专利名称：一种特异性识别鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子的筛选及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及利用SELEX技术(指数富集的配体系统进化技木)筛选获得一种与鼠伤寒沙门氏菌高亲和力、高特异性识别的寡核苷酸适配子，以及该寡核苷酸适配子在鉴别沙门氏菌中的应用，属生物技术领域。
背景技术：
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella Typhimurium),属肠杆菌科,革兰氏阴性肠道杆菌。沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一。在我国内陆地区，由沙门氏菌引起的食物中毒屡居首位。据资料统计，在我国细菌性食物中毒中，70%-80%是由沙门氏菌引起，世界各地的食物中毒中，英国、中国沙门氏菌食物中毒居首位。目前，在全球范围内，特别是发展中国家感染沙门氏菌的人数逐年增多，食源性致病菌的耐药性对食品安全及人类健康的影响已经引起很多国家的 警惕。因此建立准确、灵敏、快速的沙门氏菌检测技术对于食品安全具有重要意义。传统的微生物检验，往往既耗时又不灵敏；新发展起来的PCR技木，虽然能缩短检验时间，但灵敏度仍然不高；免疫学方法具有特异性强、灵敏度高、易于观察等优点，但制备抗体的时间比较长，成本高，且不稳定。近些年来，由于寡核苷酸适配子(aptamer)较之抗体有诸多优点成本低，稳定性好，易于修饰等等，因此被作为抗体分子的前景性替代分子，受到很多领域的关注。SELEX是ー种随机生物文库技术，它利用大容量的随机寡核苷酸库(由两端的固定序列和中间20 40个碱基的随机序列组成)与靶分子相互作用，从中筛选出与靶分子特异结合的寡核苷酸，并结合PCR体外扩增技木，使其得到指数级富集，如此循环数轮，最終进化成为高亲和力、高特异性的寡核苷酸配体。适配子与靶物质结合的特异性和亲和カ可与抗体媲美，甚至优于抗体，加上其技术上和稳定性方面的优势，近10多年来，采用SELEX技术筛选核酸适配子不断被应用于生命科学各个领域的研究工作中，包括对疾病的诊断与治疗。本发明以常见的鼠伤寒沙门氏菌为目的靶细菌，利用SELEX技术获得了一条能与鼠伤寒沙门氏菌高亲和力，高特异性结合的寡核苷酸适配子，能够快速、灵敏、特异的检测到鼠伤寒沙门氏菌。
发明内容
本发明目的在于提出特异识别鼠伤寒沙门氏菌的一条寡核苷酸适配子的序列以及应用。本发明优点I)与蛋白类抗体相比，aptamer合成周期短,成本低；aptamer更稳定；aptamer可直接体外合成、易于标记，使得操作更为简单迅速。2)该序列是从9条均能识别鼠伤寒沙门氏菌的aptamer中，选出的亲和カ最强,特异性最好的一条aptamer,能高亲和カ高特异性识别鼠伤寒沙门氏菌。
图1S1-S9 ニ级结构图2S1-S9解离常数图3S2的特异性分析图
具体实施例方式下面是通过SELEX技术筛选特异性结合鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子的方法以及快速检出鼠伤寒沙门氏菌的应用。1、合成随机单链DNA文库和引物(IDT公司合成)随机ssDNA文库5，-ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-N40-TATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT-3，构建了长度为87nt的随机ssDNA文库，两端为固定引物序列，中间为40个碱基的随机序列，库容量在IO14以上；引物1:5’ -ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-3’ ；引物I1:5’ -ATTAGTCAAGAGGTAGACGCACATA-3’，将随机ssDNA文库和引物用TE缓冲液配制成100 u mo I/L贮存液_20°C保存备用。2、BBL液体培养基培养鼠伤寒沙门氏菌，37 °C摇床培养至对数生长期(0D_=0. 3)，收集菌液1800g 4 °C离心5min，弃上清，用I X结合缓冲液(I XBB) (50mMTris-HCKpH 7. 4), 5mM KCl, IOOmM NaCl, ImM MgCl2)清洗，去除多余的培养基成分。
3、SELEX筛选获得鼠伤寒沙门氏菌特异的寡核苷酸适配子I)将ssDNA文库进行PCR扩增，扩增体系为St印I ssDNA 5^1し引物1、11各 5 ii L，含 Mg2+的 dNTP 5iiL，Taq 酶 0.5 iiL，10XPCR buffer 5yL，用无菌超纯水补足 50 ii し① 94 0C 5min,② 94 °C 45s,③ 50 °C 45s,④ 72 °C Imin,⑤ go to ②，2times,⑥72 °C 5min⑦end。所得PCR产物作为st印2模板，st印2 :模板I y L，引物1、II各 I U L，含 Mg2+ 的 dNTPl u L, Taq 酶 0. 5 ii L，10XPCR buffer 5 ii L，用无菌超纯水补足 50iiL。① 94°C 5min，② 94°C 45s，③ 50°C 45s，④ 72°C lmin，⑤ go to ②，30times，⑥72°C 5min⑦end。所得产物即作为第一轮筛选的文库。在与菌种孵育之前，需将文库于94°C热变性8min，立即冰浴lOmin。第一轮筛选的投入量为2nM，第二轮至最后为lOOpmol。2)将 ssDNA 文库，I X IO8 细菌，tRNA 和 BSA，共 600 y L 室温孵育 45min，使 ssDNA文库与细菌充分結合。3)5000g 4°C离心5min弃上清，用IXBB清洗3次，分离并去除未与细菌结合的ssDNAo4)将沉淀(即结合了 ssDNA的细菌)溶于100 y L I XPCR缓冲液中，94°C热变性8min,立即冰浴IOmin,将结合上的ssDNA从细菌上解离下来。5)5000g 4°C离心5min取上清，此为第一轮与细菌结合的ssDNA，将其作为模板进行PCR扩增，扩增产物用作第二轮的筛选。扩增体系为st印 I ssDNA2 U L,引物 115 ii L，含 Mg2+ 的 dNTP I U L, Taq 酶
0.5u L, 10XPCR buffer 5 y L，用无菌超纯水补足 50 y し① 94 °C 5min，② 94 °C 45s，③ 55で 45s，④ 72で 45s，⑤ go to ②，2times，⑥ 72で Imin ⑦ 12で 2min ⑧ end。所得 PCR产物作为 Round2 模板，step 2 :模板 I U L，引物1、II 各 I ii L，含 Mg2+ 的 dNTP I U L，Taq
酶 0.L，IOXPCR buffer 5 y L，用无菌超纯水补足 50 y し① 94°C 5min，② 94°C 45s，③ 55°C 45s，④ 72°C 45s，⑤ go to ②，30times，⑥ 72°C lmin ⑦ 12°C 2min ⑧ end。6)重复筛选重复上述筛选过程，共进行9轮筛选。7)富集寡核苷酸适配子文库的测序结果与分析a.将最后的富集文库扩增为双链，连接pUC19-T载体，转化E. coli DH5 a，从90个克隆中随机挑取30个阳性克隆进行DNA序列测定(分别命名为ST1-ST30)。b.采用DNAMAN软件对30条序列进行同源性分析，RNAstructure软件对30条序列进行高级结构分析。c.结合软件分析结果，平均在每个家族选出1-2条结构稳定，能级较低的序列为代表，共9条序列，进行亲和力和特异性鉴定。4、利用流式细胞仪对11条序列进行亲和カ鉴定I)将上述9条序列及原库对照送至上海生物工程有限公司合成并在5’标记FAM。FAM-STl 5， -ataggagtcacgacgaccagaa TAGAGATATGACAGCGGGGAAGGTTAAGAGGCGCTAGGAG tatgtgcgt ctacctcttgactaat-3’FAM-ST2 5’ -ataggagtcacgacgaccagaa AGTAATGCCCGGTAGTTATTCAAAGATGAGTAGGAAAAGA tatgtgcgtctacctcttgactaat-3JFAM-ST3 5， -ataggagtcacgacgaccagaa TTTCGGCTAAGGACGGGTGAAATACATTTAATAGGGTGGA tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’FAM-ST4 5’ -ataggagtcacgacgaccagaa GAAGCTTAAGGGGAGGCAACGATGGACATGCGAGGCTGAA tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’FAM-ST5 5， -ataggagtcacgacgaccagaa AAAGCCTGCTGGCGTGGGACAGAAAAGGTGCCGCGGCATT tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’FAM-ST6 5’ -ataggagtcacgacgaccagaa TCTAAATGATGGCAAAGGATTAGTTGAGATCACTGGCCCT tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’FAM-ST7 5’ -ataggagtcacgacgaccagaa TAAGTACAGGACTGGAGTATTAGCGGGGTCCATGCAAGGC tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’FAM-ST8 5’ -ataggagtcacgacgaccagaa AAGTCACCGCGCATACTTGCAGCATGACTCTTCTAGTGGA tatgtgcgtctacctcttgactaat-3，FAM-ST9
5’ -ataggagtcacgacgaccagaa AATCAATAGAAGACAAAGTCCGAAACAGGTGTGACGGTAA tatgtgcgtctacctcttgactaat-3’2)利用流式细胞仪进ー步筛选出鼠伤寒沙门氏菌高亲和カ的aptamer。a.上述9条FAM标记的aptamer及文库分别与I X IO8细菌室温孵育45min,离心弃上清后，将细胞重溶于300 ii L 1XBB，上机检测；b.用GraphPad Prism 5绘制非线性曲线,得出Kd,见图2。5、利用流式细胞仪进行特异性鉴定a.根据Kd值的结果，得出与鼠伤寒沙门氏菌亲和カ最強的为S2 (Kd =6. 33 + 0. 58)，S9 (Kd = 11. 14 + 0. 12)。下面分别对这两条序列做特异性分析。b. S2、S9 (50nM)分别与鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、阪崎杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌室、副溶血性弧菌和化脓链球菌温孵育45min，离心弃上清后，将细胞重悬于300 u L I XBB，上机检测；由图2可以得出结论S2，S9的解离常数相对其他7条较小，说明它们与目标菌种的亲和カ强于其他7条序列。由图3可得出结论S2与4种菌种结合，流式细胞仪检测的荧光强度曲线可以明显将鼠伤寒沙门氏菌与大肠杆菌、阪崎杆菌、单增李斯特菌、金黄色葡萄球菌、副溶血性弧菌和化脓链球菌分开，且鼠伤寒沙门氏菌的荧光强度峰值右移更加明显，表明S2可特异性识别鼠伤寒沙门氏菌。
权利要求
1.一种特异性识别鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子及其筛选方法与应用，其特征在于所述寡核苷酸适配子的序列如序列表中所示。
2.根据权利要求1所述的特异识别鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子的筛选方法，按照下列步骤进行1)随机单链DNA(ssDNA)文库的构建和引物随机 ssDNA 文库5’ -ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-N40-TATGTGCGTCTACCTCTTGACTAAT-3’引物1:5’ -ATAGGAGTCACGACGACCAGAA-3’ ；引物 I1:5，-ATTAGTCAAGAGGTAGACGCACATA-3，，2)PCR扩增随机ssDNA文库；3)SELEX筛选鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子；4)DNA克隆和测序；5)适配子序列同源性和高级结构分析；6)适配子亲和力和特异性鉴定。
3.根据权利要求1所述的特异识别鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子在检测鼠伤寒沙门氏菌方面的应用，其特征在于所述寡核苷酸适配子是体外化学合成的，或是通过PCR或其他分子生物学方法制备的。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，涉及特异性识别鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子是筛选和应用。通过SELEX技术获得了能够特异性识别鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子，接着利用流式细胞仪对适配子的亲和力和特异性做了分析，得出亲和力最强，特异性最好的识别鼠伤寒沙门氏菌的寡核苷酸适配子。该适配子在准确、快速、灵敏检测食品中鼠伤寒沙门氏菌方面具有广泛的应用前景。
文档编号C12Q1/04GK103031305SQ20111029136
公开日2013年4月10日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者王周平, 段诺, 吴世嘉 申请人:江南大学