专利名称：分离纯化胚胎脑神经干细胞的快捷方法
分离纯化胚胎脑神经干细胞的快捷方法技术领域
本发明所涉及的是一种生物材料的提纯方法，具体说是一种胚胎脑神经干细胞的快速纯化方法。
背景技术：
胚胎脑神经干细胞的研究首先需要进行脑神经干细胞的分离，目前有两种分离胚胎脑神经干细胞的方法(I)悬浮培养法将分散后的脑神经细胞在培养皿中悬浮培养，形成神经球后传代培养若干次分离得到脑神经干细胞。这种方法得到的脑神经干细胞纯度不高，并且周期较长(参考文献Piper, D. R. et al. !Experimental Neurology 156,71-83,1999)。(2)FACS法先对神经干细胞的特异性抗原进行荧光标记，用精密仪器来筛选干细胞。这种方法虽然可以得到较高纯度的干细胞，但对干细胞有一定损伤，并且需要价格昂贵的精密仪器(参考文献Muotri，R. A. et al Proc Natl Acad Sci USA 97,14720-14725,2000)。发明内容
本发明的目的在于提供一种不需要昂贵的精密仪器设备，但可保证纯化后的胚胎脑神经干细胞产品具有高纯度的快捷方法。此方法是利用热转换聚合物对混合细胞进行培养，从而达到分离纯化神经干细胞的目的。用热转换聚合物对混合细胞进行三维立体培养也普遍适用于分离纯化其他种类干细胞，如肺干细胞、上皮干细胞等。
本发明的目的通过以下步骤得以实现
I)将热转换聚合物N-异丙基丙烯酰胺和聚乙二醇用培养基溶解，之后置于0°C， 使之呈液态。
2)在PBS缓冲液(4°C )中反复吹打脑组织，令分散后的细胞通过尼龙筛，单细胞悬浮液离心，弃除上清，用培养基(4°C )使细胞重新悬浮。
3)取O. 7ml热转换聚合物与O. 3ml细胞悬浮液混匀。
4)将上述混合物滴入孔状培养皿中，每孔O. 3ml，置37 °C培养箱中孵育5分钟。
5)在培养皿中加入培养基，使热转换聚合物N-异丙基丙烯酰胺和聚乙二醇完全没入培养基中。
6)将细胞放入37°C二氧化碳(5% )培养箱中培养，每2天更新培养基一次，培养时间为8到14天。
7)使热转换聚合物N-异丙基丙烯酰胺和聚乙二醇在低温溶解，用4°C培养基离心洗涤回收形成的神经球。
本发明使用的培养基为含15ng/ml bFGF (碱性成纤维生长因子)，30ng/ml EGF(上皮生长因子)，补充4% B27的DMEM/F12培养基。
采用本发明的方法提取的神经球经检测为Nestin阳性，可悬浮传代培养，也可在热转换聚合物N-异丙基丙烯酰胺和聚乙二醇中继续传代培养 。经此法分离提纯的胚胎神经干细胞可以在体外分化成神经元(Neuron)，神经胶质细胞(Glia)和少突胶质细胞 (Oligodendrocyte)。
本发明是利用热转换聚合物(N-异丙基丙烯酰胺和聚乙二醇)对胚胎脑神经细胞进行三维立体培养，利用神经干细胞可在无接点环境中增殖并形成神经球的特征从而达到对神经干细胞分离、扩增和纯化的目的。形成的神经球经免疫荧光标记，93%的细胞为Nestin阳性，说明此方法分离、富集、纯化神经干细胞快速有效。经此法分离提纯的神经干细胞可以在体外分化成神经元(Neuron)，神经胶质细胞(Glia)和少突胶质细胞 (Oligodendrocyte)。
图1为神经球免疫突光标记(Nestin标记)具体实施方式
下面举例对本发明做更详细的描述
1.热转换聚合物(N-异丙基丙烯酰胺和聚乙二醇)的准备这种聚合物是一种高温呈凝胶状态而低温呈液态状态的人工胶，它从液态到胶状的转换温度是25°C，可用培养基溶解，冰浴使之呈液状。
2.胚胎脑组织在低温PBS缓冲液中反复吹打，使细胞分散后通过尼龙筛，使其成单细胞悬浮液。单细胞悬浮液离心除去上清液，细胞用低温液体培养基再悬浮。
3.取0. 7ml热转换聚合物与0. 3ml细胞悬浮液混匀，细胞密度可根据脑组织的来源进行调节。
4.取细胞混合物一热转换聚合物混合物滴入孔状培养皿中，每孔0. 3ml，置37°C 培养箱中孵育5分钟，使混合物凝固。
5.在培养皿中加入预热的培养液，使混合物完全没入培养基中。
6.细胞放入37°C 5%二氧化碳培养箱中培养，每3天交换一次新培养液。培养一周后，可以在热转换聚合物中看到形成的神经球。
7.低温使热转换聚合物溶解，通过低温培养液离心清洗回收神经球。
8.回收的神经球经检测为Nestin阳性(图1)，可悬浮传代培养，也可在热转换聚合物中继续传代培养。经此法分离提纯的神 经干细胞可以在体外分化成神经元(Neuixm)， 神经胶质细胞(Glia)和少突胶质细胞(Oligodendrocyte)。
本研究使用的培养基为含15ng/ml bFGF (碱性成纤维生长因子)，30ng/ml EGF(上皮生长因子)，补充4% B27的DMEM/F12。
权利要求
1.一种简单分离纯化胚胎脑神经干细胞的独特方法，使用热转换聚合物N-异丙基丙烯酰胺和聚乙二醇对混合细胞进行三维立体培养，形成神经球，从而达到干细胞的分离纯化。
2.根据权利要求1所描述的分离纯化胚胎脑神经干细胞的快捷方法，其特征是利用热转换聚合物N-异丙基丙烯酰胺和聚乙二醇对混合细胞进行三维立体培养的方法还普遍适用于分离纯化其他种类的干细胞(如肺干细胞、上皮干细胞等)。
3.这种纯化方法使用的培养基特征是含15ng/mlbFGF(碱性成纤维生长因子)， 30ng/ml EGF(上皮生长因子)，补充4% B27的DMEM/F12培养基。
全文摘要
本发明提供的方法可快速简捷分离、扩增和提纯胚胎脑神经干细胞。本发明使用热转换聚合物N-异丙基丙烯酰胺和聚乙二醇对神经细胞进行三维立体培养，利用神经干细胞可在凝胶环境中增殖并形成神经球的特性达到对神经干细胞的分离纯化之目的。形成的神经球经免疫荧光标记测定，表明约93％的细胞为Nestin阳性，说明此方法分离纯化神经干细胞简单有效。经此方法分离纯化的胚胎神经干细胞可以在体外分化形成神经元、少突胶质细胞和神经胶质细胞。
文档编号C12N5/0735GK103031271SQ201110291150
公开日2013年4月10日 申请日期2011年9月30日 优先权日2011年9月30日
发明者田杰 申请人:北京清美联创干细胞科技有限公司