专利名称：一种用于鉴定油茶品种的方法及其专用引物和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及油茶品种的鉴定方法，具体涉及一种用于鉴定油茶品种基于遗传基因的方法及其专用引物和方法。
背景技术：
油茶是世界四大木本油料树种之一，也是我国最重要的木本油料经济作物，其寿命长，具有一次种植、多年受益的特点，稳定收获期可长达80年以上。然而，一旦误用不当或伪劣品种造林，影响也将是深远的。近年我国政府投入巨资，大力发展油茶产业。按国家发展规划，到2015年全国的油茶种植规模将要达到六千万亩左右。在油茶产业蓬勃发展过程中，造林种苗是否为真实的优良品种，如同优良品种的选育本身一样，也是油茶林优质高产的基础。为确保油茶产业健康发展，急需建立一套真实、简便、快速、可靠的油茶品种遗传真实性鉴定技术，以满足对油茶种苗生产的监督检查、对新品种进行认定，以及对育种工作者的知识产权进行保护的需要。植物品种遗传真实性鉴定的关键是所依赖的技术手段。以往植物品种鉴别所采用的方法主要是依据植物的形态特征。但植物品种间在形态上的差异，特别是苗期的差异，往往并不十分显著。尤其对油茶这类世代周期长的物种，性状的差异一般到了成熟期才能表现出来，大多数品种根本无法从幼苗的形态上进行鉴别。自上世纪八十年代以来，现代分子标记技术的应用，为植物新品种的鉴定提供了准确可靠的技术手段。分子标记是以DNA为基础的标记技术，是指能反映生物个体或种群间基因组差异的特征DNA 片段，也称DNA指纹图谱。随着分子标记技术的发展，通过DNA指纹技术鉴别生物个体已经成为一项成熟的技术，并在许多植物新品种鉴别中得到了广泛应用。分子标记技术直接以植物DNA为分析对象，从根本上克服了环境的影响，同时也不受基因表达的限制， 在DNA水平上进行品种遗传真实性鉴定不仅可靠性高，而且大大提高了检测效率。常见的分子标记有RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism限制片段长度多态
) > ISSR(Inter-simple sequence repeat M S M ^lJ ) > RAPD (Random amplified polymorphic DNA) > AFLP(Amplified Fragment Length Polymorphism, 性)、SSR(Simple Sequence R印eat，简单重复序列)等。应用分子标记对植物品种进行遗传真实性鉴定需要考虑以下因素1.简便、快速，易于在实际检验工作中推广使用；2.标记针对待检物种有高度特异性，使检测结果不受内源和外源微生物或病原菌影响；3.标记扩增基因位点多态性高，可以利用较少的引物组合达到较高的检测精度。考虑上述要求，微卫星标记是目前不同标记类型中，用于植物品种遗传真实性鉴定的最高效的分子标记。微卫星DNA也称简单重复序列，是由长度为l-6bp串联重复序列组成，微卫星是基因组中变异最为迅速的序列，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。微卫星标记是基于PCR扩增为基础的标记，微卫星标记分析相对于基于分子杂交为基础的标记要简便、快速的多。同时微卫星引物是由待检物种的基因组序列开发而来，具有极高的种属特异性，这样既使样品中含有不同的内源和外源微生物或病原菌污染，检测结果也不会受到干扰。这一优点是RAPD或AFLP等这类随机标记所不具备的。油茶不同品种间同一位点的SSR重复次数存在差异，造成了品种间等位位点的长度多态性。根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于微卫星串联重复数目不同，通过扩增片段的电泳分离，可以获得不同微卫星位点的基因型频率信息。根据不同品种在不同微卫星位点的基因型频率，就可以估算出不同品种遗传真实性鉴定的准确概率。
发明内容
发明目的针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是提供一种真实、简便、快速、可靠的用于鉴定油茶品种的方法，为油茶新品种保护，保证油茶产业的健康和可持续发展，把好种苗质量关，提供关键技术支撑。本发明的另一目的是提供一种上述用于鉴定油茶品种的方法的专用引物。本发明还有一目的是提供上述用于鉴定油茶品种的方法的试剂盒。技术方案为了实现上述发明目的，本发明采用的技术方案如下—种用于鉴定油茶品种的专用引物，所述引物至少为下表中的2个引物对
权利要求
1. 一种用于鉴定油茶品种的专用引物，其特征在于所述引物至少为下表中的2个引物对
2.一种用于鉴定油茶品种的试剂盒，其特征在于含有权利要求1所述的10个用于鉴定油茶品种的引物对。
3.根据权利要求2所述的用于鉴定油茶品种的试剂盒，其特征在于还包括10XPCR 缓冲液、dNTP、双蒸水、以及Taq DNA聚合酶。
4.一种用于鉴定油茶品种的方法，其特征在于分别以待鉴定的油茶样品DNA和标准对照样的DNA为模板，在任意选取的两个引物对引导下进行PCR扩增获得产物，对产物进行电泳，对电泳结果进行基因型比对，若检测到基因型不同为则为不同品种；若检测到基因型均相同，查表2相应引物基因型出现的频率，计算待检样品与标准样品基因型相同的概率； 若相同概率达不到检测要求时，选取第三对引物进行检测，直至相同概率达到检测要求即可；其中，引物对为权力要求1所述的专用引物，表2为说明书中的表2。
5.根据权利要求4所述的用于鉴定油茶品种的方法，其特征在于PCR反应体系为模板 DNA 25ng，FAM标记的上、下游引物各 20ng，200uM dNTP,0. 5 U Taq 聚合酶，1. 5uL 含 100 uM pH 8. 3 的 Tris-HCl、500 mM KCl, 20 mM MgCljPlO. 0 g /L BSA 的 IOX buffer，加灭菌去离子水补充反应积到15uL ；PCR反应条件为94°C预变性^iin ； 94°C变性30s，50°C退火30 s，72°C延伸lmin，进行30个循环；72°C延伸5min。
6.一种用于鉴定油茶品种的方法，其特征在于分别以待鉴定的油茶样品DNA和标准对照样的DNA为模板，用鉴定油茶品种的试剂盒进行PCR扩增获得产物，对产物进行电泳， 对电泳结果进行基因型比对，若检测到基因型不同为则为不同品种；若检测到基因型均相同，查表2相应引物基因型出现的频率，计算待检样品与标准样品基因型相同的概率；若相同概率达不到检测要求时，选取第三对引物进行检测，直至相同概率达到检测要求即可；其中，试剂盒为权利要求2或3所述的用于鉴定油茶品种的试剂盒，表2为说明书中的表2。
7.根据权利要求6所述的用于鉴定油茶品种的方法，其特征在于PCR反应体系为模板 DNA 25ng，FAM 标记的上、下游引物各 20ng，200uM dNTP,0. 5 U Taq 聚合酶，1. 5uL 含 100 uM pH 8. 3 的 Tris-HCl、500 mM KCl, 20 mM MgCljPlO. 0 g /L BSA 的 IOX buffer，加灭菌去离子水补充反应积到15uL ；PCR反应条件为94°C预变性^iin ； 94°C变性30s，50°C退火30 s，72°C延伸lmin，进行30个循环；72°C延伸5min。
全文摘要
本发明公开了一种用于鉴定油茶品种的方法及其专用引物和试剂盒，该方法分别以待鉴定的油茶样品DNA和标准对照样的DNA为模板，在相同引物对引导下进行PCR扩增获得产物，对产物进行电泳，对电泳结果进行基因型比对，基因型不同为不同品种，否则进行相同概率计算，达不到检测要求，继续选择引物进行PCR鉴定，直至符合鉴定概率要求即可；与现有的油茶鉴定方法相比，本发明的突出优点包括利用10对油茶专用微卫星引物，进行油茶品种的遗传真实性鉴定，鉴定方法操作简单、快捷，鉴定的准确率高。此外，根据本发明的方法开发出相应的检测试剂盒，用于油茶品种遗传真实性鉴定，具有使用方法简单、快速、灵敏的优点，检测结果可靠、稳定、准确，为油茶品种遗传真实性鉴定提供了可靠技术手段。本发明将为油茶良种使用的监督检验发挥重要作用，应用前景广阔，具有很好的实用性，能够产生较好的经济效益和社会效益。
文档编号C12Q1/68GK102321768SQ20111032197
公开日2012年1月18日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者史洁, 尹佟明, 戴晓港, 施季森, 管宏伟, 陈金慧 申请人:南京林业大学