本发明具体涉及新材料技术领域，具体涉及一种壳聚糖包覆的热还原纳米银多层膜长效抗菌涂层的制备方法。
背景技术：
医用生物材料的应用越来越广泛，在提高医疗水平的同时，我们也不得不面对其带来的一系列问题，其中最迫切需要解决的就是生物材料感染的问题。可以将生物材料感染的过程简单描述为：微生物在生物材料表面吸附，随后定植形成菌落，继而形成致密的生物膜，释放浮游菌体和毒素，最终导致感染的发生。自然界超过95%的细菌均能通过以上方式形成生物膜。在美国每年有超过十万人是死于生物材料相关的感染。因此在不破坏其性能的条件下，通过对生物医疗装置表面进行修饰，从而达到抗细菌粘附和生物膜形成已经迫在眉睫。可以将目前生物医疗装置表面修饰分为抗细菌粘附型和杀菌型。杀菌型虽然可以有效的杀死细菌，但也面临着残留细菌“尸体”可能会引发再次感染，故研发一种既可以有效杀菌也可以及时释放细菌“尸体”的表面修饰方法十分重要。
层层自组装技术具有简单、易于操作的特点，并且使膜层具有其组分的复合功能，有望得到兼具杀菌和及时释放死细菌的性能。
技术实现要素：
为了解决现有技术的缺陷及不足。本发明提供了一种壳聚糖包覆的热还原纳米银多层膜长效抗菌涂层的制备方法。
本发明采用的技术解决方案是：一种壳聚糖包覆的热还原纳米银多层膜长效抗菌涂层的制备方法，包括以下步骤：
（1）基材的表面预处理：将洗净的基材置于5mg/ml的聚乙烯亚胺（PEI）水溶液中，浸泡，获得表面胺基化的基材；
（2）制备壳聚糖-银（CHI-Ag+）溶液；
（3）采用聚丙烯酸（PAA）和CHI-Ag+溶液，通过层层自组装的涂层方法制备得到多层膜结构；
（4）将制备得到的多层膜加热0.5-2h,热还原银离子形成纳米银；
（5）在涂层表面均匀的涂抹上一层1-5mg/ml壳聚糖溶液，至此完成整个壳聚糖包覆的多层膜涂层的制备。
所述的基材为玻璃、石英、硅片、不锈钢、聚酯膜、硅胶中的一种。
所述的步骤（2）中壳聚糖-银（CHI-Ag+）溶液制备方法如下：配制硝酸银溶解的壳聚糖溶液中磁力搅拌调节pH值，即得壳聚糖-银（CHI-Ag+）溶液。
所述的步骤（3）中层层自组装的涂层方法如下：将表面胺基化的基材放入0.5-5mg/ml的聚丙烯酸 水溶液中浸泡6-8分钟，然后用相同pH值的洗液清洗2-3分钟，用氮气吹干，放入含有0.05-2.0mg/mL硝酸银的1-5mg/ml 的壳聚糖-银（CHI-Ag+）溶液中浸泡6-8min，用相同pH值的洗液清洗2-3分钟，氮气吹干，至此完成一个双层膜的制备，重复以上操作，直到完成整个多层膜涂层的制备。
所述的步骤（4）中热还原的纳米银粒径为5-50nm。
所述的步骤（1）中洗净的基材置于5mg/ml的聚乙烯亚胺（PEI）水溶液中浸泡0.5-12小时。
所述的步骤（4）中多层膜加热还原温度为120-150℃。
本发明的有益效果是：本发明提供了一种壳聚糖包覆的热还原纳米银多层膜长效抗菌涂层的制备方法，本发明涂层制备简单、易行，可采用浸涂、喷涂等可工业实现的方式，适用范围广，涂层具有高效和长效的抗菌性能，能够对具有复杂体型结构的生物医用装置进行涂层修饰；涂层可改善医用装置表面的生物相容性，具有降低细胞毒性；涂层材料化学结构稳定，耐疲劳、剪切，能适应人体的内环境；涂层能够实现广谱的多功能抗菌的能力。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的技术内容，特举以下实施例详细说明。
基材表面预处理：
将各基材（玻璃、石英、硅片、不锈钢、聚酯膜、硅胶等）经刀片或玻璃刀裁剪成1×2 cm2大小，然后依次用前经乙醇和超纯水分别超声2-3min清洗，N2吹干。清洗过的基材将洗净的基材置于将洗净的基材置于1-5mg/ml的PEI水溶液中，浸泡1-12h，获得表面胺基化的基材。下列实施例中所用的基材均为通过上述表面与处理过后的基材。
实施例1：
配制0.5mg/mL的PAA溶液，测定pH值为4.35。取50ml超纯水于50ml离心管中，调节pH为4.38，标为洗液1。
配制0.1mg/mL的硝酸银溶解于50ml 的1 mg/ml的CHI中磁力搅拌，测定pH为3.97。取50ml超纯水于50ml离心管中调节pH值为4.04，标为洗液2。
将经过预处理以后的基材加入PAA溶液中浸泡6-8min,取出，放入洗液1清洗2-3min，取出，用N2吹干。再将其放入CHI-Ag+溶液中浸泡6-8min，取出，放入洗液2中清洗2-3min，取出，用N2吹干,至此完成一个双层的制备，制备10个双层的多层膜涂层。
将制备得到的涂层在120℃下加热0.5h后，裁剪大小为2x8cm并在表面均匀涂抹 1ml 5mg/ml CHI水溶液，在37℃烘箱中烘干。
静态接触角研究发现涂膜后亲水性显著增加，和单纯的基材相比，由67.25±1.43°减到2±0.22°，透射电镜下观察膜层中纳米银的分布，发现纳米银均匀分布在4.0nm、9.8nm、15.6nm、23.1nm和23.6nm左右。通过抑菌环实验发现抑菌环分别为4.3mm、7.0mm、15.9mm、17.1mm和16.6mm，其抗菌效果明显增加。测定对成纤维细胞和人晶状体上皮细胞的细胞毒性较低，细胞存活率达到73%以上。
实施例 2：
配制1mg/mL的dopa溶液，测定pH值为4.36。取50ml超纯水于50ml离心管中，调节pH为4.34，标为洗液1。
配制0.5mg/mL的硝酸银溶解于50ml 的2 mg/ml的CHI中磁力搅拌，测定pH为4.0。取50ml超纯水于50ml离心管中调节pH值为4.20，标为洗液2。
将经过预处理以后的基材加入PAA溶液中浸泡6-8min,取出，放入洗液1清洗2-3min，取出，用N2吹干。再将其放入CHI-Ag+溶液中浸泡6-8min，取出，放入洗液2中清洗2-3min，取出，用N2吹干。至此完成一个双层的制备。分别制备3、6、9、12、15双层。
将制备得到的涂层在130℃下加热1h后，裁剪大小为2x8cm并在表面均匀涂抹 2ml 5mg/ml CHI水溶液，在37℃烘箱中烘干。
利用抑菌环实验评价涂层的抗菌性能，结果测得五种涂层对金黄色葡萄球菌的抑菌环分别为3.3mm、9.8mm、19.9mm、20.6mm和23.4mm，并均能在15min内杀灭99.99%的浓度为106CFU/mL的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。五种涂层对成纤维细胞和人晶状体上皮细胞毒性较低，细胞存活率超过79%，具有良好的生物相容性。
实施例 3：
配制2mg/mL的dopa溶液，测定pH值为3.96。取50ml超纯水于50ml离心管中，调节pH为4.0，标为洗液1。
配制1mg/mL的硝酸银溶解于50ml 的2.5mg/ml的CHI中磁力搅拌，测定pH为4.96。取50ml超纯水于50ml离心管中调节pH值为4.93，标为洗液2。
将经过预处理以后的基材加入PAA溶液中浸泡6-8min,取出，放入洗液1清洗2-3min，取出，用N2吹干。再将其放入CHI-Ag+溶液中浸泡6-8min，取出，放入洗液2中清洗2-3min，取出，用N2吹干。至此完成一个双层的制备。分别制备3、6、9、12双层。
将制备得到的涂层在140℃下加热1h后，裁剪大小为2x8cm并在表面均匀涂抹 3ml 5mg/ml CHI水溶液，在37℃烘箱中烘干。
测得四种涂层对大肠杆菌的抑菌环分别为7.9mm、13.2mm、19.7mm和31.4mm，均能在10min内杀灭99.99%的浓度为108 CFU/mL的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。通过细菌死活染色观察到在涂层表面，99.9%以上的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌被杀死（红色），因此可以看出涂层具有高效的杀菌作用。四种涂层对成纤维细胞和人晶状体上皮细胞毒性较低，细胞活性超过TCPS的78%，因此具有良好的细胞相容性。
实施例 4：
配配制3mg/mL的dopa溶液，测定pH值为3.87。取50ml超纯水于50ml离心管中，调节pH为3.92，标为洗液1。
配制2mg/mL的硝酸银溶解于50ml 的3 mg/ml的CHI中磁力搅拌，测定pH为4.09。取50ml超纯水于50ml离心管中调节pH值为4.12，标为洗液2。
将经过预处理以后的基材加入PAA溶液中浸泡6-8min,取出，放入洗液1清洗2-3min，取出，用N2吹干。再将其放入CHI-Ag+溶液中浸泡6-8min，取出，放入洗液2中清洗2-3min，取出，用N2吹干。至此完成一个双层的制备。分别制备6、9、12、15双层。
将制备得到的涂层在140℃下加热1.5h后，裁剪大小为2x8cm并在表面均匀涂抹 3.5ml 5mg/ml CHI水溶液，在37℃烘箱中烘干。
利用透射电镜观察涂层中纳米银的分布，结果显示纳米银分布较为均匀，分别分布在17.8nm、25.6nm、31.9nm、和45.7nm左右。测得四种涂层对大肠杆菌的抑菌环分别为18.7mm、29.5mm、40.6mm和45.2mm，均能在10min内杀灭99.99%的浓度为106CFU/mL的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。通过细菌死活染色观察到在涂层表面，99.9%以上的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌被杀死（红色），因此可以看出涂层具有高效的杀菌作用。四种涂层对成纤维细胞和人晶状体上皮细胞毒性较低，细胞活性超过TCPS的83%，因此具有较好的细胞相容性。
实施例5
配制4mg/mL的dopa溶液，测定pH值为5.01。取50ml超纯水于50ml离心管中，调节pH为5.12，标为洗液1。
配制2mg/mL的硝酸银溶解于50ml 的3 mg/ml的PEI中磁力搅拌，测定pH为4.01。取50ml超纯水于50ml离心管中调节pH值为4.21，标为洗液2。
将经过预处理以后的基材加入PAA溶液中浸泡6-8min,取出，放入洗液1清洗2-3min，取出，用N2吹干。再将其放入CHI-Ag+溶液中浸泡6-8min，取出，放入洗液2中清洗2-3min，取出，用N2吹干。至此完成一个双层的制备。分别制备6、9、12双层。
将制备得到的涂层在150℃下加热1.5h后，裁剪大小为2x8cm并在表面均匀涂抹 3.5ml 5mg/ml CHI水溶液，在37℃烘箱中烘干。
利用透射电镜观察涂层中纳米银的分布，结果显示纳米银分布较为均匀，分别分布在13.4nm、20.6nm和30.5nm左右。测得三种涂层对大肠杆菌的抑菌环分别为14.7mm、29.3mm和35.7mm，均能在10min内杀灭99.9%的浓度为107 CFU/mL的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。通过细菌死活染色观察到在涂层表面，99.9%以上的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌被杀死（红色），因此可以看出涂层具有高效的杀菌作用。三种涂层对成纤维细胞和人晶状体上皮细胞毒性较低，细胞活性超过TCPS的89%，因此具有较好的细胞相容性。
实施例6
配制5mg/mL的dopa溶液，测定pH值为4.45。取50ml超纯水于50ml离心管中，调节pH为4.64，标为洗液1。
配制3mg/mL的硝酸银溶解于50ml 的4mg/ml的CHI中磁力搅拌，测定pH为5.27。取50ml超纯水于50ml离心管中调节pH值为5.18，标为洗液2。
将经过预处理以后的基材加入PAA溶液中浸泡6-8min,取出，放入洗液1清洗2-3min，取出，用N2吹干。再将其放入CHI-Ag+溶液中浸泡6-8min，取出，放入洗液2中清洗2-3min，取出，用N2吹干。至此完成一个双层的制备。分别制备6、9、12双层。
将制备得到的涂层在150℃下加热2h后，裁剪大小为2x8cm并在表面均匀涂抹 5ml 5mg/ml CHI水溶液，在37℃烘箱中烘干。
静态接触角研究发现涂膜后亲水性显著增加，和单纯的基材相比，由78.35±1.83°减到2±1.62°。利用透射电镜观察涂层中纳米银的分布，结果显示纳米银分布较为均匀，分别分布在12.1nm、18.7nm和26.4nm左右。测得三种涂层对大肠杆菌的抑菌环分别为19.8mm、28.7mm和39.4mm，均能在10min内杀灭99.99%的浓度为107 CFU/mL的金黄色葡萄球菌和大肠杆菌。三种涂层对成纤维细胞和人晶状体上皮细胞毒性较低，细胞活性超过TCPS的95%，因此具有较好的细胞相容性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例，凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理前提下的若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。