专利名称：Ing4与osm双基因共表达载体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于腺病毒载体领域，具体涉及一种将ING4和OSM基因插入载体中形成重组载体并以此制备得到的腺病毒载体以及所得腺病毒载体的应用。
背景技术：
现有技术中，从基因方面着手探讨喉癌发生、发展机制以及治疗方法成为了近年来癌症研究的重点方向之一。肿瘤基因治疗就是将目的基因用基因转移技术导入靶细胞， 使其发挥特定的功能，继而执行对肿瘤的杀伤和抑制作用，或保护正常细胞免受化学治疗和放射治疗的损伤。自1990年Rosenberg等首次利用逆转录病毒载体基因转移技术治疗晚期癌症以来，肿瘤基因治疗有了突飞猛进的发展，越来越多的肿瘤基因治疗药物被批准进入临床试验，基因治疗有望在不久的将来成为肿瘤治疗的又一常规手段。为使众多目的基因具有更高的靶向性，杀伤性与稳定性，在载体选择方面，要从对基因表达的时间长短， 靶细胞转导效率，可能产生的毒副作用等方面综合权衡。虽然腺病毒载体在体内应用时仍存在作用时间短等问题，但因其可以感染分裂和非分裂细胞、病毒滴度高、不整合到宿主染色体中、能够同时表达多种基因等优点而被广泛用于肿瘤的基因治疗中。由于肿瘤的发生和发展是一个多阶段、多因素的复杂过程，涉及多种基因的异常，因而多基因联合治疗、从多个环节控制肿瘤的发生和发展往往显得更为合理。ING4基因是近年来发现的ING (inhibitor of growth family，肿瘤生长抑制因子)家族成员之一，它由Siiseki等在2003年首次发现得到，后来被确定为一种重要的肿瘤生长抑制因子。ING4基因定位于人染色体12pl3. 3，大小约131Λ，有8个外显子和7个内含子组成，cDNA全长1380bp，编码248个氨基酸，其编码蛋白位于细胞核内，在人类正常组织中均有表达。ING4广泛参与基因转录的调控、细胞的增殖、凋亡和衰老、细胞接触抑制、血管生成抑制、DNA的损伤修复以及肿瘤转移侵袭的抑制。研究表明，ING4基因在多种肿瘤中易发生缺失突变或表达下调，并与肿瘤发生和肿瘤恶性程度密切相关。近年来，不少研究将 ING4基因包装进腺病毒，通过腺病毒载体将ING4基因导入人类多种肿瘤细胞中，包括人肺腺癌细胞系A549、前列腺癌细胞、恶性黑色素瘤细胞系M14，结果显示，Ad-ING4感染的肿瘤细胞生长受到抑制，凋亡率明显高于感染空腺病毒载体的细胞组，可见ING4基因表达对肿瘤细胞有抑制生长、诱导凋亡的作用。Gimduz等研究发现ING4基因在头颈部鳞癌中表达有所下降，推断其在头颈部肿瘤中具有重要作用，但其功能与机制尚有待进一步研究。0SM(oncostatin Μ)最初是由Zarling 等从U937组织型淋巴瘤细胞( histiocytic Iymp homacells)培养上清液中分离的一种对A375黑色素瘤细胞有生长抑制作用的细胞因子，隶属于IL-6超家族，该家族成员包括IL-6，IL-11，LIF, ciliary neurotro-phic factor (CNTF), cardiotropin-l (CT-I), novel neutrophin-l/B cell -stimulating factor-3 (NNT-l/BSF-3 )等，他们由于受体结构类似(均含有gpl30等基本亚单位)而具有相似的功能。由于OSM在结构、功能以及遗传性能上类似于leukemia inhibitory factor (LIF)，因此曾一度被认为是另一种LIF，但OSM亦具有很多独特的性能，包括抑制肿瘤细胞生长，刺激造血，炎症反应、促进巨噬细胞分化，对神经营养肽的诱导作用，调节胆固醇代谢以及对骨细胞的作用。人类抑瘤素M (hOSM)是一种耐热、耐酸的单链糖蛋白，其分子量为观000，基因定位于22号染色体ql2上，cDNA编码252个氨基酸，它是一种能抑制肿瘤细胞增殖和促进正常成纤维细胞生长的多肽，已报道OSM对黑色素瘤、 肺癌、乳腺癌、肝癌等多种实体瘤具有抑制作用，其作用机制可能与下述因素有关与其受体结合后，通过JAK/STAT信号传导途径，作用于靶基因，如CDKIS的P21WAF1/CIPI，P27KLPI 等，使细胞生长阻滞；通过下调癌基因如抑制如c-myc的表达而抑制细胞增殖；或通过免疫效应抑制细胞增殖。目前已经有不少研究利用腺病毒介导OSM基因来进行肿瘤基因治疗， 如胰腺癌、肝癌、黑色素瘤。如上所述，ING4是一种新型的肿瘤生长抑制因子，它主要在细胞内发挥抑瘤作用； OSM具有广谱的抑癌效应，主要在细胞外发挥作用；二者一旦发生基因缺失或突变常会导致多种肿瘤的发生。放射治疗是肿瘤治疗的重要方法之一，但即使是治疗剂量的放射线也对人体有不同程度的损伤，这在很大程度上限制了放疗的应用与发展。肿瘤的基因-放射治疗(gene-radiotherapy)是近年提出的肿瘤治疗新思路，其原理是将辐射诱导基因 (radiation-inducible gene)的调控序列与肿瘤杀伤基因相偶联转染进肿瘤细胞，在对肿瘤实施局部照射时诱导基因表达，通过射线与基因的双重作用杀伤肿瘤。肿瘤的基因-放射治疗不但可以进一步提高疗效，还能在保证疗效的前提下降低放射剂量，减少对人体的损伤。研究表明，ING4基因可以提高胰腺癌细胞对放疗的敏感性，OSM基因在黑色素瘤中可以被射线诱导增强表达，从而达到基因与射线的双重抑瘤效果，但ING4以及OSM在喉癌中是否具有放疗增敏效应尚未见报道。综上所述，现有技术中并未见到有关ING4和OSM双基因共表达质粒载体和腺病毒载体的构建和共表达的报道，对ING4和OSM基因共表达的两种蛋白产物，在肿瘤治疗中能否发挥抑制肿瘤细胞及其移植瘤的生长和诱导肿瘤细胞凋亡等的协同或叠加抑癌效应。特别是二者的联合对肿瘤放射治疗能否发挥放疗增敏效应、增强放疗效果，至今国内外均未见报道，为此现已成为当今肿瘤治疗中的研究热点，也是肿瘤治疗中为提高肿瘤治疗的疗效急切需要解决的难题。
发明内容
本发明的发明目的是提供一种含有ING4和OSM基因的重组转移质粒、含有ING4 和OSM基因的重组腺病毒载体，使得腺病毒介导的ING4和OSM双基因可以在肿瘤细胞中稳定转录及表达，并呈现明显的抑瘤增效协同作用。为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是一种含有ING4和OSM基因的重组转移质粒，所述含有ING4和OSM基因的重组转移质粒为pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-pr omoter—OSM。上述技术方案中，所述重组转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM 以转移质粒 pAdTrack-CMV-polyA-promoter 为基础，并且在 pAdTrack-CMV-polyA-promoter的多克隆位点的Bgl II, Sal I之间插有酶切扩增出的 ING4片段，在Not I、Hind III酶切位点之间插有酶切扩增出的OSM片段。
上述技术方案中，所述重组转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-0SM 的制备方法为在已有的pAdTrack-CMV-polyA-promoter改造转移质粒基础上，在多克隆位点的 Bgl II,Sal I 之间插入酶切的 ING4 片段，构建pA(Trrack-CMV-ING4-poly-A-promo ter单基因重组转移质粒，然后在pAdTrack-CMV- ING4-poly-A-promoter重组转移质粒的 Not I、Hind III酶切位点之间插入酶切扩增出的OSM片段构建得到pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM 重组转移质粒。上述技术方案中，pAdTrack-CMV-polyA-promoter改造转移质粒的制备方法可参考文献.盛伟华，谢宇锋，杨吉成.Ad-ING4-P0lyA-Pr0m0ter-IL-M双基因共表达载体构建及表达.中华微生物学和免疫学杂志，2010，30 (8) =695-703 (通迅作者杨吉成)。进一步的技术方案中，将重组转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter -OSM与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒采用氯化钙法共转化BJ5183感受态细菌，筛选后经 PacI酶切后再用脂质体转染QBH93A细胞，经多轮感染和扩增后获得重组腺病毒载体 Ad-ING4-0SM。本发明同时要求保护上述重组腺病毒载体Ad-ING4_0SM。上述重组腺病毒载体Ad-ING4_0SM能抑制肿瘤细胞生长并诱导其凋亡，这种作用显著优于Ad-ING4、Ad-OSM单基因组，而且还呈现明显的抑瘤增效协同作用；因此，本发明要求保护上述重组转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-0SM、重组腺病毒载体 Ad-ING4-0SM在制备治疗癌症药物中的应用；优选地，所述癌症包括喉癌、肺癌。上述重组腺病毒载体Ad-ING4_0SM在治疗喉癌时具有放疗增敏作用，因此，本发明同时要求保护上述重组转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-0SM、重组腺病毒载体Ad-ING4-0SM在制备放疗增敏药物中的应用；优选地，所述放疗增敏药物为治疗喉癌的放疗增敏药物。由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点 1、本发明成功构建了 ING4和OSM双基因共表达腺病毒载体。2、本发明所述Ad-ING4_0SM双基因共表达在体内外均能抑制人喉癌Hep_2细胞及其裸鼠移植瘤的生长并诱导其凋亡，这种作用显著优于Ad-ING4、Ad-OSM单基因组 (/X0. 05)，而且还呈现明显的抑瘤增效协同作用1. 18，Q#rt=1.38)；在体外能抑制 SPC-Al肺腺癌细胞的生长并诱导其凋亡，这种作用显著优于Ad-ING4、Ad-0SM单基因组，而且还呈现明显的抑瘤增效协同作用。3、本发明所述Ad-ING4_0SM双基因共表达更具显著上调P21、P27、Bax、Caspase_3 和下调Survivin、Cox-2、Bcl-2等细胞周期和凋亡相关蛋白的表达；Ad-ING4_0SM双基因共表达更具显著下调肿瘤血管形成因子CD34表达的效应。
附图1.实施例一中ING4和OSM双基因共表达模式示意图； 附图2.实施例一中pAdTrack-CMV转移质粒图谱；
附图3A.实施例一中pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter重组转移载体构建和鉴定；A pAdTrack-CMV- ING4-poly-A-promoter 重组转移载体质粒 PCR 鉴定M: DL2000Marker ； 1: ING4 目的条带；附图3B.实施例一中pAdTrack-CMV-OSM-polyA-promoter重组转移载体质粒Bgl II、 Sal I双酶切鉴定M: DL2000Marker; 1:载体质粒条带和ING4目的条带；
附图4A.实施例一中pAdTrack-CMV-ING4-polyA+promoter-0SM重组转移载体质粒 PCR 鉴定M: DL2000Marker ； 1: OSM 目的条带；
附图4B.实施例一中pAdTrack-CMV-ING4- polyA+promoter -OSM重组转移载体质粒 Not I, Hind III双酶切鉴定Μ: DL2000Marker ； 1:载体质粒条带和OSM目的条带；
附图5.实施例一中同源重组克隆质粒(BJ5183)琼脂糖电泳分子量大小鉴定，其中，1、2 为 pAdEasy-l-pAdTrack-CMV-ING4- polyA+promoter-OSM 同源重组阳性克隆；3 pAdEasy-1 -pAdTrack-CMV-ING4- polyA+promoter-OSM 同源重组阴性克隆；4 为 pA(Trrack-CMV-ING4-poly-A-CMV-0SM转移质粒；5普通的同源重组质粒； 附图6.实施例一中各组基因重组腺病毒感染QBH93A细胞照片； 附图 .实施例一中RT-PCR鉴定ING4和/或OSM基因在QBH93A细胞中的转录，其中，1.PBS ； 2. Ad-GFP ；3. Ad-ING4 ；4. Ad-OSM ； 5. AD-ING4-0SM ；6. 2kb DNA Marker ； 附图8.实施例二中喉癌Hep-2细胞感染病毒后白光与荧光照片； 附图9.实施例二中腺病毒介导的ING4和/或OSM基因在喉癌Hep-2细胞中的转录鉴定，其中，l.PBS ;2. Ad-GFP ;3. Ad-ING4 ；4. Ad-OSM ；5. AD-ING4-0SM ；6. 2kb DNA Marker ； 附图10.实施例二中OSM和ING4蛋白表达的Wfestern blot鉴定，其中，1. PBS ； 2.Ad-GFP ；3. Ad-ING4 ；4. Ad- OSM ；5.Ad_ING4- OSM ；
附图11.实施例二中不同剂量重组腺病毒对喉癌Hep-2细胞的作用； 附图12.实施例二中重组腺病毒对喉癌H印-2细胞的生长抑制曲线，注ING4、OSM单基因重组腺病毒组分别与PBS，Ad-GFP组比较，P < 0. 05 ；Ad-ING4-0SM双基因组分别与 Ad-ING4、Ad-OSM 单基因重组比较，P < 0. 05 ；
附图13.实施例二中Hochest33258染色检测喉癌ifep-2细胞凋亡的核形态学变化 (X100)；
附图14.实施例二中FCM检测各组腺病毒对喉癌Hep-2细胞细胞周期的影响；注 Ad-ING4、Ad-OSM以及AD-ING4-0SM分别与细胞对照组(PBS组)和Ad-GFP阴性对照组相比，ρ<0· 05 ；
附图15.实施例二中流式细胞仪对喉癌Hep-2细胞凋亡率测定的结果； 附图16.实施例二中RT-PCR分析H印-2细胞P21、P27、P53和Survivin的mRNA转录水平，其中，1. PBS ;2. Ad-GFP ;3. Ad-ING4 ；4. Ad-OSM ；5. AD-ING4-0SM ；
附图17.实施例二中喉癌!fep-2细胞凋亡相关基因的半定量分析结果；注ING4、OSM 单基因重组腺病毒组分别与PBS,Ad-GFP组比较，P < 0. 05 ；Ad-ING4-0SM双基因组分别与 Ad-ING4、Ad-OSM 单基因组比较，ΔΡ < 0. 05 ；
附图18A.实施例三中五组人喉癌!fep-2细胞裸鼠移植瘤的瘤体照片，其中，1. Ad-ING4-0SM ；2. Ad-OSM ；3.Ad_ING4 ；4. Ad-GFP ；5. PBS ；
附图18B.实施例三中Ad-0SM、Ad-ING4、Ad-ING4-0SM对人喉癌移植瘤移植瘤治疗后体积变化曲线；
附图18C.实施例三中各组腺病毒作用后喉癌裸鼠移植瘤平均重量变化；注ING4、0SM 单双基因腺病毒组分别与PBS，Ad-GFP组比较，P < 0. 05 ；Ad-ING4_0SM组分别与Ad_ING4、Ad-OSM单基因重组腺病毒组比较，P < 0. 05 ；
附图18D.实施例三中各组腺病毒对喉癌裸鼠移植瘤的抑制率；注Ad-ING4-0SM组分别与Ad-ING4、Ad-OSM单基因重组腺病毒组比较，P < 0. 05，Q=L 38 ；
附图19.实施例四中各组腺病毒对喉癌Hep-2细胞的抑制作用；单纯放疗组、 Ad-ING4-0SM双基因重组腺病毒组分别与细胞对照组，Ad-GFP空载体腺病毒组比较，P
<0. 05 ；基因联合放疗组分别与单纯放疗组、Ad-ING4-0SM双基因重组腺病毒组比较，P
<0. 05，Q=L 21 ；
附图20A.实施例四中各组腺病毒对喉癌Hep-2细胞相关基因表达变化的影响；其中， 1.细胞对照组；2. Ad-GFP ;3. AD-ING4-0SM ；4. 8Gy ；5. AD-ING4-0SM +8Gy ；
附图20B.实施例四中细胞凋亡相关基因的半定量分析结果；单纯放疗组、 Ad-ING4-0SM双基因重组腺病毒组分别与细胞对照组，Ad-GFP空载体腺病毒组比较，P
<0. 05 ；基因联合放疗组分别与单纯放疗组、Ad-ING4-0SM双基因重组腺病毒组比较，P
<0. 05 ；
附图21.实施例四中检测各组喉癌细胞细胞周期变化结果；放疗组、Ad-ING4-0SM组以及AD-ING4-0SM+放疗组分别与细胞对照组(PBS组)和Ad-GFP阴性对照组相比，p<0. 05 ； 附图22.实施例四中流式细胞仪对喉癌Hep-2细胞凋亡率测定的结果；放疗组、 Ad-ING4-0SM 组、Ad-ING4_0SM 联合放疗组分别与 PBS，Ad-GFP 组比较，P < 0. 05 ； Ad-ING4-0SM联合放疗组分别与放疗组、Ad-ING4-0SM组比较，P < 0. 05 ； 附图23A.实施例四中喉癌裸鼠移植瘤实物附图23B.实施例四中喉癌裸鼠移植瘤体积-时间变化曲线；放疗组、Ad-ING4-0SM组、 Ad-ING4-0SM联合放疗组分别与PBS，Ad-GFP组比较，P < 0. 05 ；Ad-ING4-0SM联合放疗组分别与放疗组、Ad-ING4-0SM组比较，P < 0. 05 ；
附图23C.实施例四中喉癌裸鼠移植瘤平均重量变化；放疗组、Ad-ING4-0SM组、 Ad-ING4-0SM联合放疗组分别与PBS，Ad-GFP组比较，P < 0. 05 ；Ad-ING4-0SM联合放疗组分别与放疗组、Ad-ING4-0SM组比较，P < 0. 05 ；
附图23D.实施例四中不同因素对喉癌裸鼠移植瘤的抑制率；Ad-ING4-0SM联合放疗组分别与放疗组、Ad-ING4-0SM组比较，P < 0. 05，Q=L 17 ；
附图24A.实施例四中各组瘤组织中ING4/0SM表达的检测；
附图MB.实施例五中重组腺病毒对凋亡、细胞周期、血管生成相关因子表达的影响； 附图25.实施例五中腺病毒介导的ING4和/或OSM基因在SPC-Al肺腺癌细胞中的转录鉴定(RT-PCR)，其中，1. PBS ；2. AdV ；3. Ad_ING4 ；4. Ad-OSM ；5. Ad-ING4_0SM ；
附图26.实施例五在SPC-Al肺腺癌细胞中ING4和OSM蛋白表达的Wfestern blotting 鉴定，其中，1. Ad-ING4 ；2Ad-ING4-0SM ；3. Ad-OSM ；4. Adv ；5. PBS ；
附图27.实施例五中Ad-ING4-0SM等对SPC-Al肺腺癌细胞生长的影响； 附图28A.实施例五中PI染色法检测Ad-ING4-0SM对SPC-Al肺腺癌细胞周期的流式测定结果；
附图^B.实施例五中PI染色法检测Ad-OSM对SPC-Al肺腺癌细胞周期的流式测定结
果；
附图^C.实施例五中PI染色法检测Ad-ING4对SPC-Al肺腺癌细胞周期的流式测定结果；
附图29.实施例五中流式细胞仪检测Ad-ING4-0SM等对SPC-Al肺腺癌细胞凋亡率测定的结果比较；
附图30.实施例五中RT-PCR检测SPC-Al细胞中凋亡相关基因，其中，l.PBS ;2. Ad; 3. Ad-ING4 ；4. Ad-OSM ；5.Ad-ING4_0SM ；
附图31.实施例五中Wfestern blotting检测SPC-A1细胞中Caspase-3的表达，其中， PBS；2. Ad ；3.Ad-ING4 ；4. Ad-OSM ；5. Ad-ING4_0SM。
具体实施例方式下面结合附图及实施例对本发明作进一步描述 实施例一基因重组腺病毒载体的构建及其检测
材料Bgl II, Sal I、Not I、Hind III 限制性内切酶、T4DNA 连接酶、Taq DNA 聚 ^ Sl> dNTPmix Oligo d(T)18> DL2000marker> Ribonuclease Inhibitor 自 TaKaRa 公司；逆转录酶 MMLV、Lambda DNA/HindIII marker 购自 MBI 公司；PmeI、PacI 购自 New EnglandBiolads公司；日常型小量质粒抽提试剂盒、PCR产物清洁试剂盒、DNA胶回收试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司；pAcWrack-CMV-ING4-IRES-hOSM质粒、pAdTrack-CMV-poly-A-promoter 质粒、QBI-293A 包装细胞、pAdTrack-CMV-polyA +promoter-OSM质粒、pAdEasy-1骨架质粒、大肠杆菌DH5 α、BJ5183细菌、空载体腺病毒Ad-GFP等均为本实验室保存；引物i3-actin、ING4、OSM基因引物(如表1)均由上海 Sangon合成；RPMI-1640购自美国Hyclone公司；胎牛血清购自杭州赛乐生物有限公司；6 孔细胞培养板购自CORNING公司；UNIQ-IO柱式Trizol总RNA抽提试剂盒、酵母提取物、 胰蛋白胨、琼脂粉等生化试剂购自上海生工生物技术有限公司。表1 PCR扩增所用引物及其序列
引物编号ft名称ι 引_序
权利要求
1.一种含有ING4和OSM基因的重组转移质粒，所述含有ING4和OSM基因的基因重组转移质粒为 pAdTrack-CMV-ING4-po 1 y-A-promoter-OSM。
2.根据权利要求1所述含有ING4和OSM基因的基因重组转移质粒，其特征在于，所述基因重组转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-0SM以转移质粒 pAdTrack-CMV-polyA-promoter 为基石出，并且在 pAdTrack-CMV-polyA-promoter 的多克隆位点的Bgl Il.Sal I之间插有ING4片段，在Not I、Hind III酶切位点之间OSM片段。
3.根据权利要求1所述含有ING4和OSM基因的基因重组转移质粒，其特征在于， 所述基因重组转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-0SM的制备方法为在 pAdTrack-CMV-polyA-promoter改造转移质粒基础上，在多克隆位点的Bgl Il.Sal I之间插入酶切扩增出的ING4片段，构建pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter单基因重组转移质粒，然后在 pAdTrack-CMV- ING4-poly-A-promoter 重组转移质粒的 Not I、Hind III 酶切位点之间插入酶切扩增出的OSM片段构建得到pA(Trrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-0 SM重组转移质粒。
4.一种含有ING4和OSM基因的重组腺病毒载体，所述重组腺病毒载体为 Ad-ING4-0SM。
5.根据权利要求4所述含有ING4和OSM基因的重组腺病毒载体，其特征在于，所述重组腺病毒载体的制备方法为将权利要求1所述重组转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A -promoter-OSM与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒采用氯化钙法共转化BJ5183感受态细菌，筛选后经I^cI酶切后再用脂质体转染QBH93A细胞，经多轮感染和扩增后获得重组腺病毒载体 Ad-ING4-0SM。
6.权利要求1所述重组转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-0SM或权利要求4所述重组腺病毒载体Ad-ING4-0SM在制备治疗癌症药物中的应用。
7.权利要求1所述重组转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-0SM或权利要求4所述重组腺病毒载体Ad-ING4-0SM在制备放疗增敏药物中的应用。
全文摘要
本发明属于腺病毒载体领域，具体公开了一种重组腺病毒载体Ad-ING4-OSM及其制备方法以转移质粒pAdTrack-CMV-polyA-promoter为基础，并且在其多克隆位点的BglII、SalI之间插有ING4片段，在NotI、HindIII酶切位点之间OSM片段，制得重组转移质粒pAdTrack-CMV-ING4-poly-A-promoter-OSM；将所述重组转移质粒与pAdEasy-1腺病毒骨架质粒采用氯化钙法共转化BJ5183感受态细菌，筛选后经PacI酶切后再用脂质体转染QBI-293A细胞，经多轮感染和扩增后获得重组腺病毒载体Ad-ING4-OSM；该Ad-ING4-OSM组重组腺病毒与Ad-ING4、Ad-OSM单基因组相比对人喉癌Hep-2细胞及其裸鼠移植瘤呈现明显的抑瘤增效协同作用和放疗增敏协同效应；而且对抑制SPC-A1肺腺癌细胞的生长和诱导细胞凋亡呈现叠加的抑癌增效作用。
文档编号C12N15/861GK102352368SQ20111029371
公开日2012年2月15日 申请日期2011年9月29日 优先权日2011年9月29日
发明者杨吉成, 马士崟 申请人:苏州大学