专利名称：一种以介孔分子筛-壳聚糖为载体固定化果糖基转移酶的制备方法
技术领域：
一种以介孔分子筛-壳聚糖为载体固定化果糖基转移酶的制备方法，属于食品酶工程技术领域。
背景技术：
低聚果糖(Fructooligosaccharides)，简称F0S，又称寡果糖或蔗果三糖族低聚糖，分子式为G-F-Fn，n=l 3 (G为葡萄糖，F为果糖)。它是由蔗糖和1 3个果糖基通过 β-2-1糖苷键与蔗糖中的果糖基结合而成的蔗果三糖、蔗果四糖、蔗果五糖及其混合物。工业上一般由蔗糖经果糖基转移酶(Fruetosyltransferase，EC 2.4. 1.9，FTS)的转糖基作用而生成低聚果糖，其酶促反应机理如下
低聚果糖(FOS)是一种功能性低聚糖，其特点是低热量、低甜度，可以促进矿物质吸收、 改善肠道菌群、抗龋齿、降血脂等，其作为功能性因子被广泛应用于食品中，如奶制品、饮料、糖果糕点、肉类加工品等。目前国内工业化生产FOS的技术多为液体深层发酵法，该法的缺点是产酶菌丝体只能利用一次，在FOS生产过程中，由于菌丝体及其培养基成分的存在并参与反应，使整个工艺繁杂，成本高。将酶固定化以后可以提高酶的使用效率，降低生产成本，传统的固定化方法有包埋法、吸附法、交联法等，但这些方法都有一定的不足之处， 固定化效率低、酶分子容易泄漏、操作稳定性低等。有序介孔分子筛是一种近年来研究比较多的分子材料，由于其孔道规则，结构有序，热稳定性好，且拥有较高的比表面积以及较强的吸附能力，其孔道中可组装多种物质而改变理化性能。因此，有序介孔材料在多相催化、大分子吸附及酶的固定化方面上应用广泛。近年来，MCM-41，MCM-48和SBA-15等有序材料在生物化学领域的应用逐渐受到关注。 已有文献报道了以介孔分子筛作为生物大分子固定的新型载体，如木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、 脂肪酶、过氧化物酶等，获得了较好的固定化效果。并其中SBA-15是一种孔道结构的分子筛，其孔道直径在5-30nm可调，无生理毒性，稳定性好，其表面有大量的羟基，可以吸附酶蛋白，可应用于酶的固定化，但是单独依靠吸附作用结合的酶容易泄漏，稳定性差，因此还需其他步骤改进。壳聚糖(chitosan)是甲壳素(chitin)脱乙酰基的产物，是一种天然高分子生物材料，生物相容性较好、易生物降解，且无毒、廉价易得。其结构由大部分2-氨基-2-脱氧-β -D葡萄糖单元和少量N-乙酰-2-氨基-2-脱氧-β -D-葡萄糖单元以β -1，4糖苷键连接形成，相对分子质量为几十万到上百万左右。壳聚糖分子中的羟基和氨基可以通过离子键、氢键及范德华力而吸附蛋白质，通过壳聚糖吸附法固定化酶应用广泛。壳聚糖本身也是一种多孔的网状结构，因此可以将吸附了蛋白质的SBA-15再与壳聚糖结合，使固定化颗粒再次吸附在壳聚糖的网状结构中，达到双重吸附固定化酶。但是仅靠吸附作用固定化酶蛋白，酶分子容易脱落，因此可以加入双功能基团试剂，如戊二醛等，进一步交联。由于壳聚糖分子中含有游离的氨基，通过化学交联剂很容易与酶发生间接共价结合，此外酶与酶之间也可以通过这种双功能试剂进一步交联，使酶分子更稳固地固定在载体上。本发明即通过上述双重吸附-交联法固定化果糖基转移酶得到固定化颗粒，经研究证明该方法步骤简单易操作，条件温和，且可以获得较高的酶活回收率、蛋白吸附率、重复利用率以及稳定性，可用于高纯度低聚果糖的生产，具有一定的实际应用价值。
发明内容
本发明目的在于提供一种以介孔分子筛为载体材料固定化果糖基转移酶的方法， 该方法操作简单，所得蛋白吸附率和酶活回收率较高，酶活回收率可达75%以上，蛋白吸附量可超过350mg蛋白/g SBA-15，其pH稳定性与温度稳定性都优于游离酶，固定化酶重复利用10次后酶活仍保留70%以上，该固定化酶在4°C条件下储存60天后酶活仍保持的85% 以上。本发明的技术方案一种以介孔分子筛-壳聚糖为载体固定化果糖基转移酶的制备方法，先以介孔分子筛SBA-15为载体，将酶蛋白吸附于该载体上，再加入壳聚糖以及双功能试剂戊二醛进一步吸附并交联，通过两步吸附-交联法进行了果糖基转移酶的固定化，使酶分子牢固地固定于载体上，步骤如下
(1)载体吸附酶蛋白将总酶活300-400U果糖基转移酶用18mL50mM、pH 5. 0-7. 0的柠檬酸-磷酸缓冲液稀释，再与30-50mg的介孔分子筛SBA-15混合后，置于恒温振荡器中， 室温下以恒定转速振荡吸附2- ；
(2)吸附-交联取ImL质量浓度为1.0%-3. 0%的壳聚糖1%冰醋酸溶液，加入到步骤 (1)所得固定化酶体系中；随后再加入ImL质量浓度为0. 5%-2. 5%的双功能试剂戊二醛水溶液，置于恒温振荡器中震荡2-6h，取出，高速离心机离心5-lOmin，除去未固定化部分，转移上清液，用50mM pH5. 0-7. 0的柠檬酸-磷酸缓冲液洗涤沉淀，再次离心，用上述柠檬酸-磷酸缓冲液重复洗涤3次，即制得产品以介孔分子筛-壳聚糖为载体固定化果糖基转移酶，储藏于4°C冰箱中备用。所述的介孔分子筛SBA-15，其孔径大小为6-lOnm。所得固定化果糖基转移酶的酶活回收率达75%以上，蛋白吸附量超过350mg蛋白 /g载体，固定化酶重复利用10次后酶活仍保留70%以上，在4°c条件下储存60天后酶活仍保持85%以上。果糖基转移酶酶活及蛋白含量的测定
游离果糖基转移酶酶活的测定方法取一定体积、底物浓度为10%(W/v)的0.05M、 pH5. 0的柠檬酸-磷酸缓冲液于直径50mm、体积IOOmL的恒温夹套酶反应器中，50°C下恒温搅拌反应60min，于沸水中煮沸IOmin后终止反应。一个酶活力单位定义为每分钟产生1 ymol蔗果三糖(1-kestose)。糖组分测定的方法HPLC(高效液相色谱)法HPLC，AgilentllOO系列，配有Siodex RI-101示差折光检测器和M 740数据处理器；色谱柱，Shodex Asahipak NH2P_50 ；流动相为乙睛/水65/；35 (v/v)，流速lmL/min ；温度30°C ；进样量10 μ L。
固定化酶活测定方法同游离果糖基转移酶酶活测定方法。固定化酶活回收率(%)=[固定化酶活力/加入酶总活力]X 100%。蛋白含量测定方法
考马斯亮蓝染色法将待测溶液稀释一定倍数后，加6mL 10%的考马斯亮蓝染色剂，放置aiiin后在595纳米处测定吸光度，由标准曲线读出蛋白质浓度，并计算吸附的蛋白量。本发明的有益效果本发明以介孔分子筛SBA-15为基础的固定化载体，设计了一种适合果糖基转移酶的固定化方法，固定化过程简单，条件温和，成本较低，相对于传统的固定化方法，酶活回收率以及蛋白吸附量已经达到较高的水平，可重复利用次数较多，酶的稳定性也较好，可应用于低聚果糖的工业化生产。
具体实施例方式为了更好的理解本发明，下面结合实施例对本发明做进一步描述，本发明的保护不限于此。实施例1
准确称取30mg介孔分子筛SBA-15，加入18mL用50mM pH5. 0的柠檬酸-磷酸缓冲液稀释的果糖基转移酶(总酶活400U)，置于恒温振荡器(150rpm)中室温(约15°C )振荡浊， 加入ImL浓度1. 0%的壳聚糖(预先溶于1. 0%的冰醋酸)，再加入ImL浓度2. 5%的戊二醛水溶液，置于恒温振荡器中震荡4h，4000rpm离心5min，转移上清液，用50mM pH5. 0的柠檬酸-磷酸缓冲液洗涤沉淀，以除去残余的戊二醛及未固定的酶蛋白，再次离心，重复洗涤3 次，即制得固定化果糖基转移酶。将离心所得上清液收集测定固定化酶酶活328U，回收率为 82. 0%，蛋白吸附量为382mg蛋白/g SBA-15 实施例2
准确称取30mg介孔分子筛SBA-15，加入18mL用50mM pH7. 0的柠檬酸-磷酸缓冲液稀释的果糖基转移酶(总酶活300U)，置于恒温振荡器(150rpm)中振荡池，加入ImL浓度2. 0% 的壳聚糖(预先溶于1. 0%的冰醋酸中)，再加入ImL浓度1. 5%的戊二醛水溶液，置于恒温振荡器中震荡4h，4000rpm离心5min，转移上清液，用50mM pH 7. 0的柠檬酸-磷酸缓冲液洗涤沉淀，以除去残余的戊二醛及未固定的酶蛋白，再次离心，重复洗涤3次，即制得固定化果糖基转移酶。将离心所得上清液收集测定固定化酶酶活235U，酶活回收率为78. 3%，蛋白吸附量为356mg蛋白/g SBA-15。应用实施例1固定化酶的热稳定性研究
准确称取按照实施例2的制得的固定化酶30mg，加0. 05M pH5. 0的缓冲溶液，分别在 35、40、45、50、55、60°C保温处理60min，取出后测其酶活，以最高酶活为100%，用相对酶活来表示酶活力变化的情况，固定化酶在60°C条件下放置Ih后酶活保留86%，而游离酶只剩余 62%。应用实施例2固定化酶的分批反应
准确称取按照实施例2制得的固定化酶30mg，加入到20mL的10%(w/v)的蔗糖溶液中， 在恒温夹套酶反应器中，50°C下恒温搅拌反应60min，停止反应，得产品低聚果糖，4000rpm 离心除去固定化酶，并用缓冲溶液冲洗固定化酶三次并离心，然后用于下一批反应，如此重复10次，测定残余酶活，结果酶活仍保留72%。
应用实施例3固定化酶的贮存稳定性
将固定化酶和游离酶置于4°C冰箱内保存，每隔10天分别测定其酶活力，以各自初始酶活为100%，计算其残余酶活，，结果发现放置60天后，固定化酶的残余酶活仍有86%，而游离酶只剩余32%的酶活。
权利要求
1.一种以介孔分子筛-壳聚糖为载体固定化果糖基转移酶的制备方法，其特征在于先以介孔分子筛SBA-15为载体，将酶蛋白吸附于该载体上，再加入壳聚糖以及双功能试剂戊二醛进一步吸附并交联，通过两步吸附-交联法进行了果糖基转移酶的固定化，使酶分子牢固地固定于载体上，步骤如下(1)载体吸附酶蛋白将总酶活300-400U果糖基转移酶用18mL50mM、pH 5. 0-7. 0的柠檬酸-磷酸缓冲液稀释，再与30-50mg的介孔分子筛SBA-15混合后，置于恒温振荡器中， 室温下以恒定转速振荡吸附2- ；(2)吸附-交联取ImL质量浓度为1.0%-3. 0%的壳聚糖的1%冰醋酸溶液，加入到步骤 (1)所得固定化酶体系中；随后再加入ImL质量浓度为0. 5%-2. 5%的双功能试剂戊二醛水溶液，置于恒温振荡器中震荡2-6h，取出，高速离心机离心5-lOmin，除去未固定化部分，转移上清液，用50mM pH5. 0-7. 0的柠檬酸-磷酸缓冲液洗涤沉淀，再次离心，用上述柠檬酸-磷酸缓冲液重复洗涤3次，即制得产品以介孔分子筛-壳聚糖为载体固定化果糖基转移酶，储藏于4°C冰箱中备用。
2.根据权利要求1所述以介孔分子筛-壳聚糖为载体固定化果糖基转移酶的制备方法，其特征在于所述的介孔分子筛SBA-15，其孔径大小为6-lOnm。
3.根据权利要求1所述以介孔分子筛-壳聚糖为载体固定化果糖基转移酶的制备方法，其特征在于所得固定化果糖基转移酶的酶活回收率达75%以上，蛋白吸附量超过350mg 蛋白/g载体，固定化酶重复利用10次后酶活仍保留70%以上，在4°C条件下储存60天后酶活仍保持85%以上。
全文摘要
一种以介孔分子筛-壳聚糖为载体固定化果糖基转移酶的制备方法，属于食品酶工程技术领域。本发明先以介孔分子筛SBA-15为载体，将酶蛋白吸附于该载体上，再加入壳聚糖以及双功能试剂戊二醛进一步吸附并交联，通过两步吸附-交联法进行了果糖基转移酶的固定化，使酶分子牢固地固定于载体上。固定化酶的酶活回收率可达75%以上，热稳定性和pH稳定性都优于游离酶。本发明相对其他固定化方法操作简单，条件温和，成本较低，酶分子不易泄漏，固定化效果好；产品固定化果糖基转移酶可应用于高纯度低聚果糖的生产。
文档编号C12N11/14GK102321605SQ20111032191
公开日2012年1月18日 申请日期2011年10月21日 优先权日2011年10月21日
发明者吴保承, 张涛, 李晓卉, 杨春霞, 江波, 缪铭 申请人:江南大学, 江苏省江大绿康生物工程技术研究有限公司