鉴别黄化茶树品种‘黄叶宝’的核苷酸序列、特异性标记引物和方法与流程

本发明涉及一种鉴别黄化茶树品种‘黄叶宝’的核苷酸序列、特异性标记引物，以及一种利用该特异性引物对‘黄叶宝’进行快速鉴别的方法。

背景技术：

在生长发育过程中，有些茶树品种由于不同程度的叶绿素缺失而造成其嫩叶明显黄化，甚至白化，这类茶被称为黄化茶。与一般茶树相比，黄化茶具有较高水平的氨基酸。已有研究表明茶氨酸具有降低血压、提高记忆力、增强免疫等功效。因此，黄化茶多为茶中珍品，具有很高的经济价值。然而，黄化茶的市场也面临着许多严峻的问题：(1)由于遗传背景不清，命名不统一，造成市面上的黄化茶种类比较混乱；(2)为了追逐最大利益，在过去的多年里，一些不法商贩利用茶树品种不易鉴别的特点，以假乱真，以次充好的现象时有发生，给茶农和消费者造成了不小的经济损失。这些现状为黄化茶品种的合理利用、产业化健康发展及资源保护带来了极大困难。因此，针对不同的黄化茶树品种建立相应的快速、准确鉴别方法是十分必要的。

黄化茶的表型特征十分相似，且形状特征易受生境、气候、生理状况等的影响而常常导致主观鉴别上的偏差，因此，仅靠细微表型差异难以快速准确鉴定黄化茶树品种。随着现代科学技术的发展，dna分子标记技术弥补和克服了传统形态学鉴别方法的一些缺陷和难题，已经成为了植物辅助鉴别的重要手段。近年来，一些基于pcr的常规分子标记技术如rapd(randomamplifiedpolymorphicdna，随机扩增多态性dna)(陈志丹等，闽南乌龙茶茶树种质资源rapd指纹图谱构建及遗传多样性分析，分子植物育种，2012，10(6)：731-739)、issr(inter-simplesequencerepeat，简单序列重复区间扩增多态性)及srap(sequencerelatedamplifiedpolymorphism，相关序列扩增多态性)(利用srap和issr标记分析广东茶树种质资源的遗传多样性，核农学报2010，24(5)：948-955)、ssr(simplesequencerepeats，简单重复序列)(张明泽，黔南60份茶树种质资源遗传多样性的ssr分析，西北植物学报，2016，36(6)：1117-1124)和scot(startcodontargetedpolymorphism，目标起始密码子多态)(陈熙等，scot标记分析陕西茶树资源的遗传多样性，茶叶科学，2016，36(2)：131-138)相继用于茶树的种质资源遗传多样性研究，但是，这些分子标记技术直接用于茶树品种分子鉴定的研究很少，况且这些标记技术所采用的为序列较短的通用随机引物或者引物的随机组合，其pcr扩增产物的dna指纹图谱不仅复杂、重复性差，而且特异性不高，因此不适合直接用于品种鉴定。孙威江等(一种构建茶树dna指纹图谱的方法，专利申请公布号cn104651515a)基于12条issr通用引物对茶树品种进行pcr扩增，通过0、1拷带，多条引物分析结果组合，将dna指纹图谱信息通过二维码技术处理转化为二维码图形，然后通过二维码图形的比对进行茶树品种的鉴别。也有学者基于同样的原理，采用三对ssr通用引物对白化茶树品种进行pcr扩增，然后基于dna指纹图谱的0、1拷带信息构建茶树品种的二维码识别信息(快速鉴定不同白化茶树品种的分子标记组合、方法及应用，专利申请公布号cn106480224a)。这些研究为茶树品种的鉴定与分类提供了一种思路，然而这类鉴别方法存在着很大的缺陷：(1)操作繁琐。此类方法需要使用多对引物对待测样品进行pcr扩增，然后对得到的dna指纹图进行0、1拷带，将得到数据进行组合，最后通过二维码识别才能实现品种鉴定；(2)准确性差。issr及ssr等常规分子标记对pcr反应条件比较敏感，因此，其dna指纹图谱重复性相对较差，一旦dna指纹图谱信息发生改变，很容易造成二维码鉴别失败或者出现误判；另外，进行0，1拷带过程中，由于dna指纹图谱比较复杂，以及电泳条带的背景差异，很容易出现人为数据统计错误的现象，进而造成鉴别失败或者鉴别错误；(3)耗时较长。此类方法涉及到多条引物的pcr扩增、电泳检测、dna指纹图谱0、1拷带、数据组合及二维码比对分析，整个实验过程时间比较长。因此，如何改进现有茶树品种鉴别方法的不足，已经成为了当务之急。

特异性分子标记技术在常规分子标记的基础上，利用特异dna片段的测序，根据两端序列设计一对序列长为18～24碱基的引物，在较高的退火温度下进行特异性扩增。其引物具有很高的专一性，能够排除随机引物结合位点之间的竞争，实现dna序列的特异性扩增。因此，此技术是一种十分稳定的分子标记技术，在植物种质鉴定中具有很好的应用前景。该方法具有快速、简便、成本低、检测结果准确的特点，迄今为止尚未有特异性分子标记应用于黄化茶树品种‘黄叶宝’鉴别的研究报道。

技术实现要素：

本发明的第一个目的是针对现有技术的不足，提供了一种鉴别黄化茶树品种‘黄叶宝’的特征性核苷酸序列。

本发明利用pcr技术，基于scot分子标记，经过大量筛选实验，获得‘黄叶宝’特异性dna片段。通过切胶回收、ta克隆、测序，获得该dna序列。具体序列为：

accatggctaccaccgcagaatagaggccaactcaaggcaaatcaccacaattctaaaacttggctctcctcggttggtcaaagaagttcaaaagctgatgagaatggccgtcgcactcaacaactttatcaaccgtttcacagatcgctgccgacaattctttcacacatttcggtagaacaaagcttttgaatggacccctaagtgccaggtcgctctggacggcttgaaaacttacctccgatcagtaccactcttggtaaccccctcggcaggcgatccgctcattttgtatcttgcagtatctgactgggcggtcagtgctgtacttttaacgaaagaactcggggagcaacgaccagtttactatgtaagaaaggcaatggttgatactgaaacacgttatctaccactggaaaagctcatccttgctctcgtgatggctgcaagaaaactgatgcattactttgaagggcatgccataggggtaataacagactatcctctccggtcagcgctccatagcggggaagcatcagggcgagtttcgaaatgggctttggaactcggccagtatgatatttggtttttgcctagaactaacatcaaagggcaagtgctcgccgacttgtagtcgaattcacgagataacatgccgactttaactctgatcaagtacaacctaaacccaattggcgaatatatattggagacatttggcaaatgtactgtgacgggtcatccaactagcgtgacagtagggcaggtgtagaaatcatgacccccgaaggggcaataatcgagcaggcggtcaaactgggctttgatgcatcaaataatgaggccaaatacgaagcattgctaaccggccttcgcaacacacttcaccttggtatgcggtggtagccatggt，如seqidno.1所示；

本发明的第二个目的是提供基于上述‘黄叶宝’特异性核苷酸序列设计的鉴别‘黄叶宝’的特异性标记引物(s34h7f3/s34h7r1)，该引物序列如下：

上游引物s34h7f3:5’-acttggctctcctcggttg-3’，如seqidno.2所示；

下游引物s34h7r1:5’-accatggctaccaccgcata-3’，如seqidno.3所示；

上述特异性引物(s34h7f3/s34h7r1)，具有非常高的特异性。以该引物作为pcr引物，对‘黄叶宝’及其相似茶树品种基因组dna进行pcr扩增，该引物组合(s34h7f3/s34h7r1)只与‘黄叶宝’样本dna发生反应，获得856bp大小的特异性dna片段，而与其他茶树品种样品不发生反应。为进一步验证特异性标记引物s34h7f3/s34h7r1的稳定性，用该引物组合对来自10个不同‘黄叶宝’个体的基因组dna进行pcr扩增，结果所有‘黄叶宝’样品都能扩增出856bp大小特异性条带，说明该引物具有很高的稳定性和应用性。运用该特异性引物，通过常规pcr反应即可以快速准确鉴别出‘黄叶宝’样品。

本发明的第三个目的是提供一种利用上述特异性标记引物对茶树品种‘黄叶宝’进行快速鉴别的方法。所述方法为：以本发明设计的引物组合(s34h7f3/s34h7r1)为特异性扩增引物，以待测茶树植物样品dna为扩增模板，进行pcr扩增，经琼脂糖凝胶电泳检测，若电泳结果出现分子量为856bp大小的特异性dna条带，则待测茶树植物样品为‘黄叶宝’，反之则不是。

具体的，所述方法如下：

(1)样品总dna提取：剪取待测茶树植物样品新鲜叶片100mg放入研钵，立即加入液氮研磨至粉末，然后，使用uniq-10柱式植物基因组dna抽提试剂盒(购于上海生工生物工程有限公司)提取样品总dna，所得dna用1％琼脂糖胶进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测浓度，稀释至50ng/μl。

(2)pcr扩增：以步骤(1)提取的待测样品dna为模板，以所述分子特异性标记引物(s34h7f3/s34h7r1)作为扩增引物，进行pcr扩增。

pcr反应体系(总体积20μl)：上游引物s34h7f3(10μm)1μl，下游引物s34h7r1(10μm)1μl，pcrsupermix(订购于北京全式金生物技术有限公司)10μl，模板dna(50ng/μl)1μl，ddh2o7μl。

pcr反应设置程序：94℃预变性5min；32个循环(94℃变性50s，61℃退火50s，72℃延伸1.5min)；72℃延伸10min。

(3)电泳检测：取步骤(2)pcr产物10μl,用1.5﹪琼脂糖凝胶进行电泳检测，利用凝胶成像系统拍照检测。若电泳图通道出现分子量为856bp大小的dna条带，则待测样品为‘黄叶宝’，反之则不是。

本发明主要有益效果表现为：s34h7f3/s34h7r1为‘黄叶宝’特异性标记引物，若为其他茶树品种，为阴性反应，能够实现茶树品种‘黄叶宝’的快速、准确鉴别。该方法简便、准确，且耗时短，半日即可完成。

附图说明

图1是按照常规pcr方法，运用scot标记对‘黄叶宝’及其相似黄化茶树品种进行pcr扩增，经过大量筛选实验，获得的具有‘黄叶宝’特征性dna条带的电泳图(箭头所指的条带是‘黄叶宝’特有的条带，分子量为914bp)，其中m为dna分子量标准trans2kdnamarker(购于北京全式金生物技术有限公司)；通道1-17分别为：黄金芽、苏玉黄、安吉白茶、中黄1号、中黄2号、中黄3号、黄叶宝、中茶211、御金香、白鸡冠、景白1号、景白2号、天台白茶、越乡白茶、安吉黄茶、黄金菊、花叶。

图2是本发明所述的‘黄叶宝’的特征性核苷酸序列及对‘黄叶宝’特异性引物s34h7f3和s34h7r1的位置图，左侧为5’端，右侧为3’端，其中黑色部分为特异性引物s34h7f3/s34h7r1扩增的序列片段大小及位置；

图3是运用本发明设计的分子特异性标记引物s34h7f3/s34h7r1对17个黄化茶树品种dna进行pcr扩增的电泳图，其中m为dna分子量标准trans2kdnamarker(购于北京全式金生物技术有限公司)；通道1-17分别为：黄金芽、苏玉黄、安吉白茶、中黄1号、中黄2号、中黄3号、黄叶宝、中茶211、御金香、白鸡冠、景白1号、景白2号、天台白茶、越乡白茶、安吉黄茶、黄金菊、花叶。电泳图显示只有‘黄叶宝’样品扩增出分子量为856bp大小的特异性dna条带。

图4是运用本发明设计的分子特异性标记引物s34h7f3/s34h7r1对10份不同‘黄叶宝’个体的dna进行pcr扩增的电泳图。其中，m为dna分子量标准trans2kdnamarker(购于北京全式金生物技术有限公司)；通道1-10：对应为10个不同‘黄叶宝’样品，编号分别为hyb1-hyb10。

具体实施方式

本发明可以在分子水平上较为快速准确的鉴别黄化茶树品种‘黄叶宝’的相关样品。通过以下实施例对本发明做进一步说明，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1：‘黄叶宝’特征性核苷酸序列的制备

1.样品总dna提取

剪取待测茶树植物样品新鲜叶片100mg放入研钵，立即加入液氮研磨至粉末，然后，使用uniq-10柱式植物基因组dna抽提试剂盒(购于上海生工生物工程有限公司)提取样品总dna，所得dna用1％琼脂糖胶进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测浓度，稀释至50ng/μl。

2.scot–pcr扩增，电泳检测

运用scot分子标记对待测黄化茶树样品dna进行pcr扩增，引物由上海生工生物工程有限公司合成，反应体系(总体积20μl)：pcrsupermix(购于北京全式金生物技术有限公司)10μl，引物(10μm)1μl，模板dna(50ng/μl)1μl，ddh2o8μl。

pcr扩增设置程序：94℃预变性5min；32个循环(94℃变性50s，55℃退火50s，72℃延伸1.5min)；72℃延伸10min。

经过大量筛选实验，获得具有‘黄叶宝’特征性条带的dna指纹图谱(见图1)，箭头标记的条带(分子量为914bp，通道7)，是筛选出的‘黄叶宝’特异性dna条带。如图1(图中，通道m为dna分子量标准trans2kdnamarker；通道1～17为不同黄化茶树品种，具体编号见附图说明)所示，只有‘黄叶宝’(通道7)在分子量914bp位置有条带出现，而其他黄化茶树品种在分子量914bp位置没有条带出现。因此，此条带为‘黄叶宝’的特征性核苷酸序列。

3.序列测定

对上述筛选获得的‘黄叶宝’特异性dna片段(图1中箭头所指片段)进行切胶回收，采用pcr产物纯化试剂盒(北京康为世纪)纯化所切dna片段。然后将所纯化的dna片段连接到-bluntsimplecloningvector(购于北京全式金生物技术有限公司)上，转化到大肠杆菌感受态细胞中，经检测后，将含有目的序列的克隆送生物公司测序(上海祥音生物科技有限公司)，得到如seqidno.1所示的核苷酸组成和排列。

实施例2：‘黄叶宝’特异性标记引物制备，pcr扩增，电泳检测

在测序获得‘黄叶宝’特异性dna序列的基础上，设计获得特异性标记引物s34h7f3/s34h7r1(分别为seqidno.2、seqidno.3所示)。引物序列由上海祥音生物科技有限公司合成。然后，利用所设计的引物组合s34h7f3/s34h7r1对不同黄化茶树品种dna进行pcr扩增。

pcr反应体系(总体积20μl)：上游引物s34h7f3(10μm)1μl，下游引物s34h7r1(10μm)1μl，pcrsupermix(订购于北京全式金生物技术有限公司)10μl，模板dna(50ng/μl)1μl，ddh2o7μl。

pcr反应程序：94℃预变性5min；32个循环(94℃变性50s，61℃退火50s，72℃延伸1.5min)；72℃延伸10min。

利用1.5﹪琼脂糖凝胶对pcr产物进行电泳检测，电泳图如图3所示(图中，通道m为dna分子量标准trans2kdnamarker；通道1～17为不同黄化茶树品种，具体编号见附图说明)。从图3可以看出，只有‘黄叶宝’(通道7)能扩增出分子量为856bp大小的特异性dna条带(该特异性dna条带具体序列信息见图2黑色标记部分)，而其他黄化茶树品种没有扩增出任何条带，这表明本发明的特异性引物具有极高的专一性，因此可以用于‘黄叶宝’样品的快速鉴别。

实施例3：特异性标记引物s34h7f3/s34h7r1进一步验证

为了进一步验证本专利开发的引物组合s34h7f3/s34h7r1的稳定性和应用范围，利用引物s34h7f3/s34h7r1对10份不同‘黄叶宝’个体的样品dna进行pcr扩增检测，电泳图如图4所示(图中，m为dna分子量标准trans2kdnamarker；通道1-10：对应为‘黄叶宝’样品，编号hyb1-hyb10)。图4显示所有‘黄叶宝’样品都能扩增出856bp大小的特异性dna条带，因此，本发明的特异性标记引物s34h7f3/s34h7r1具有很高的稳定性，可以用于黄化茶树品种‘黄叶宝’的快速鉴别。

sequencelisting

<110>中国农业科学院茶叶研究所

<120>鉴别黄化茶树品种'黄叶宝'的核苷酸序列、特异性标记引物和方法

<130>1

<160>3

<170>patentinversion3.3

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<211>914

<212>dna

<213>人工合成

<400>1

accatggctaccaccgcagaatagaggccaactcaaggcaaatcaccacaattctaaaac60

ttggctctcctcggttggtcaaagaagttcaaaagctgatgagaatggccgtcgcactca120

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tccgatcagtaccactcttggtaaccccctcggcaggcgatccgctcattttgtatcttg300

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<212>dna

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