专利名称：：一种在花生种子中表达人humanin蛋白的方法
技术领域：
：本发明涉及一种表达人humanin蛋白的方法，尤其涉及一种利用油体蛋白系统在花生种子中表达人humanin蛋白的方法，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：阿尔茨海默病(Alzheimerdisease,AD)是以进行性的记忆减退、认知障碍和痴呆为临床表现的老年人常见疾病，发病率随着人口的老龄化而迅速增加，已经成为继心血管疾病、癌症和中风之后的又一严重危害人类健康的疾病。二十一世纪初，日本学者首先分离出一种称为Humanin(HN)的短肽，由M个氨基酸组成。它能有效抑制AD相关基因淀粉样蛋白前体(amyloidprecursor,APP)基因、早老素1(presenilnl，PSl)基因、早老素2(presenilis，PS2)基因的突变，以及β淀粉样肽(amyloidpeptide,Αβ)引起的神经细胞死亡[1_3]。HN的一级结构具有信号肽结构特点，可被分泌至细胞外，细胞外的HN通过与细胞表面受体结合，继而激活细胞内信号传导通路而发挥其细胞保护作用。此外，有关动物实验表明，脑内注射HN可以改善东莨菪碱引起的动物学习记忆障碍。且Humanin的一种衍生物——Humanin(HNG)，被证实作用较HN强1000倍M。近年来的研究表明，HNG还具有预防和治疗中风[5]、增强胰岛素活性从而治疗II型糖尿病[6]的作用。Humanin蛋白作用广泛，临床应用前景广阔，市场需求巨大，因此大规模生产人humanin蛋白意义重大。利用植物生物反应器是生产药用蛋白的有效方式。已有多种植物用作生物反应器，如烟草、大豆、拟南芥、玉米、油菜、马铃薯块茎、番茄果实、水稻种子等，其表达产物也有多种，如疫苗、抗体等。植物生物反应器成本较低，易于扩大规模，不存在动物细胞培养或微生物发酵中遇到的细胞培养困难、培养基昂贵、污染控制困难等问题。与动物转基因技术相比，植物转基因技术更加成熟。与动物和微生物系统相比，植物本身不携带引起人类疾病的病菌或病毒，避免了病原菌对生物反应器产品的污染。与微生物相比，利用植物生产的产品一般具有较高的生物活性。此外，油料作物种子中的油体蛋白能够高水平表达，可达到种子总蛋白的10%。如果将外源蛋白与油体蛋白融合表达，在提高外源蛋白表达水平的同时，还能简化蛋白的分离程序，有效降低生产成本。研究表明油体蛋白(oleosin)具有亲水和亲脂双重特性，在植物种子中以膜嵌入方式覆盖在油体表面。油体蛋白分子除中部疏水区域高度保守外，N端和C端的序列差异都很大。油体的性质决定了它是一种易于人工改造的细胞器，小分子量蛋白插入到油体蛋白的N端或C端后，不会影响到油体蛋白在植物油体上的定位和表达，形成的重组融合蛋白非常稳定，通过漂浮离心很容易将它与其他细胞成分分开，易于大规模的蛋白分离纯化。Chen等用三酰甘油酯、磷脂和油体蛋白合成了人工油体(AOB)，只有天然油体的1/10，通过一系列生理实验证明AOB保留了天然油体的特性而且非常稳定[7]。Peng等利用人工油体优化了油体-油体蛋白表达体系，在大肠杆菌中构建了“油体蛋白-Xa-GFP”表达载体，通过离心，oleosin-GFP全部富集到人工油体的表面，通过蛋白酶fe将GFP从嵌入油体的油体蛋白中分离，再一次离心，收集上清液得到高浓度的GFP[8]。Xu等利用大豆MkDa油体蛋白系统，构建了“油体蛋白-肠肽酶-水蛭素”植物表达载体，在转基因烟草中成功表达了重组蛋白，通过肠肽酶切割，分离得到了水蛭素M。kmBioSys公司利用油体-油体蛋白这一系统在拟南芥中表达人胰岛素，植物性胰岛素累积到种子总蛋白含量的0.13%[1°]，经后续试验优化后，种子中积累的胰岛素占种子蛋白总量的1.15%，达到商业应用水平。该公司还利用油体蛋白表达系统在红花中表达人胰岛素，每英亩红花所产的红花籽中能提取到1公斤的人胰岛素，能够有效填补市场需求，利用油菜油体蛋白系统生产水蛭素产品也已经进入商业化阶段。花生是重要的油料作物，是我国单产、总产和出口创汇最高的油料作物，占我国油料作物总产的50%，占世界花生总产的30%以上，花生已经在榨油、食品加工和化工等领域发挥着不可替代的作用。花生种子的含油量高达45-55%，蛋白含量达到25-30%，可以生食，也可作为食品加工的原材料，其蛋白质极易备人体吸收，吸收率在90%以上，所以花生是生物反应器的优良载体。人humanin蛋白具有广阔的临床应用前景，经检索，目前还没有关于在花生种子中利用油体蛋白表达系统表达人humanin蛋白的方法的报道。参考文献[1]HashimotoY,NiikuraΤ,ItoY,NishimotoI.MultiplemechanismsunderlieneurotoxicitybydifferenttypesofAlzheimer'sdiseasemutationsofamyloidprecursorprotein.BiolChem.2000,275(44):34541-34551.[2]HashimotoY,ItoY,NiikuraT,ShaoZ,HataM,OyamaF,NishimotoI.MechanismsofneuroprotectionbyanovelrescuefactorhumaninfromSwedishmutantamyloidprecursorprotein.BiochemBiophysResCommun.2001,283(2)460-468.[3]HashimotoY,NiikuraT,ItoY,SudoH,HataM,ArakawaE，AbeY,KitaY,NishimotoI.DetailedcharacterizationofneuroprotectionbyarescuefactorhumaninagainstvariousAlzheimer'sdisease-relevantinsults.JNeurosci.2002,21(23):9235-9245.[4]HashimotoY,NiikuraT,TajimaH,YasukawaT,SudoH,ItoY,KitaY,KawasumiM,KouyamaK,DoyuM,SobueG,KoideT,TsujiS,LangJ,KurokawaK,NishimotoI.ArescuefactorabolishingneuronalcelldeathbyawidespectrumoffamilialAlzheimer'sdiseasegenesandabeta.PNAS.2001,98:6336-6341.[5]XuX,ChuaCC,GaoJ,HamdyRC,ChuaBHL.Humaninisanovelneuroprotectiveagentagainststroke.Stroke,2006,37:2613-2619.[6]MuzumdarRH,HuffmanDM,AtzmonG,BuettnerC,CobbLJ,etal.Humanin:ANovelCentralRegulatorofPeripheralInsulinAction.PLoSONE2009,4(7):e6334.doi:10.1371/journal,pone.0006334[7]ChenMC,ChyanCL,LeeTT,etal.Constitutionofstableartificialoilbodieswithtriacylglycerol,phospholipid,andcaleosin.JAgricFoodChem.2004,16；52(12):3982-3987.[8]PengCC,ChenJC,ShyuDJ,etal,AsystemforpurificationofrecombinantproteinsinEscherichiacoliviaartificialoilbodiesconstitutedwiththeiroleosin-fusedpolypeptides.JBiotechnol.2004,111(1):51-7.[9]XuMY,LiuDH,LiGQ.Cloningofsoybean24kDaoleosingeneanditstransientexpressionasacarrierforforeignprotein.AgriculturalSciencesinChina,2004,3(5):321-329.[10]NykiforukCL,BootheJG,MurrayEff,etal.TransgenicexpressionandrecoveryofbiologicallyactiverecombinanthumaninsulinfromArabidopsisthalianaseeds.PlantBiotechnolJ.2006,(1):77-85.
发明内容针对现有技术的状况，本发明要解决的问题是提供一种利用油体蛋白系统在花生种子中表达人humanin蛋白的方法。本发明所述在花生种子中表达人humanin蛋白的方法，步骤包括(1)克隆花生油体蛋白基因Aholeosin及其启动子；(2)合成人humanin蛋白编码基因；(3)构建pCAMBIA2300-Aholeosin-humanin-OCS植物表达载体；(4)花生的转化；(5)转基因花生种子的获得；(6)WesternBlot检测转基因花生种子中humanin蛋白的表达；(7)从转基因花生种子中分离纯化并回收人humanin蛋白；其特征是所述克隆花生油体蛋白Aholeosin及其启动子的方法是提取花生基因组DNA，以其为模板，以带有EcoRI酶切位点GAATTC的正向引物AGAATTCAGGTCAACTACCATTCGT，和带有KpnI酶切位点GGTACC的反向引物GGTACCAGTTCTCTTTGAATCCTG，利用LATAQ酶进行PCR反应，PCR反应的程序为94°C5min;再94°C45sec，54°C45sec，72°C2min，;35循环；72°C7min；16°C保存PCR产物；将PCR产物与T载体连接，转化大肠杆菌细胞，选取抗性单克隆测序，确认携带Aholeosin及其启动子的克隆载体；所述合成人humanin蛋白编码基因的方法是设计并合成部分互补的两条单链DNA引物，其中正向引物包含KpnI酶切位GGTACC和点肠肽酶识别序列(GATGATGATGATAAG)GAAGGTACCGATGATGATGATAAGATGGCTCCACGAGGGTTCAGCTGTCTCTTACTTTTAACCAGTGAAATTGACCTGCC；反向引物包含Histag序列(CACCACCACCACCACCAC)和SalI酶切位点(GTCGAC):ACGCGTCGACTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCCCGCCTCTTCACGGGCAGGTCAATTTCACTGGTTAAAAGTAAGAGA,利用TAQ酶进行退火和延伸，程序为-MV3min；40°CImin；720C2min；16°C保存产物；将产物与T载体连接，转化大肠杆菌细胞，选取抗性单克隆测序，确认携带humanin基因的正确克隆载体；所述植物表达载体pCAMBIA2300-Aholeosin:humanin_0CS构建方法是将按照上述克隆方法获得的Aho1eosin及其启动子通过EcoRI和KpnI酶切位点连接到PCAMBIA2300-35S-0CS植物表达载体上，获得pCAMBIA2300-Aholeosin_0CS载体，再将按照上述克隆方法获得的humanin蛋白编码基因通过KpnI和MlI酶切位点连接到pCAMBIA2300-Aho1eosin-0CS载体上，获得pCAMBIA2300-Aholeosin-humanin_0CS植物表达载体；所述花生的转化方法是将带有目的基因的植物表达载体PCAMBIA2300-Aholeosin-humanin-0CS通过农杆菌介导的方法侵染花生；所述转基因花生种子的获得的方法是收获第二代转基因花生纯合体的花生种子；所述WfesternBlot检测转基因花生种子中人humanin蛋白表达的方法是用人humanin抗体作为一抗，辣根过氧化物酶作为二抗进行的免疫印迹杂交检测；所述从转基因花生种子中分离纯化并回收人humanin蛋白的方法是指将获得的花生种子粉碎，抽提液体，离心回收上层油相，得到含融合蛋白的液体；将融合蛋白经酶切后离心，去掉油相回收水相，经纯化获得人humanin蛋白。上述在花生中表达人huamnin蛋白的方法中所述植物表达载体中花生的油体蛋白基因和启动子、重组蛋白编码基因的连接顺序为“花生油体蛋白启动子+花生油体蛋白基因+肠肽酶识别位点+人humanin蛋白基因+终止子”。人humanin蛋白具有广阔的临床应用前景，利用原核系统重组蛋白往往没有活性或者活性很低，利用动物细胞作为生物反应器表达外源蛋白表达量低、成本高，植物生物反应器具有生产药用蛋白的优势。本发明提供的利用油体蛋白系统在花生种子中表达人humanin蛋白的方法实现了人humanin蛋白以融合的方式与转基因花生油体蛋白共同表达和高水平积累。本发明以花生作为受体植物，花生的种子作为表达蛋白的载体，采用花生油体蛋白基因和启动子的克隆，表达载体的构建，花生的遗传转化，人humanin蛋白基因的表达确认，重组蛋白的分离纯化和回收的方法，成功实现了利用花生种子作为生物反应器在转基因花生中高效、安全地表达人humanin蛋白，进而纯化回收蛋白。综上，本发明方法具有以下优点(1)花生含油量高，油体蛋白丰富，占种子总蛋白的10%以上，人humanin蛋白以融合的方式与花生油体蛋白共同表达，并高水平积累。(2)在花生中表达重组的humanin蛋白稳定性好，能够在花生种子中长期储存并保持活力，且运输方便。(3)花生栽培面积广，适应性强，利用油体蛋白的纯化体系、容易回收和纯化，具有易操作、成本低的优点，同时增加了农产品的附加值，为生物制药和分子农业新兴产业的发展提供技术支持。图1本发明所述植物表达载体pCAMBIA2300-Aholeosin-humanin-0CS构建示意图。具体实施例方式以下结合实例对本发明做进一步说明，但不限于此。实施例1包含启动子的花生油体蛋白基因的克隆根据Genbank中花生油体蛋白的启动子和编码基因的序列(基因登录号EF6卯400)，设计含有EcoRI酶切位点(GAATTC)的正向引物primerl:AGAATTCAGGTCAACTACCATTCGT；根据花生油体蛋白基因的开放阅读框序列，去掉中止密码子，设计带有KpnI酶切位点(GGTACC)的反向引物primer2:GGTACCAGTTCTCTTTGAATCCTG。提取花生(鲁花14)的基因组DNA，方法如下(1)取Ig的花生幼嫩叶片，用液氮研磨成粉，置于液氮预冷的Eppendof管中；(2)在65"C水浴中预热CTAB提取液O%CTAB,1.4mol/LNaCl，2(toimo/LEDTA(pH8.0),lOOmmol/LTris-Cl(pH8.0),2%pvp-40)；(3)估算样品组织的质量，每200mg样品中加700μL预热的CTAB提取液，迅速混勻，在65°C温浴10_30min，期间混勻2-5次；(4)加1倍体积的苯酚/氯仿/异戊醇(12121)，混勻；(5)12000rpm室温离心IOmin；(6)将上清转移至一新的离心管中；(7)用氯仿/异戊醇041)重复4-6步；(8)加0.7倍体积_20°C预冷的异丙醇，颠倒混勻，室温放置IOmin；(9)12000rpm室温离心15min；(10)倒掉上清，用500μ1_20°C预冷的70%乙醇洗沉淀2-3次；(11)沉淀干燥后，用50μ1去离子水或TE溶解DNA，置于_20°C备用。(12)吸取5μ1溶解的DNA，加入45μ1去离子水，混勻待用。花生油体蛋白启动子和基因的PCR扩增以上述primerl，primer2为引物，花生基因组DNA为模板，PCR扩增得到花生油体蛋白的启动子和全长基因。反应程序如下模板DNA1μl,2XLATaqmix10μ1,primerl(10μΜ)0·5μ1，primer2(10μΜ)0·5μ1，ddH208·0μ1。在PCR仪(TaKaRaΤΡ650)上设置94°C5min,随后94°C45sec,54°C45sec,72°C2min,共；35个循环后72°C7min结束反应。花生油体蛋白启动子和基因序列的获得取PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，胶回收2100bp左右的目的条带，连接T载体(pMD18-T，TaKaRa，Dalian)，连接体系10μ1回收产物4μ1，pMD18_T载体1μ1，SolutionI5μ1，16°C下进行连接反应4h以上，连接产物转化大肠杆菌DH5a细胞。大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备用无菌接种环挑取_70°C甘油保存的E.coliDH5α，通过划线稀释的方法经37°C培养16_20h，在平板上得到DH5α的单菌落；挑一单菌落于3ml的LB液体培养基，180rpm振荡培养12h；取ImlDH5aLB菌液于100ml的LB液体培养基，180rpm振荡培养到OD值0.4；冰上放置15min，无菌条件下转入50mlBeckman离心管中，4°C，4500rpm离心lOmin，弃上清；沉淀用30ml冰预冷的0.IMCaCl2溶液重悬；4°C，4500rpm离心lOmin，小心倒出上清液；沉淀重悬于2ml冰预冷的含15%甘油0.IMCaCl2溶液；将这些感受态细胞按每份70μ1分装，-80°C保存。大肠杆菌的转化将上述10μ1的连接液加入70μ1DH5α感受态细胞中混勻，冰上放置30min，42°C热激90sec，冰浴5min，加入150μ1液体LB(NaCl10g/L,Tryptone10g/L，Yeastpowder5g/L)，37°C120rpm振荡培养lh，将菌液均勻涂抹布在含有100μg/ml的氨苄青霉素的固体LB培养基上(NaCl10g/L,Tryptone10g/L,Yeastpowder5g/L，Agarpowder15g/L)，37°C培养过夜。挑取单菌落到4mL液体LB中，37°C摇菌8_10h，提取质粒DNA(Omega)，分别用(Ec0RI、KpnI)双酶切验证，对阳性克隆用M13通用引物进行测序验证(见序列表SEQIDNo.1)，得到克隆载体T-AhOleosin质粒。实施例2人Humanin基因的合成根据Genbank中humanin基因(NPJ)Ol1776；35)序列，设计并合成部分互补的两条单链DNA引物，其中正向引物包含KpnI(GGTACC)位点和肠肽酶识别序列(GATGATGATGATAAG)primer3:GAAGGTACCGATGATGATGATAAGATGGCTCCACGAGGGTTCAGCTGTCTCTTACTTTTAACCAGTGAAATTGACCTGCC；反向引物包含Histag序列(CACCACCACCACCACCAC)和Sail酶切位点(GTCGAC)primer4:ACGCGTCGACTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCCCGCCTCTTCACGGGCAGGTCAATTTCACTGGTTAAAAGTAAGAGA。利用TAQ酶进行退火和延伸，primer3(100μΜ)1μ1，primer4(100μΜ)1μ1，程序为94°C3min；40°CImin；72°C2min；16°C保存产物；产物经1%琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果，胶回收目的条带，将回收产物与T载体连接，按实施例1中的方法转化大肠杆菌DH5ci细胞，选取抗性单克隆测序，确认携带humanin基因的正确克隆(见序列表SEQIDNo.2)，得到克隆载体T-humanin质粒。实施例3植物表达载体的构建植物表达载体的构建过程如图1所示(1)将花生油体蛋白启动子和ORF连接到pCAMBIA2300-35S-0CS植物表达载体，此植物表达载体骨架来源于Cambia公司，由中国科学院遗传与发育生物学研究所改造(Luoetal.Journalofintegrativeplantbiology,2005，47(6)，745—752):将PCAMBIA2300-35S-0CS质粒和T-AhOleosin质粒分别用EcoRI和KpnI双酶切，回收载体序列和AhOleosin序列，用T4DNA连接酶将两者进行连接=IOXiMDNAligasebuffer1μ1，AhOleosin6μ1，pCAMBIA23002μ1，Τ4DNAligase1μ1，16°C连接过夜，连接产物按实施例1中的方法转化大肠杆菌DH5α，用EcoRI和KpnI双酶切验证正确克隆，得到pCAMBIA2300-Ah01eosin-0CS表达载体。将人humanin蛋白基因连接到pCAMBIA2300-Ah01eosin_0CS表达载体将pCAMBIA2300-Ah01eosin-0CS质粒和T-humanin质粒分别用KpnI和Mil双酶切，回收载体序列和humanin序列，用T4DNA连接酶将两者进行连接:10XT4DNAligasebuffer1μ1，humanin6μ1,pCAMBIA2300-Ah01eosin_0CS2μ1,T4DNAligase1μ1，16°C连接过夜，连接产物按实施例1中的方法转化大肠杆菌DH5α，用KpnI和Mil双酶切验证正确克隆，得到pCAMBIA2300-Ah01eosin-humanin-0CS表达载体。(2)表达载体的农杆菌转化制备农杆菌EHA105的感受态细胞挑取农杆菌EHA105单菌落到:3mlLB培养基(含利福平25μg/ml)摇菌过夜；然后取Iml接种到50ml液体LB培养基中(含利福平50μg/ml)J8°C扩大培养，200rpm震荡培养至OD600=0.5；冰浴IOmin,4°C4500rpm，离心IOmin；菌体用50ml预冷的0.IMCaCl2重悬，4°C4500rpm再次离心IOmin；收集的菌体加入aiil20mMCaCl2悬浮液(含15%的甘油)，80μ1/管分装，液氮速冻后_80°C保存。重组质粒转化农杆菌取pCAMBIA2300-Ah01eosin-humanin-0CS质粒5μ1加入80μ1ΕΗΑ105农杆菌感受态细胞，冰上放置30min；液氮中速冻90sec；37°C水浴快速解冻，3min；加入800μ1LB培养基，观°C，150rpm震荡培养池；瞬间离心，去上清，将菌体带200μ1LB涂布在加有25μg/ml利福平和50μg/ml卡那霉素的LB平板上培养2-3d。取1μ1菌液做模板进行PCR验证，分别以3对引物(primerl，primerf)、(primer3、primer4)、(primerl,primer4)进行PCR验证，经PCR验证正确的克隆摇菌，-80°C保存菌株。实施例4花生的遗传转化和转基因花生种子的获得(1)花生胚轴的遗传转化外质体的制备成熟花生种子去外壳，用70%乙醇浸种lmin，无菌水冲洗3次，再用0.升汞(w/v)处理15-25min，然后用无菌水冲洗4_6遍，灭菌期间不断摇动种子，以保证种子表面灭菌彻底。剥去种皮，将胚接种于萌发培养基(蔗糖3(^/1，琼脂0.7%，1^大量元素，MS微量元素)上，胚轴深入培养基中，培养4d左右取胚轴作为外植体。培养温度25士1°C，光照强度35001ux。花生胚轴外植体的侵染新鲜培养的含植物表达载体的农杆菌EHA105，5000g/min离心收集菌体，重悬于液体诱导培养基中，农杆菌感染的最佳浓度为OD6tltl=0.5-0.8。手术刀切取萌动4d的花生胚轴，在农杆菌悬浮液中浸泡25-30min，取出外植体在滤纸上吸去多余的菌液，然后接种到诱导分化培养基(MS+蔗糖30g/l，琼脂0.7%，6-BA10mg/l,NAA0.8mg/l)上，暗处共培养2d。选择培养基及转化植株再生共培养后，将外植体接到含有500mg/L羧苄青霉素的诱导分化培养基上恢复培养7d，再接到含有10mg/L潮霉素和500mg/L羧苄青霉素的诱导分化培养基上进行筛选，培养7d后转接到含有25mg/L潮霉素的诱导分化培养基上进一步筛选，大约3-4周后出现丛生芽点，以后每2周更换一次新鲜培养基。待丛生芽长到l-2cm时将其切下，移至分化伸长培养基(MS+蔗糖30g/L，琼脂0.7%，GA34mg/l,6-BA2mg/l)上，潮霉素浓度降至10mg/l，当小苗长至3-5cm时，将其移至生根培养基(1/2MS+蔗糖30g/L，琼脂0.7%,NAA2.Omg/1)中，炼苗、转基因植株的移栽。(2)转基因花生种子的获得收获花生种子，种植并收获第二代种子，提取DNA进行PCR检测和Southern杂交，验证转基因植株，获得转基因花生种子。实施例5WesternBlot检测转基因花生种子中humanin蛋白的表达从转基因花生种子中提取重组蛋白(1)取0.5g干种子于8ml提取缓冲液(蔗糖0.6M，KClIOmM,MgCl2ImM,Tris-Cl0.15MpH7.5)中，勻浆。(2)12000rpm离心20min，取油相。(3)加入提取缓冲液重悬混勻，12000rpm离心20min，收集油相。(4)加入5ml漂浮缓冲液(蔗糖0.4M,KClIOmM,MgCl2ImM,Tris-Cl0.15MpH7.5)重悬，12000rpm离心20min,收集油相。(5)加入NaHCO3冰浴3Omin,12000rpm离心2Omin,收集油相。(6)用过量丙酮在0°C抽提3次，去除三酰甘油吹干沉淀的蛋白，然后溶于适量无菌水中。WesternBlot杂交(1)将提取的重组蛋白50μg通过12%的SDS-PAGE胶电泳分离。(2)电泳结束后将胶切割成合适的大小，用转膜液平衡3次，每次5分钟。(3)将硝酸纤维素膜用蒸馏水润洗，用电转方法将胶上的蛋白质转到膜上。(4)转后将膜放入染色液中50s，在50%的甲醇中脱色至背景清晰，然后用双蒸水清洗。(5)用0.OlMPBS(NaCl8.0g,KCl0.2g,Na2HPO41.44g,KH2PO40.24g加H2O定容至1000ml)洗膜3次，每次15min，然后用3%明胶浸泡洗3h，封闭非特异位点的。(6)将膜取出，用0.OlMPBS洗2次，每次lOmin。(7)力口入用PBS稀释1000倍的一抗(Monoclonalanti-humanBMP7antibody)，室温结合2h，阴性对照用1%的BSA。(8)弃一抗和BSA，用0.OlM的PBS洗膜4次，每次5min。(9)加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(用PBS稀释2000倍)，室温轻摇池。(10)弃二抗，用PBS洗膜4次，每次5min。(11)加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。实施例6从转基因花生种子中大规模分离并回收人humanin蛋白人humanin蛋白分离并回收，将转基因花生种子勻浆、压榨；离心后去掉沉淀(种子纤维等)，回收上层的油相，清洗后、离心再取上层的油相；加入肠肽酶进行酶消化反应，离心去掉上层的油相，回收水相经纯化得到人humanin蛋白。权利要求1.一种在花生种子中表达人humanin蛋白的方法，步骤包括(1)克隆花生油体蛋白基因Aholeosin及其启动子；(2)合成人humanin蛋白编码基因；(3)构建pCAMBIA2300_Aholeosin-humanin-OCS植物表达载体；(4)花生的转化；(5)转基因花生种子的获得；(6)WesternBlot检测转基因花生种子中humanin蛋白的表达；(7)从转基因花生种子中分离纯化并回收人humanin蛋白；其特征是所述克隆花生油体蛋白Aholeosin及其启动子的方法是提取花生基因组DNA，以其为模板，以带有EcoRI酶切位点GAATTC的正向引物AGAATTCAGGTCAACTACCATTCGT，和带有KpnI酶切位点GGTACC的反向引物GGTACCAGTTCTCTTTGAATCCTG，利用LATAQ酶进行PCR反应，PCR反应的程序为94°C5min;再94°C45sec，54°C45sec，72°C2min，;35循环；72°C7min；16°C保存PCR产物；将PCR产物与T载体连接，转化大肠杆菌细胞，选取抗性单克隆测序，确认携带Aholeosin及其启动子的克隆载体；所述合成人humanin蛋白编码基因的方法是设计并合成部分互补的两条单链DNA引物，其中正向引物包含KpnI酶切位GGTACC和点肠肽酶识别序列(GATGATGATGATAAG)GAAGGTACCGATGATGATGATAAGATGGCTCCACGAGGGTTCAGCTGTCTCTTACTTTTAACCAGTGAAATTGACCTGCC；反向引物包含Histag序列(CACCACCACCACCACCAC)和SalI酶切位点(GTCGAC):ACGCGTCGACTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGCCCGCCTCTTCACGGGCAGGTCAATTTCACTGGTTAAAAGTAAGAGA,利用TAQ酶进行退火和延伸，程序为-MV3min；40VImin；720C2min；16°C保存产物；将产物与T载体连接，转化大肠杆菌细胞，选取抗性单克隆测序，确认携带humanin基因的正确克隆载体；所述植物表达载体pCAMBIA2300-Aholeosin:humanin_OCS构建方法是将按照上述克隆方法获得的Aholeosin及其启动子通过EcoRI和KpnI酶切位点连接到PCAMBIA2300-35S-0CS植物表达载体上，获得pCAMBIA2300-Aholeosin_0CS载体，再将按照上述克隆方法获得的humanin蛋白编码基因通过KpnI和MlI酶切位点连接到pCAMBIA2300-Aho1eosin-OCS载体上，获得pCAMBIA2300-Aholeosin-humanin_0CS植物表达载体；所述花生的转化方法是将带有目的基因的植物表达载体pCAMBIA2300-AholeoSin-humanin-OCS通过农杆菌介导的方法侵染花生；所述转基因花生种子的获得的方法是收获第二代转基因花生纯合体的花生种子；所述WesternBlot检测转基因花生种子中人humanin蛋白表达的方法是用人humanin抗体作为一抗，辣根过氧化物酶作为二抗进行的免疫印迹杂交检测；所述从转基因花生种子中分离纯化并回收人humanin蛋白的方法是指将获得的花生种子粉碎，抽提液体，离心回收上层油相，得到含融合蛋白的液体；将融合蛋白经酶切后离心，去掉油相回收水相，经纯化获得人humanin蛋白。2.根据权利要求1所述的在花生中表达人huamnin蛋白的方法，其特征是所述植物表达载体中花生的油体蛋白基因和启动子、重组蛋白编码基因的连接顺序为“花生油体蛋白启动子+花生油体蛋白基因+肠肽酶识别位点+人humanin蛋白基因+终止子”。全文摘要本发明公开了一种在花生种子中表达人humanin蛋白的方法，是利用基因工程手段将humanin蛋白编码基因连接到油体蛋白基因的3’端，构建由油体蛋白启动子驱动的“油体蛋白-肠肽酶-人humanin蛋白”植物表达载体，转化花生，重组蛋白伴随着油体的积累在花生种子中高水平的表达，然后离心分离出融合蛋白，将融合蛋白用外切蛋白酶消化后离心，去掉油相回收水相，经纯化获得人humanin蛋白。本发明方法获得的重组蛋白安全、活性高、非常容易回收和纯化，而且可以在花生种子中长期的储存、运输方便，大大提升了作物的附加值。文档编号C12N15/84GK102321665SQ20111029350公开日2012年1月18日申请日期2011年9月29日优先权日2011年9月29日发明者夏晗,李爱芹,李长生,毕玉平,王兴军,肖寒,赵传志申请人:山东省农业科学院高新技术研究中心