专利名称：五加生化中药复方提取物的植物雌激素样作用及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种中药复方提取物，具体是涉及一种采用二氧化碳超临界萃取技术和大孔吸附树脂富集技术，以当归、川芎、桃仁、干姜(炮)、甘草和刺五加为原料制得的提取物，该提取物具有明显的植物雌激素样作用，适用于改善妇女围绝经期综合症。本发明还涉及了该提取物在制备治疗围绝经期综合症药物制剂和保健食品中的应用。
背景技术：
随着社会人口老龄化程度的日益提高，老年人的生活质量已受到社会的广泛重视，女性的平均寿命逐年上升，意味着她们将有至少三分之一的时间在围绝经期及绝经后渡过。围绝经期是指从接近绝经(menopause)出现与绝经有关的内分泌、生物学和临床特征起至绝经一年内的期间。围绝经期综合症是指在围绝经期出现雌激素减少为主的神经内分泌、心理和代谢变化所致的各器官的症状和体征的症候群，主要症状月经紊乱、血管舒缩症状(潮红、潮热)、精神神经紊乱(抑郁、忧虑、易激动和失眠)、心脑血管症状(高血压、高血脂、心悸、动脉粥样硬化、冠心病、老年痴呆症等)、骨及关节症状(骨质疏松、关节痛等)、泌尿生殖道症状等。这些疾病严重影响了中老年女性的生活质量。补充雌激素能够明显改善上述症状。化学合成雌激素在防预绝经女性诸多不良症状方面，发挥极为重要的作用。然而，由于雌激素的长期单一使用增加卵巢癌、乳腺癌、子宫内膜癌的患病率及其它不良反应，从而限制了其应用。因此，雌激素替代疗法(选择性雌激素受体调节剂)用于防治这些疾病受到重视。植物雌激素是存在于植物中的选择性雌激素受体调节剂，能结合并激活哺乳类动物及人类的雌激素受体，从而发挥雌激素样或抗雌激素样作用，即机体雌激素水平低时表现为雌激素样作用，反之表现为抗雌激素样作用，因此具有一定的安全性。鉴于化学合成激素疗法的潜在的危险性，寻找安全、有效、可供长期使用的效能高天然植物雌激素药物尤为重要，也是药学工作者最新研究热点之一。“生化汤”出自《傅青主女科》，由当归、川芍、桃仁、炙甘草和炮姜五种中药组成。本发明提取物的组方是在生化汤的基础上增加了固本强壮药刺五加，故称为五加生化方，提取物称为五加生化提取物。CN 1415363A中提及的五加生化药与本发明的组方相似，但制备工艺不同，而且，在其提及的功能与主治中并没有植物雌激素样作用，也没有治疗妇女围绝经期综合症的作用。本发明首次发现五加生化方具有植物雌激素样作用。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种具有植物雌激素样作用的中药复方提取物。该中药复方提取物是一种选择性雌激素受体调节剂。本发明另一个目的是提出该中药复方提取物在制备治疗雌激素缺乏引起的围绝经期综合症的药物制剂和保健食品中的应用。
为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案组方药材及比例为当归5份、川弯3份、桃仁2份、干姜(炮)1份、甘草1份、刺五加100份。按照当归5份、川芎3份、桃仁2份、干姜(炮)1份、甘草1份，称取各药材适量，混合粉碎，过药典2号筛，药粉装入二氧化碳超临界萃取装置中，加入夹带剂无水乙醇，用量为0. 5ml/g药粉，设定萃取温度为45°C，萃取压力为40MPa，解析I压力为lOMPa、温度为40°C，解析II压力为4MPa、温度为25°C，萃取时间为池，得棕黄色粘稠油状物。另取刺五加粗粉100份，与上一步二氧化碳超临界萃取后的药渣混合，加入10倍量70%乙醇浸泡12小时，加热回流提取2小时，过滤，向药渣中再加入5倍量70%乙醇加热回流提取2小时，过滤，合并滤液，减压干燥得浸膏。将浸膏加适量水稀释后与等体积的D-101型大孔吸附树脂混合拌勻，上样于D-101型大孔吸附树脂柱中(上样量以生药量与树脂量之比计算为1:2)，静态吸附30分钟，然后依次用10个柱体积的水、10个柱体积的20%乙醇和10个柱体积的50%乙醇进行洗脱，收集50%乙醇洗脱液，减压干燥后粉碎，制得棕色粉末。将此粉末与二氧化碳超临界萃取制得的棕黄色粘稠油状物混合，即得本发明的中药复方提取物。作为对上述技术方案的改进和补充1、组方中药材的相对量可以按照当归4-6份、川芎2-4份、桃仁1_3份、干姜(炮)1-2份、甘草1-2份，刺五加50-150份的比例进行调整。2、在进行二氧化碳超临界萃取时，萃取温度可以设定为30-60°C。3、在进行二氧化碳超临界萃取时，萃取压力可以设定为20_60MPa。4、在进行二氧化碳超临界萃取时，萃取时间可以设定为Ih或以上。5、在进行二氧化碳超临界萃取时，夹带剂可以为乙醇或浓度为95%以上的乙醇，并且用量可以设定为0. 1-lml/g药粉。6、在用旋转蒸发仪对二氧化碳超临界萃取液进行减压浓缩回收乙醇时，温度可以设定为45°C或以下。7、在对刺五加粗粉和二氧化碳超临界萃取后的药渣进行提取时，提取溶剂可以是30% -100% 乙醇。8、在对刺五加粗粉和二氧化碳超临界萃取后的药渣进行提取时，提取方式可以是加热回流提取、超声提取或者渗漉提取。9、在对乙醇提取浸膏进行大孔吸附树脂富集时，使用的柱脂可以是D-101型或者AB-8型，以及其他非极性、弱极性或者中等极性大孔吸附树脂。10、在对乙醇提取浸膏进行大孔吸附树脂富集时，洗脱溶剂可以是水或不同浓度的乙醇，依照乙醇浓度由低到高依次洗脱。通过上述技术方案制备得到的提取物，具有明显的植物雌激素样作用，可以用于制备治疗雌激素缺乏引起的围绝经期综合症的药物制剂和保健食品。当将上述提取物混合进具有治疗雌激素缺乏引起的围绝经期综合症作用的药物制剂和保健食品时，除这些提取物外，在不防碍本发明效果的范围内，可以根据需要适当混合用于通常的药物制剂和保健食品的其他成分中，例如交联聚乙烯吡咯烷酮、羧甲淀粉钠、微晶纤维素、乳糖、阿司巴坦、硬脂酸镁等内加辅料、外加辅料和包衣辅料。其型剂可以是任何一种药学上所说的剂型，优选丸剂、片剂、胶囊剂或口服液。
随后的药效实验将证明，本发明中药复方提取物可替代雌激素治疗雌激素缺乏引起的围绝经期综合症。本发明中药复方提取物是药食兼用的纯天然的植物提取物，具有植物雌激素的选择性雌激素受体调节剂作用，对雌激素具有双向调节作用，不同于化学合成的雌激素药物，没有增加乳腺癌、子宫癌的副作用。
图1是小鼠动情间期阴道细胞涂片显微镜下观察的形态2是小鼠动情前期阴道细胞涂片显微镜下观察的形态3是小鼠动情期阴道细胞涂片显微镜下观察的形态4是小鼠动情后期阴道细胞涂片显微镜下观察的形态5是去卵巢(OVX)组小鼠子宫病理切片HE染色后显微镜下观察的形态结构6是去卵巢(OVX)后给予TQW组小鼠子宫病理切片HE染色后显微镜下观察的形态结构图
图7是假手术(Sham)组小鼠子宫病理切片HE染色后显微镜下观察的形态结构8是去卵巢(OVX)后给予尼尔雌醇组小鼠子宫病理切片HE染色后显微镜下观察的形态结构图
图9是去卵巢(OVX)组小鼠子宫病理切片ER免疫组织化学染色后显微镜下观察的形态结构图
图10是去卵巢(OVX)后给予TQW组小鼠子宫病理切片ER免疫组织化学染色后显微镜下观察的形态结构图
图11是假手术(Sham)组小鼠子宫病理切片ER免疫组织化学染色后显微镜下观察的形态结构图
图12是去卵巢(OVX)后给予尼尔雌醇组小鼠子宫病理切片ER免疫组织化学染色后显微镜下观察的形态结构图
图13是空白衰老大鼠组子宫病理切片HE染色后显微镜下观察的形态结构14是予TQW衰老大鼠给组子宫病理切片HE染色后显微镜下观察的形态结构15是给予雌二醇衰老大鼠组子宫病理切片HE染色后显微镜下观察的形态结构16是空白衰老大鼠组阴道病理切片HE染色后显微镜下观察的形态结构17是予TQW衰老大鼠给组阴道病理切片HE染色后显微镜下观察的形态结构18是给予雌二醇衰老大鼠组阴道病理切片HE染色后显微镜下观察的形态结构19是空白衰老大鼠组乳腺病理切片HE染色后显微镜下观察的形态结构20是予TQW衰老大鼠给组乳腺病理切片HE染色后显微镜下观察的形态结构21是给予雌二醇衰老大鼠组乳腺病理切片HE染色后显微镜下观察的形态结构22是空白组、TQW组和雌二醇组衰老大鼠乳腺增殖细胞核抗原(PCNA)表达的Western blot实验结果图
具体实施例方式下面结合具体实施例和附图，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于说明本发明而不用于限制本发明的保护范围。在阅读了本发明记载的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等效变化和修饰同样落入本发明权利要求书所限定的范围。为说明方便，以下将本发明提取物简称为TQW。实施例1 (TQW的体内雌激素样作用研究)TQW雌激素样作用体内实验研究采用研究雌激素作用国际公认的三种经典动物模型未成熟小鼠、去卵巢小鼠、衰老大鼠模型分别模拟女性一生雌激素低下的三个生理阶段。一、TQff对未成熟小鼠靶器官的影响未成熟小鼠选择出生21天即刚断奶小鼠，此时小鼠还未达到性成熟和体成熟，具有雌激素样作用的药物可以促进其生殖系统发育成熟。1材料与方法1. 1 材料KM种小鼠，早，21日龄，购自黑龙江中医药大学GLP中心。TQff混悬液将TQW混悬蒸馏水中，ig剂量为15mg/kg。尼尔雌醇混悬液(Nilestrdiol)尼尔雌醇(购自上海医药集团华联制药厂，国药准字H3102164)，混悬蒸馏水中，ig 0. 5mg/kg。1. 2 方法1. 2. ITQW对未成熟小鼠靶器官的雌激素样作用1. 2. 1. 1对未成熟小鼠动情周期(阴道上皮细胞)的影响取小鼠先做阴道涂片，每日1次，选取连续5日出现间情期的小鼠，随机分成3组，每组10只，分别为空白对照组灌胃蒸馏水；TQW混悬液组灌胃TQW混悬液(15mg/kg)；阳性对照组灌胃尼尔雌醇(0.5mg/kg)。每日1次，连续给药5天，于给药后第2，3，4，5天晚上及最后一次给药后24h各做一次阴道涂片。计算用药后出现动情小鼠的只数及所占百分比，与空白对照组比较。1. 2. 1. 2对未成熟小鼠子宫重量和摄水率的影响取上述做阴道上皮角化试验小鼠于最后一次做完阴道涂片后，脱颈椎处死，剖开腹腔，以剪刀摘取子宫及阴道，放于滤纸上，除去脂肪组织、卵巢及阴道，迅速称其湿重，计算子宫重量百分率。然后将子宫放入100°C烘箱中烘干Mh，再次称重。比较各实验组与空白对照组子宫重量百分率的差异和水摄取增加百分率的差异脏器重量百分率=脏器湿重/每IOOg体重X 100%水摄取增加百分率=(子宫湿重-子宫干重)/子宫湿重X 100%2 结果2. 1对未成熟小鼠动情周期的影响实验结果见表1。本实验选择出生21日龄(即刚断奶)小鼠，未达到性成熟和体成熟，此阶段小鼠处于间情期，具有雌激素样作用的物质可促进其提前进入动情期。小鼠动情周期阴道涂片细胞学变化特征(见说明书附图1-4)动情间期，镜下见大量的多核白细胞，少量上皮细胞。动情前期，大量上皮细胞，少量角化上皮细胞(无核)，无白细胞。动情期，大量角化上皮细胞，形状大而不规则，尚有少量上皮细胞。动情后期，大量白细胞，尚有融合的角化上皮细胞。未成熟小鼠给予TQW 15mg/kg后100%提前进入动情期，与经典的阳性对照药相似，然而空白对照组仅有一只进入动情期，因此推测TQW具有雌激素样活性。
表ITQW对未成年小鼠动情周期的影响
权利要求
1.一种具有植物雌激素样作用的中药复方提取物，其提取方法如下以重量份计，按照当归4-6份、川芎2-4份、桃仁1-3份、干姜(炮)1-2份、甘草1_2份，称取各药材适量，混合粉碎，过药典2号筛，药粉进行二氧化碳超临界萃取，以乙醇为夹带剂，在一定的工艺参数下萃取得棕黄色液体，减压浓缩回收乙醇，最终得棕黄色粘稠油状物；再称取刺五加50-150份，粗粉，与上一步二氧化碳超临界萃取后的药渣混合，用适当浓度乙醇浸泡后提取，提取液干燥得浸膏，浸膏利用大孔吸附树脂柱进行富集，在一定的工艺参数下制得棕色粉末；将此粉末与二氧化碳超临界萃取制得的棕黄色粘稠油状物混合，即得本发明的中药复方提取物。
2.根据权利要求1所述的中药复方提取物，其特征在于以重量份计，其中当归5份、川芎3份、桃仁2份、干姜(炮)1份、甘草1份，刺五加100份。
3.根据权利要求1所述的中药复方提取物，其特征在于在对当归、川芎、桃仁、干姜(炮)和甘草药粉进行二氧化碳超临界萃取时，萃取温度为30-60°C，萃取压力为20-60MPa，萃取时间为Ih或以上，夹带剂无水乙醇用量为0. 1-lml/g药粉，解析压力为20MI^或以下，解析温度为40°C或以下。
4.根据权利要求1所述的中药复方提取物，其特征在于在对二氧化碳超临界萃取液减压浓缩回收乙醇时，须在旋转蒸发仪等减压浓缩设备中进行，温度为45°C或以下。
5.根据权利要求1所述的中药复方提取物，其特征在于在对刺五加粗粉和二氧化碳超临界萃取后的药渣进行提取时，提取溶剂为30% -100%乙醇，第一次用量为10倍量，浸泡12小时，加热回流提取或者超声提取或者渗漉提取2小时，过滤，向药渣中再加入5倍量30% -100%乙醇，再提取2小时，过滤，合并滤液，减压干燥得浸膏。
6.根据权利要求1所述的中药复方提取物，其特征在于在对乙醇提取浸膏进行大孔吸附树脂富集时，将浸膏加适量水稀释后与等体积的D-101型大孔吸附树脂混合拌勻，上样于D-101型或者AB-8型，以及其他非极性、弱极性或者中等极性大孔吸附树脂柱中，上样量以生药量与树脂量之比计算为1 2，静态吸附30分钟，然后依次用10个柱体积的不同浓度的乙醇进行洗脱，收集20% -50%乙醇洗脱液，减压干燥后粉碎，制得棕色粉末。
7.根据权利要求3所述的中药复方提取物，其特征在于在进行二氧化碳超临界萃取时，萃取温度为30-60°C。
8.根据权利要求3所述的中药复方提取物，其特征在于在进行二氧化碳超临界萃取时，萃取压力为20-60MPa。
9.根据权利要求3所述的中药复方提取物，其特征在于在进行二氧化碳超临界萃取时，萃取时间为Ih或以上。
10.根据权利要求3所述的中药复方提取物，其特征在于在进行二氧化碳超临界萃取时，夹带剂为无水乙醇或浓度为95%以上的乙醇，并且用量为0. 1-lml/g药粉。
11.根据权利要求3所述的中药复方提取物，其特征在于在进行二氧化碳超临界萃取时，萃取温度为45°C，萃取压力为40MPa，萃取时间为池，夹带剂无水乙醇用量为0. 5ml/g药粉，解析I压力为lOMPa、温度为40°C，解析II压力为4MPa、温度为25°C。
12.根据权利要求5所述的中药复方提取物，其特征在于对刺五加粗粉和二氧化碳超临界萃取后的药渣进行提取时，提取溶剂为30% -100%乙醇。
13.根据权利要求5所述的中药复方提取物，其特征在于对刺五加粗粉和二氧化碳超临界萃取后的药渣进行提取时，提取方式为加热回流提取、超声提取或者渗漉提取。
14.根据权利要求5所述的中药复方提取物，其特征在于对刺五加粗粉和二氧化碳超临界萃取后的药渣进行提取时，加入10倍量70%乙醇浸泡12小时，加热回流提取2小时，过滤，向药渣中再加入5倍量70%乙醇加热回流提取2小时，过滤，合并滤液，减压干燥得浸膏。
15.根据权利要求6所述的中药复方提取物，其特征在于对乙醇提取浸膏进行大孔吸附树脂富集时，使用的柱脂为D-101型或者AB-8型，以及其他非极性、弱极性或者中等极性大孔吸附树脂。
16.根据权利要求6所述的中药复方提取物，其特征在于对乙醇提取浸膏进行大孔吸附树脂富集时，洗脱溶剂为水或不同浓度的乙醇，依照乙醇浓度由低到高依次洗脱。
17.根据权利要求6所述的中药复方提取物，其特征在于对乙醇提取浸膏进行大孔吸附树脂富集时，将浸膏加适量水稀释后与等体积的D-101型大孔吸附树脂混合拌勻，上样于D-101型大孔吸附树脂柱中(上样量以生药量与树脂量之比计算为1 2)，静态吸附30分钟，然后依次用10个柱体积的水、10个柱体积的20%乙醇和10个柱体积的50%乙醇进行洗脱，收集50%乙醇洗脱液，减压干燥后粉碎，制得棕色粉末。
18.权利要求1-17中任何一项所述的中药复方提取物在治疗围绝经期综合症的药物制剂及保健食品中应用。
全文摘要
本发明涉及一种具有植物雌激素样作用的中药复方提取物。本发明中的中药复方提取物是以刺五加、当归、川芎、桃仁、干姜(炮)和甘草等六种中药为原料，采用二氧化碳超临界萃取技术和大孔吸附树脂富集技术，在一定的工艺参数下提取制得提取物。该提取物具有明显的植物雌激素样作用，可双向调节机体的雌激素水平，延缓更年期的到来，适用于改善妇女围绝经期综合症，如月经紊乱、血管舒缩症状(潮红、潮热)、精神神经紊乱(抑郁、忧虑、易激动和失眠)、骨及关节症状(骨质疏松、关节痛等)、泌尿生殖道症状等诸病。该提取物可以直接安全地应用于治疗围绝经期综合症的药物制剂和保健食品的制备。
文档编号A23L1/29GK102366621SQ20111029139
公开日2012年3月7日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者刘卫东, 王发善, 褚弘斌, 蹇小兵, 陈冬蕾, 陈玉忠, 韩振远 申请人:多多药业有限公司