-硫代吡喃半乳糖苷进行诱导蛋白的表达，16°C诱导20小时；收集菌体，超声波破碎，离心收集上清，过镍柱分离纯化蛋白，最后SDS-PAGE分析蛋白的纯化情况。
全文摘要
本发明属于分子生物学、基因工程技术领域，具体为一种在水稻中表达的转录因子OsMYB的编码序列，其主要作用是能够增强水稻抗性(包括但不限于抗旱、低温和耐高盐胁迫)，同时受干旱诱导表达。本发明还包含此基因序列的重组载体，及应用此载体转化的转基因植物。应用本发明所涉及的基因在植物中转化表达，可对提高转基因水稻的抗性。本发明提供的基因在植物抗逆性方面具有明显的作用，具有很高的应用价值，能够明显减少农作物在干旱、半干旱或者高盐、低温等条件下产量和生物产量的损失。
文档编号C12R1/19GK102329805SQ201110292959
公开日2012年1月25日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者葛晓春, 郭长奎, 马红 申请人:复旦大学