可进行单分子核酸扩增的颗粒、其制备方法及应用的制作方法

专利名称：可进行单分子核酸扩增的颗粒、其制备方法及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种可进行单分子核酸扩增的颗粒、其制备方法及应用。
背景技术：
作为上世纪生命科学领域最重要的发明之一，DNA测序技术深刻地改变了人们对生命本质的理解和掌控能力，极大地推动了全球生命科学领域研究的发展。假如没有测序技术，基因序列就无法确定，酶切、克隆、反转录、cDNA、PCR、SNP、RNAi等研究技术也就根本无从谈起，生命科学领域不会有今日的蓬勃发展。生命科学领域无人不晓的GenBank，以及历时13年耗资3亿美元的全球合作完成的人类基因组计划，无不建立在测序的基础上。自1977年Sanger发明了利用了 DNA聚合酶的双脱氧终止原理测定核苷酸序列的技术以来，测序技术不断改进，新方法相继问世，测序规模也不断扩大。测序技术的操作简单化、成本低廉化、以及高通量化成为测序技术的发展方向。SOLiD, 454以及Solexa等为代表的新一代高通量测序技术，以三国鼎立的姿态平分着序列测定的天下。三种技术各有千秋，发展更新的速度可谓日新月异。但目前而言，其测序文库制备的过程均仍较为复杂。测序文库的制备作为整个测序过程中的第一个且及其重要的一个步骤，对测序结果的优劣有着决定性的作用。测序文库的制备大体来说包括以下几个步骤。第一步是如何将核酸从待检测的样本中高质量地提取出来。针对不同的样本，人们所选用的实验流程和方式将会有较大的差异；第二步是如何将长片段的核酸进行小片段花处理，主要针对基因组DNA及长片段的RNA等样本，因为目前测序仪对于读长的限制，只能对制备的随机小片段进行测序，再通过生物信息学方法进行拼接，得出全基因组的序列信息。目前核酸小片段化基本使用物理作用来进行，超声波由于其自身的各种优点而成为打碎DNA的普遍方式， 可通过调节超声功率及超声时间来获得不同长度的小片段DNA。Solexa及SOLiD中所需片段较小，而妨4则要求更长的片段；第三步便是如何将小片段核酸的两端连接上测序所需的通用接头序列，对于不同的核酸类型需使用不同类型的接头序列。DNA使用平末端接头， miRNA需使用黏性末端接头；第四步是如何将连接有接头序列的核酸序列进行单分子多拷贝扩增，包括有乳液PCR、桥式PCR及滚环扩增等，在扩大测序信号强度的同时确保真实的反映样本的原始信息。该步骤对测序结果的好坏起着决定性作用。目前在第二代测序技术的测序文库制备中，尚无法对大量的待测测序片段实现单分子多拷贝的完美扩增。目前，新一代DNA测序技术的测序文库制备过程步骤繁琐，耗时长，花费高。特别是样品在扩增过程中失真现象严重。由于目前的测序文库制备方法中均有PCR扩增过程， 需通过割胶方法来选择出那些连接有两端接头并有合适长度的模板，并对低丰度的待测片段序列进行扩大，进行多次PCR扩增过程，必然引起某些片段的非线性扩增过程，从而使得制备得的测序文库未能如实代表了原始的样本信息，因此影响了测序结果的可信度。因此， 改进测序文库制备方法，使其能够真实的反映出样本中的原始信息，是本领域研究人员追求的重要待测之一。

发明内容
本发明提供一种可进行单分子核酸扩增的颗粒，将其应用于单克隆的测序文库制备中，可以提高高通量测序结果的准确性，使其真实反映样本的原始信息。本发明还提供上述单分子核酸扩增的颗粒在测序文库制备中的应用。本发明还提供上述单分子核酸扩增的颗粒的制备方法。所述可进行单分子核酸扩增的颗粒，表面结合有多条单链核酸和一条双链核酸， 所述双链核酸通过其中一条序列的一端与颗粒表面连接，并可作为双链接头与待测序核酸、以及末端双链接头顺序连接，然后变性形成一条单链核酸分子模板，所述单链核酸分子模板可以以颗粒表面的单链核酸作为引物进行有效PCR扩增，在颗粒表面形成多条双链测序模板，再将所述多条双链测序模板转化为多条单链测序模板后用于检测待测序核酸的信息，所述颗粒单个体积在KT5-IO5立方微米之间。作为一种优选方案，所述多条单链核酸为可对单条核酸分子模板进行桥式PCR扩增的多条上游引物和多条下游引物，所述上游引物或下游引物的序列中包含有酶切位点， 所述双链核酸可作为双链接头与待测序核酸、以及末端双链接头顺序连接，然后变性形成连接在所述颗粒表面的单链核酸分子模板，所述单链核酸分子模板可以以颗粒表面的单链核酸作为引物进行有效PCR扩增，在颗粒表面形成多条双链测序模板，通过酶切和变性将所述多条双链测序模板转化为多条单链测序模板后用于检测待测序核酸的信息。为了使酶切和变性得到的多条单链测序模板可以直接用于测序仪研究的文库，优选将酶切位点设计在下游引物端。作为另一种优选方案，所述多条单链核酸为可对单条核酸分子模板进行PCR扩增的多条上游引物或多条下游引物，所述双链核酸可作为双链接头与待测序核酸、以及末端双链接头顺序连接，然后变性形成单链核酸分子模板，所述单链核酸分子模板可以以颗粒表面的单链核酸和游离的另一条单链核酸作为引物进行有效PCR扩增，在颗粒表面形成多条双链测序模板，通过变性将所述多条双链测序模板转化为多条单链测序模板后用于检测待测序核酸的信息。所述颗粒采用本领域用于连接核酸分子的公知材料，例如可以为表面包被有修饰基团的磁珠或PS微球，其通过化学键与多条单链核酸和一条双链核酸结合。所述可进行单分子核酸扩增的颗粒在测序文库制备中的应用方法为将颗粒表面结合的双链核酸作为双链接头与待测序核酸、以及末端双链接头顺序连接，然后变性形成连接在所述颗粒表面的一条单链核酸分子模板，以颗粒表面的单链核酸作为引物对所述单链核酸分子模板进行有效PCR扩增，在颗粒表面形成多条双链测序模板，再将所述多条双链测序模板转化为多条单链测序模板后用于检测待测序核酸的信息。作为一种优选方案，所述末端双链接头的一条序列的一端固定于固体基底表面， 与待测序核酸连接后再与所述颗粒表面固定的双链核酸连接，变性形成单链核酸分子模板，使连接有一条单链核酸分子模板的颗粒从固体表面释放。所述可进行单分子核酸扩增的颗粒的制备方法为，(1)表面包被有修饰基团的颗粒与单链核酸混合，所述单链核酸的一端修饰有可与前述修饰基团反应的第一反应基团，修饰基团与第一反应基团反应，使单链核酸连接到所述颗粒表面；
(2)过量表面包被有修饰基团的颗粒与双链核酸混合，所述双链核酸的其中一条序列的一端修饰有可与前述修饰基团反应的第二反应基团，修饰基团与第二反应基团反应，使所述每颗颗粒表面至多连接一条双链核酸，上述步骤(1)和O)的先后顺序任意，最终得到表面结合有多条单链核酸和一条双链核酸的颗粒，所述双链核酸通过其中一条序列的一端与颗粒表面连接。本发明中颗粒表面结合的作为引物的单链核酸的量应在进行有效的PCR扩增后， 颗粒表面结合的多条双链测序模板可以满足检测的需要。所述颗粒表面结合的作为引物的单链核酸的量可由本领域技术人员经试验确定。本发明所述待测序核酸包括，所提取出的基因组DNA、RNA片段、转录后的cDNA、相应核酸样本的PCR扩增产物、以及多种单链核酸序列，如microRNA等。本发明制备出的单克隆核酸文库可应用于多种新一代的高通量测序平台，如SOLiD等。本发明所述可进行单分子多拷贝核酸扩增的颗粒表面结合有两种类型的核酸序列，其一为单链的引物序列1和2或引物序列1，即可作为测序文库PCR扩增时的引物使用； 其二双链的接头序列8。针对待测序核酸样本的不同，设计不同的接头末端类型，双链DNA 的测序样本为平末端；单链核酸的测序样本则为黏性末端。另外设计一条游离或固定于固体基底的双链接头序列9，与待测序核酸的另一端进行连接，与接头8配对便于下一步的核酸扩增。利用上述的颗粒，并在连接酶的作用下依次将待测序的核酸样本4与接头9连接到接头8的末端，并通过变性得到单链的测序模板7。测序模板7的5' -3'端序列信息依次为，接头序列3、待测序核酸序列4及接头序列5序列。其中，接头序列3为接头序列8 的正链，接头序列5为接头9的正链。两类核酸序列均为5'端结合于颗粒表面；其中引物序列1与接头序列3部分相同，引物序列2与接头序列5部分互补。制备出上述颗粒后，便可进行单分子多拷贝的核酸扩增过程。扩增方式包括有桥式PCR或普通PCR扩增方式，该处的扩增反应体系可为基于乳液体系中或基于固体介质表面进行；通过最后对颗粒表面单分子多拷贝核酸扩增的PCR产物进行变性处理或者酶切和变性处理，得到了可直接应用于新一代高通量测序技术中的单克隆文库，核酸文库的颗粒表面结合为若干条的相同的核酸序列，5'端结合于颗粒表面，其5' -3'端序列信息依次为，接头3、待测核酸序列4及接头5序列。该发明大体包括有以下四个主要的实现步骤(1)可进行单分子核酸扩增的颗粒的制备；(2)在上述颗粒上连接上待测序的待测序列；(3)制备出的颗粒进行单分子多拷贝核酸扩增的过程；(4)通过变性反应获得包含有测序引物和待测核酸序列的大量相同DNA单链的颗粒，也就是单克隆核酸文库。上述每个实现步骤根据其待处理的核酸序列类型的不同以及后续的不同核酸扩增方式，可组成若干不同试验方式。下面对各种不同的试验方式进行具体的介绍。(一 )可进行单分子核酸扩增的颗粒的制备；
A.将单链的引物序列结合到颗粒表面利用颗粒表面修饰基团及单链引物序列的5'端相应基团的修饰，如亲和素包被的颗粒和5'端生物素修饰的核酸序列，从而将若干条的引物序列结合到颗粒的表面，每条序列的5'端结合于颗粒表面，3'端游离于外，可有两种类型的引物结合方式(1)双引物颗粒即将上游引物1和下游引物2结合到颗粒表面，即颗粒表面结合有若干条的等比例的上游和下游引物，该种颗粒称为双弓I物颗粒。(2)单引物颗粒即将单种的上游引物1结合到颗粒表面，即颗粒表面结合有若干条的上游引物， 该种颗粒称为单引物颗粒。B.将双链接头序列8结合到颗粒表面同样利用颗粒表面修饰基团及双链接头序列的5'端相应基团的修饰，如亲和素包被的颗粒和5'端生物素修饰的核酸序列，从而将每种的接头序列以单条的比例结合到每个颗粒的表面，每条双链序列的正链的5'端结合于颗粒表面，3'端游离于外，可有两种类型的接头。为了使每个颗粒表面至多结合一条双链接头，应使参与连接反应的颗粒与双链接头之间的摩尔比大于1，即使颗粒过量。(1)平末端接头该种双链接头序列的两端均为平末端，应用的待测核酸序列为双链核酸序列，如基因组DNA或RNA片段、转录后cDNA或低拷贝的PCR产物等。该种接头8对应的接头9也为两端均为平末端的双链核酸序列。该接头可直接在连接酶的作用下与待测核酸序列进行连接反应，从而得到连接产物。(2)黏性末端接头该种双链接头序列的一端为平末端，一端为黏性末端，平末端结合于颗粒表面， 黏性末端在负链的5'端突出有几位N碱基，应用的待测核酸序列为单链核酸序列，如 microRNA等。该种接头8对应的接头9也为一端为平末端，一端为黏性末端，平末端游离于外，黏性末端在负链的3'端突出有几位N碱基，可与待测序列进行杂交。该种接头首先通过碱基的杂交作用将接头序列与待测单链核酸序列进行杂交，而后在连接酶的作用下进行连接反应，从而得到连接产物。通过上述步骤A和步骤B，即得到了可进行后续与待测核酸序列进行连接的颗粒， 该处得到的颗粒可分别称为单平末端接头双引物颗粒、单平末端接头单引物颗粒、单黏性末端接头双引物颗粒或单黏性末端接头单引物颗粒。( 二)在上述颗粒上连接上待测序的待测序列；该步骤通过连接酶的作用将待测核酸序列4及接头9结合到经过步骤(一)处理后的颗粒，即将一端有接头9的待测核酸序列4的另一端连接到颗粒上接头8游离的末端， 可于两种的反应体系下进行反应(1)游离液体体系下即将步骤(一)处理后的颗粒游离于液体体系中进行连接反应首先向反应体系中加入待测核酸序列及连接反应体系，从而可将每条待测核酸序列单一的连接到每个颗粒表面，在该步反应结束后，即可得到表面结合有引物序列及接头8 和待测核酸序列4的连接产物。其后将该种颗粒与接头9进行游离液体体系下的连接反应， 即将接头9的一端结合于待测核酸序列的末端，一端为游离状态。最后对该颗粒变性，可于变性剂、碱、酸、酶或高温等条件下进行，从而得到可进行后续的单克隆测序文库制备的颗粒，其上结合有引物序列1和2或1，以及单链测序模板7。针对双链待测核酸序列，即使用的两种接头序列为平末端接头，从而连接反应为直接于连接酶的作用下进行连接反应。针对单链待测核酸序列，即使用的两种接头序列为黏性末端接头，从而连接反应分为两步进行，首先进行接头与待测核酸序列的杂交反应，而后在连接酶的作用下进行连接反应。(2)基于固体基质表面将结合有引物和接头8的颗粒与待测核酸序列4及接头9的连接反应于某种固体基质的表面进行，如颗粒、硅片、玻璃片、纤维膜等。首先对该处的固体基质表面进行基团处理，从而将修饰有相应基团的接头9可结合于该基质的表面，如亲和素和生物素等。在连接酶的作用下将待测核酸序列4与接头9的游离端进行连接反应，因此该种固体基质的表面结合有若干条的接头9和待测核酸序列4的连接产物，待测核酸序列4的一端游离于外，接头9 一端结合于基底表面。其后将通过步骤(一)处理后的颗粒加入如基片表面，在连接酶的作用下，进行接头8与待测序列游离端的连接反应，因此该步骤实现了将接头8、待测核酸序列4及接头9 的连接反应。最后对双链核酸序列进行变性，从而将颗粒从基片表面释放出。变性反应可于变性剂、碱、酸、酶或高温等条件下进行。显然，双链核酸序列中接头8与颗粒连接的单条序列和接头9与固体基片连接的单条序列不是同一条序列。通过上述步骤即制备得到可进行后续的单克隆测序文库制备的颗粒，其上结合有引物序列1和2或1，以及单链测序模板7。针对双链待测核酸序列，即使用的两种接头序列为平末端接头，从而连接反应为直接于连接酶的作用下进行连接反应。针对单链待测核酸序列，即使用的两种接头序列为黏性末端接头，从而连接反应分为两步进行，首先进行接头与待测核酸序列的杂交反应，而后在连接酶的作用下进行连接反应。根据不同的引物结合方式，该处得到的颗粒可分别称为单模板双引物颗粒或单模板单引物颗粒。(三)制备出的颗粒进行单分子多拷贝核酸扩增的过程；通过上述步骤(一)和(二)制备出的颗粒，即可进行单分子多克隆的核酸扩增反应，下面针对上述步骤制备出的两种类型的颗粒分别进行介绍(1)单模板双引物颗粒该种颗粒表面结合有若干条上游引物1和下游引物2，以及单条的包括有待测核酸序列和两端接头序列的单链测序模板7。从而可于颗粒表面进行桥式PCR扩增过程，在该反应体系中即为普通的PCR扩增反应体系，无需添加引物序列。可于两种反应环境下进行。A.乳液 PCR使用普通的乳液PCR中油包水的微珠，将颗粒及PCR扩增体系于每个独立的油包水的微珠中进行桥式PCR过程。B.基于固体基质的PCR即将颗粒固定与某种固体基质表面进行PCR扩增，为在片PCR扩增方式，将每个颗粒及PCR扩增体系于基片的表面进行桥式PCR过程。通过上述两种方式均可高效精确的进行基于颗粒表面的单分子多拷贝核酸扩增过程，即桥式PCR扩增，每个颗粒上的核酸序列均为双链核酸序列，且两端均结合于颗粒表面。称为桥式扩增颗粒。(2)单模板单引物颗粒该种颗粒表面结合有若干条的上游引物1，以及单条的包括有待测核酸序列和两端接头序列的单链测序模板7。于该颗粒表面进行普通PCR扩增过程，反应体系为普通的 PCR扩增反应体系，只需添加单种的下游引物2。该反应可于乳液PCR方式进行使用普通的乳液PCR中油包水的微珠，将颗粒及包括有下游引物序列的PCR扩增体系于每个独立的油包水的微珠中进行PCR过程。通过以上方式即可高效精确的进行基于颗粒表面的单分子多拷贝核酸扩增过程， 该处为普通PCR扩增，即每个颗粒上的核酸序列均为双链核酸序列，一端结合于颗粒表面。 称为普通扩增颗粒。(四)最终单克隆核酸文库的制备；通过上述步骤(一)、(二)和(三)制备出的颗粒，即可进行单克隆核酸文库的制备，下面针对上述步骤制备出的两种类型的颗粒分别进行介绍(1)桥式扩增颗粒双链核酸序列的两端均结合于颗粒表面，利用下游引物2与颗粒的结合端设计有的酶切位点，如核酸内切酶V，通过核酸内切酶V的作用进行酶切，将PCR产物的引物序列2 末端从颗粒表面释放出来。其后并进行变性反应，如变性剂、碱、酸、酶或高温等条件处理，使得颗粒表面的双链PCR产物进行变性，将负链从颗粒表面释放出去。最终得到单克隆核酸测序文库的颗粒，即实现了应用于新一代高通量测序技术中的单克隆核酸文库的制备。(2)普通扩增颗粒双链核酸序列的一端结合于颗粒的表面，对其进行变性反应，如强碱、强酸、酶或高温等条件处理，使得颗粒表面的双链PCR产物进行变性，将负链从颗粒表面释放出去。最终得到单克隆核酸测序文库的颗粒，即实现了应用于新一代高通量测序技术中的单克隆核酸文库的制备。通过上述的四个步骤即实现本发明中所述的可进行单分子多拷贝核酸扩增的颗粒，并将其应用于新一代高通量测序技术中单克隆核酸文库的制备中。本发明的有益效果
本发明与现有的技术相比，具有如下的优点①本发明的最大优点是对测序文库的单分子多拷贝的制备过程，从而使得测序文库真实的反映出样本的原始信息。普通的PCR扩增由于无法准确的分辨线性扩增和指数扩增的分界点，从而使得测序文库中的信息未能如实代表样本的初始信息。②本发明具有很高的灵敏性，由于该方法中的每个颗粒的信息代表了单个的核酸片段信息，因此在PCR扩增时可进行充分的扩增，使得每个的颗粒均进行充分的扩增，最大程度的对每个核酸序列信息进行测序采集，因此可有效的提高测序分析的灵敏度。③本发明具有很高的保真性，由于该方法中直接于颗粒表面进行测序文库的制备过程，从而将所有的待测序片段均进行了有效的文库制备，而在普通的测序文库制备过程中，需进行连接产物的选择过程，因此一般引入有割胶等片段选择过程，必然丢失了一部分的样本核酸片段，而本发明中直接于颗粒表面进行所有的文库制备过程，可谓将所有的待测序的核酸片段均制备为合适的测序文库，因此具有很高的样本信息的完整性及保真性。④本发明操作简易，由于所有的测序文库制备过程均于颗粒表面进行，而使用颗粒的一大优势正在于其的可分离性及可操作性。并且利用自动控制技术可实现测序文库制备的自动化，从而不仅简化操作步骤，并去除人工操作可能引入的污染。⑤本发明制备得到的测序文库不仅可应用于各种高通量测序平台，且可应用于多种的普通的核酸检测方法。该技术具有高保真性、高灵敏度、简易性及自动化等特点。
以下结合附图对本发明作进一步说明

图1是本发明中对应可进行单分子核酸扩增的颗粒示意图；图2是本发明中对应可进行单克隆文库制备的颗粒示意图；图3是本发明于游离体系中制备出单模板双引物的颗粒，应用于双链目标核酸序列，如基因组DNA片段，而后进行桥式PCR的单克隆核酸文库制备过程的示意图；图4是本发明于游离体系中制备出单模板双引物的颗粒，应用于单链目标核酸序列，如microRNA，而后进行桥式PCR的单克隆核酸文库制备过程的示意图；图5是本发明于固体基片表面制备出单模板双引物的颗粒，应用于双链目标核酸序列，如基因组DNA片段，而后进行桥式PCR的单克隆核酸文库制备过程的示意图；图6是本发明于固体基片表面制备出单模板双引物的颗粒，应用于单链目标核酸序列，如microRNA，而后进行桥式PCR的单克隆核酸文库制备过程的示意图；图7是本发明于游离体系下中制备出单模板单引物的颗粒，应用于双链目标核酸序列，如基因组DNA片段，而后进行普通PCR的单克隆核酸文库制备过程的示意图；图8是本发明于固体基质表面制备出单模板单引物的颗粒，应用于单链目标核酸序列，如microRNA，而后进行普通PCR的单克隆核酸文库制备过程的示意图；其中1表示上游引物，2表示下游引物，3表示接头8的正链，4表示目标核酸序列， 5表示接头9的正链，6表示颗粒，7表示单链测序模板序列，8代表一端的双链接头，9表示另一端的双链接头。图9是SOLiD测序仪上进行QC分析的结果图。
具体实施例方式实例1基于亲和素包裹磁珠的对孕妇胎盘组织中的基因组DNA的测序文库制备， 具体的反应方式为单平末端接头双引物磁珠于游离液体体系下制备单模板双引物磁珠，而后于乳液PCR体系下进行桥式PCR扩增，从而制备出单克隆的测序文库。即如图3中所示。使用该发明应用于孕妇胎盘组织中的基因组DNA片段进行单克隆测序文库的制备，该处使用的颗粒为亲和素包被的磁珠。磁珠大小为ι μ m、表面包被亲和素，结合能力为大于 1, 300pmoles/mgo首先将若干条上游和下游引物结合到磁珠的表面，上下游引物的5'端为生物素修饰，即制备得到双引物的磁珠。具体步骤为首先取出100 μ 1的磁珠原液，通过磁力架将磁珠从液体中分离，弃液体；使用100 μ 1的清洗缓冲液进行三次的清洗，其中分离步骤依靠磁力架进行磁力分离；在100 μ 1的结合缓冲下将5 μ 1的ImM的上游引物和5 μ 1的ImM的下游引物结合到磁珠上，反应条件为37°C，2hours ；在反应结束后使用100 μ 1的清洗buffer进行3次清洗， 其中分离步骤依靠磁力架进行磁力分离；对结果进行检测，分别取2μ 1的磁珠在20μ 1的杂交缓冲液、20 μ 1的荧光标记的杂交探针(上游引物互补序列、下游引物互补序列)的体系下，分别杂交磁珠上的上下游引物，通过荧光显微镜对结果进行观测，上下游引物互补探针均检测到有效的荧光信号；最终溶解于100 μ 1的溶解缓冲液中，保存于4°C。其后将双链的平末端接头结合到磁珠表面，该接头的正链5'端为生物素标记，即制备得到单平末端接头双引物的磁珠。具体步骤为将上述制备好的双引物磁珠使用清洗缓冲液进行三次清洗，而后在 100 μ 1的结合缓冲液下与1μ 1的10 μ M双链接头进行结合，反应条件为37°C，2hours ；反应完成后使用100 μ 1的清洗缓冲液进行三次的清洗；最终溶解于100 μ 1的溶解缓冲液中， 保存于4°c。从而制备得到可进行单分子多克隆的磁珠颗粒。而后于液体的反应体系下，在快速T4DNA连接酶的作用下依次将目标的孕妇胎盘基因组DNA片段以及另一端的接头9序列结合到磁珠的表面，即得到双链的连接产物，两端为接头序列，中间为胎盘基因组DNA片段。然后在强碱条件下进行变性得到单模板双引物的磁珠。其后于乳液PCR的反应体系下进行桥式PCR扩增，并于扩增结束使用核酸内切酶 V对双链的PCR扩增产物进行酶切，将引物序列2端由磁珠上释放出来。最后于碱性条件下进行变性，，即制备得到针对孕妇胎盘基因组DNA片段的单分子多拷贝核酸扩增的测序文库。具体的实现步骤如下所示1.待测DNA片段制备从一位正常孕妇的胎盘组织中提取出基因组DNA，而后利用超声破碎技术，得到 IOObp左右长度的基因组DNA片段。2.引物及接头片段制备根据接头及引物的相关性设计出的四条序列如下序列5'-3'5'端标记接头8 一正链3TTTTTTTTTTCCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATGGGC AGTCGGTGAT51-生物素接头8 一负链ATCACCG ACTG CCCATAG AG AGG AAAG CG G AG G CGTAG TGG5'-磷酸化接头9 一正链5AGAGAATGAGGAACCCGGGGCAG5_-磷酸化接头9 一负链CTGCCCCGGGTTCCTCATTCTCT上游引物1Tl I 11 I I I I ICCACTACGCCTCCGCTTTCCTCTCTATG51-生物素下游引物2IllllimillICIGCCCCGGtiI ICCICAI ICI51-生物素该处每条序列中与微球进行结合一端均设计有10个T碱基，以减少序列与微球表面接触的空间位阻。此处为现有技术。两条引物序列中设计为两条接头序列产生的连接产物相对应的上下游引物，从而可进行有效的PCR扩增。在下游引物2中设计有对应于核酸内切酶V的酶切序列，其酶切针对I碱基进行。该酶切位点的设计优势在于可在单分子多拷贝扩增后利用核酸内切酶V的酶切作用对双链的扩增产物进行剪切，并进行变性反应，从而得到包被有单链的测序模板文库的磁珠，可有效的进行测序研究。3.单接头双引物的磁珠制备该处使用微球为直径1 μ m的表面修饰有亲和素的磁珠，两条引物1和2以及接头 8正链即3，其5'端均修饰为生物素基团，可通过生物素和亲和素的反应将核酸序列结合到磁珠表面。首先将过量的两条引物序列结合到磁珠表面，从而得到表面结合有若干条的上游及下游引物(1和幻的磁珠。其后与略过量的磁珠加入接头8序列，从而得到表面结合有一条接头8序列以及若干条的上下游引物1和2的磁珠。通过该步骤的生物素和亲和素的结合反应，制备得后续反应所需的磁珠，每个磁珠表面结合有若干条上下游引物以及一条接头序列，简称为单接头双引物磁珠。4.磁珠表面的连接反应上一步骤中制备得到的磁珠为单接头双引物磁珠，从而在每个磁珠上只结合有一条的双链接头，且5'末端已进行磷酸化处理，在快速T4 DNA连接酶(M2200，BioLabs)的处理下，在游离的液体反应环境下，将双链接头8与片段化处理后的基因组DNA进行连接， 从而每个磁珠上结合有若干条的上下游引物(1和幻以及一条接头8与待测序分析的基因组DNA片段4的连接产物。而后加入另一端的接头9序列，该接头正链的5'端已进行磷酸化处理，从而可以唯一的连接到磁珠上的接头8与待测DNA片段4的连接产物。该步骤得到的磁珠称为单模板双引物的磁珠，每个磁珠上结合有若干条上下游引物(1和2、和一条接头8、接头9及待测DNA片段4的连接产物。5.变性
通过碱性(0. IM NaOH)处理，使得双链的连接产物进行变性，从而得到的磁珠上均为单链序列，包括有若干条上下游引物1和2，以及测序模板序列7，其两端为接头的正链序列，中间为待测序的基因组DNA片段。6.乳液 PCR使用乳液PCR体系，通过油包水的体系，从而使得每个磁珠均可进行高效的PCR扩增。在乳液PCR体系中，包含有磁珠、酶、Mg2+、dNTPs、缓冲液、水、油等，没有加入游离的上下游引物，从而在理想情况下，每个液滴中包含有一个磁珠以及除去引物的过量的PCR扩增体系，从而可对每个磁珠进行高效的PCR扩增。即使在某些失败的液滴中包括有两个或两个以上的磁珠，但由于前一步的变性操作，使得每个模板序列均唯一的固定于每个磁珠的表面，因此在扩增种不会相互造成干扰，从而可完全保证扩增的单分子多拷贝效应。该步骤得到的每个磁珠表面均为一条测序模板序列7的单分子多拷贝的PCR扩增产物，且每条双链的两端均结合于磁珠表面。7.酶切在核酸内切酶V的作用下对PCR扩增产物进行酶切反应，从而使得双链的一端从磁珠表面释放出来。该步骤得到的磁珠上为一端结合于磁珠表面的单分子多拷贝扩增的双链DNA序列。8.变性同样在碱性(0. IM NaOH)的处理下，使得磁珠上的双链序列进行变性，通过该步骤即制备得到最终的测序文库。每个磁珠上包被有若干条测序模板序列7，该序列方向为5' -3'，依次为接头序列3、待测序核酸序列4以及接头序列5。9.结果检测——单克隆比例分析将制备好的磁珠于SOLiD测序仪上进行QC分析，即分析其单拷贝磁珠的比例，该处结果达到93%。结果如图9所示。利用该发明基于磁珠实现了单克隆测序文库的制备过程，每个磁珠均有效且唯一的代表了每条待测序核酸序列4。该方法中使用的磁珠优势在于每步骤中的分离可直接通过磁力分离，从而使得操作较为方便及高效的分离。实例2基于亲和素包裹磁珠的对孕妇血清中游离的microRNA的测序文库制备，具体的反应方式为单黏性末端接头双引物磁珠于游离液体体系下制备单模板双引物磁珠，而后于乳液PCR体系下进行桥式PCR扩增，从而制备出单克隆的测序文库。即如图4中所示。使用该发明应用于孕妇血清中游离的microRNA进行单克隆测序文库的制备，该处使用的颗粒为亲和素包被的磁珠。磁珠大小为ι μ m、表面包被亲和素，结合能力为大于 1，300pmoles/mgo首先将若干条等比例的上游和下游引物结合到磁珠的表面，上下游引物的5'端为生物素修饰，即制备得到双引物的磁珠。具体步骤为首先取出100 μ 1的磁珠原液，通过磁力架将磁珠从液体中分离，弃液体；使用100 μ 1的清洗缓冲液进行三次的清洗，其中分离步骤依靠磁力架进行磁力分离；在100 μ 1的结合缓冲下将5 μ 1的ImM的上游引物和5 μ 1的ImM的下游引物结合到磁珠上，反应条件为37°C，2hours ；在反应结束后使用100 μ 1的清洗buffer进行3次清洗， 其中分离步骤依靠磁力架进行磁力分离；对结果进行检测，分别取2μ 1的磁珠在20μ 1的杂交缓冲液、20 μ 1的荧光标记的杂交探针(上游引物互补序列、下游引物互补序列)的体系下，分别杂交磁珠上的上下游引物，通过荧光显微镜对结果进行观测，上下游引物互补探针均检测到有效的荧光信号；最终溶解于100 μ 1的溶解缓冲液中，保存于4°C。其后将双链的黏性末端接头8结合到磁珠表面，该接头8的正链5 ‘端为生物素标记，负链的5'端突出有6个N碱基，即制备得到单黏性端接头双引物的磁珠。具体步骤为将上述制备好的双引物磁珠使用清洗缓冲液进行三次清洗，而后在 100 μ 1的结合缓冲液下与1μ 1的10 μ M双链接头进行结合，反应条件为37°C，2hours ；反应完成后使用100 μ 1的清洗缓冲液进行三次的清洗；最终溶解于100 μ 1的溶解缓冲液中， 保存于4°c。而后于液体的反应体系下，首先与目标的孕妇血清中游离的microRNA进行杂交， 其后在连接酶的作用下进行连接，另一端的双链接头9负链的3 ‘端突出有6位N碱基，即可利用同样的方式进行连接到目标的microRNA的一端，即磁珠表面结合有连接产物，两端为接头序列，中间为孕妇血清中游离microRNA。然后进行于强碱条件下进行变性得到单模板双引物的磁珠。其后于乳液PCR的反应体系下进行桥式PCR扩增，并于扩增结束使用核酸内切酶 V对双链的PCR扩增产物进行酶切，将引物序列2端由磁珠上释放出来。最后于碱性条件下进行变性，即制备得到针对孕妇血清中游离miRNA的单分子多拷贝核酸扩增的测序文库。具体的实现步骤如下所示1.待测 microRNA 制备从一位正常孕妇的母血血清中提取出游离microRNA。2.引物及接头片段制备根据接头及引物的相关性设计出的四条序列如下
权利要求
1.一种可进行单分子核酸扩增的颗粒，其特征在于，所述颗粒表面结合有多条单链核酸和一条双链核酸，所述双链核酸通过其中一条序列的一端与颗粒表面连接，并可作为双链接头与待测序核酸、以及末端双链接头顺序连接，然后变性形成一条单链核酸分子模板， 所述单链核酸分子模板可以以颗粒表面的单链核酸作为引物进行有效PCR扩增，在颗粒表面形成多条双链测序模板，再将所述多条双链测序模板转化为多条单链测序模板后用于检测待测序核酸的信息，所述颗粒单个体积在KT5-IO5立方微米之间。
2.如权利要求1所述的可进行单分子核酸扩增的颗粒，其特征在于，所述多条单链核酸为可对单条核酸分子模板进行桥式PCR扩增的多条上游引物和多条下游引物，所述上游引物或下游引物的序列中包含有酶切位点，所述双链核酸可作为双链接头与待测序核酸、 以及末端双链接头顺序连接，然后变性形成连接在所述颗粒表面的单链核酸分子模板，所述单链核酸分子模板可以以颗粒表面的单链核酸作为引物进行有效PCR扩增，在颗粒表面形成多条双链测序模板，通过酶切和变性将所述多条双链测序模板转化为多条单链测序模板后用于检测待测序核酸的信息。
3.如权利要求2所述的可进行单分子核酸扩增的颗粒，其特征在于，所述下游引物的序列中包含有酶切位点。
4.如权利要求1所述的可进行单分子核酸扩增的颗粒，其特征在于，所述多条单链核酸为可对单条核酸分子模板进行PCR扩增的多条上游引物或多条下游引物，所述双链核酸可作为双链接头与待测序核酸、以及末端双链接头顺序连接，然后变性形成单链核酸分子模板，所述单链核酸分子模板可以以颗粒表面的单链核酸和游离的另一条单链核酸作为引物进行有效PCR扩增，在颗粒表面形成多条双链测序模板，通过变性将所述多条双链测序模板转化为多条单链测序模板后用于检测待测序核酸的信息。
5.如权利要求1-4中任一项所述的可进行单分子核酸扩增的颗粒，其特征在于，所述颗粒为表面包被有修饰基团的磁珠或PS微球，通过化学键与多条单链核酸和一条双链核酸结合。
6.权利要求1-5中任一项所述可进行单分子核酸扩增的颗粒在测序文库制备中的应用，其特征在于，将颗粒表面结合的双链核酸作为双链接头与待测序核酸、以及末端双链接头顺序连接，然后变性形成连接在所述颗粒表面的一条单链核酸分子模板，以颗粒表面的单链核酸作为引物对所述单链核酸分子模板进行有效PCR扩增，在颗粒表面形成多条双链测序模板，再将所述多条双链测序模板转化为多条单链测序模板后用于检测待测序核酸的 fn息ο
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述末端双链接头的一条序列的一端固定于固体基底表面，与待测序核酸连接后再与所述颗粒表面固定的双链核酸连接，变性形成单链核酸分子模板，使连接有一条单链核酸分子模板的颗粒从固体表面释放。
8.权利要求1-5中任一项所述可进行单分子核酸扩增的颗粒的制备方法，其特征在于，(1)表面包被有修饰基团的颗粒与单链核酸混合，所述单链核酸的一端修饰有可与前述修饰基团反应的第一反应基团，修饰基团与第一反应基团反应，使单链核酸连接到所述颗粒表面；(2)过量表面包被有修饰基团的颗粒与双链核酸混合，所述双链核酸的其中一条序列的一端修饰有可与前述修饰基团反应的第二反应基团，修饰基团与第二反应基团反应，使所述每颗颗粒表面至多连接一条双链核酸；上述步骤(1)和O)的先后顺序任意，最终得到表面结合有多条单链核酸和一条双链核酸的颗粒，所述双链核酸通过其中一条序列的一端与颗粒表面连接。
全文摘要
本发明涉及可进行单分子核酸扩增的颗粒、其制备方法及应用。所述可进行单分子核酸扩增的颗粒，表面结合有多条单链核酸和一条双链核酸，所述双链核酸通过其中一条序列的一端与颗粒表面连接，并可作为双链接头与待测序核酸、以及末端双链接头顺序连接，然后变性形成一条单链核酸分子模板，所述单链核酸分子模板可以以颗粒表面的单链核酸作为引物进行有效PCR扩增，在颗粒表面形成多条双链测序模板，再将所述多条双链测序模板转化为多条单链测序模板后用于检测待测序核酸的信息。所述可进行单分子核酸扩增的颗粒的制备方法为(1)使单链核酸连接到所述颗粒表面；(2)使所述每颗颗粒表面至多连接一条双链核酸。
文档编号C12Q1/68GK102559864SQ20111029130
公开日2012年7月11日 申请日期2011年9月29日 优先权日2011年9月29日
发明者杨琦, 涂景, 潘旻, 葛芹玉, 陆祖宏 申请人:东南大学