一种荧光PCR熔解曲线法检测HLA基因型的试剂盒的制作方法

本发明属于荧光定性pcr领域，具体涉及一种荧光pcr熔解曲线法检测hla基因型的试剂盒。

背景技术：

由主要组织兼容性复合体编码的分布于生物体有核细胞表面的抗原性物质，对人类而言，被称为人类白细胞抗原(humanleukocyteantigen,简称hla)。位于人类第六对染色体短臂上的人类白细胞抗原分子基因具有相当高的多样性，随着人类白细胞抗原分子基因序列的解密后发现，多数人类白细胞抗原之间仅有极少数、甚至只有一个胺基酸的差异存在，因此以过去的血清学方式通常无法如核酸检测方式有效的进行人类白细胞抗原型别鉴定区分。

根据多年来的研究发现，几乎所有血球及组织细胞，均具有hla抗原之表现，此种代表着个体特异性的抗原是器官移植时引起免疫排斥反应之主要物质；。hla抗原型系由复杂的基因排列及其分子产物所形成，涉及免疫的调节及细胞的分化，为人体最复杂之基因多型性系统。hla抗原包括有a、b、c、d（dr、dq、dp）e、f等等基因，其中a、b、dr、dq是本产品锁定的分型基因。

过去的检测hla-abdrdq主要是用血清学方法，操作步骤多，且结果判读时存在主观性，血清、补体以及分离淋巴细胞的质量，均会影响结果的准确性，随着基因序列解密后，发现多数型别间只存在极少的差异，血清学无法一一呈现，使得使用聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，pcr）为主的核酸检测，逐渐成为检测hla抗原主流方法之一。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种荧光pcr熔解曲线法检测hla-a、hla-b、hla-drb1、hla-dqb1基因分型的试剂盒。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明在一个试剂盒的96孔光学反应板内包含hla-a、hla-b、hla-drb1、hla-dqb基因分型检测及内部质控监测，pcr扩增后产生的双股dna产物可与sybrgreeni结合，不同产物的双股dna熔解温度不同(tm值)，经过低温至高温的熔解曲线分析，当双股解离至其tm值时，荧光会有巨幅的下降，以此分辨特异性产物，透过侦测96孔熔解曲线分析的结果，综合判断hla-a、hla-b、hla-drb1、hla-dqb1的低分辨率基因分型，从而辅助器官移植的配型诊断。

试剂盒共包含4个组分：光学反应板，t3反应液，核酸聚合酶，光学封膜，

光学反应板包含262条特异性引物，其中，1~256号为特异性引物，序列如seqidno.1-256所示，257~262号为内控引物，序列如seqidno.257-262所示；

核酸聚合酶包含taqdna聚合酶；

引物序列：

试剂组分配方：

t3反应液#配方：50mmkcl、20mmtris-hcl、2.0mmmgcl2、0.2mmdntp、sybrgreeni0.1×、roxreferencedye30nm。

核酸聚合酶配方：taq酶5u/µl。

本发明的优点在于：

优点：本发明的优势为1、荧光pcr程序结束后，可直接判读，无需后续实验操作，检测只需2小时；2、包含hla-a、hla-b、hla-drb1、hla-dqb等常规器官移植所需检测的基因型别。

有益效果：1、为临床器官移植提供快速的结果参考；2、一次检测覆盖临床常规检测的hla基因座。

附图说明

图1为熔解曲线分析的典型阴性结果。tm值为77.32℃，符合阴性判断范围（75~79.5℃）。

图2为熔解曲线分析的典型阳性结果。tm值为89.56℃，符合阳性判断范围（87~92℃）。

图3为熔解曲线分析的典型阳性结果。tm值为86.62℃，符合阳性判断范围（84~89℃）。

图4熔解曲线分析的典型阳性结果。tm值为86.5℃及90.15℃，符合阳性判断范围（83.5-87.9℃及88-92℃）。

具体实施方式

实施例1

1、反应体系的配制

（1）光学反应板的制备

取10ml容量瓶，分别依96孔的配方表加入该孔指定的0.5od/ml专一性引物1500μl及0.5od/ml内部质控引物375μl，用无菌水补足体积到10ml，翻转使之充分混匀，将液体转移到15ml离心管中，利用自动化移液工作站分注到96孔的深孔原料盘后，使用原盘式分注工作站将原料盘中的引物混合物分注到光学反应板内，短暂离心后至于温度22±2℃、湿度10±5%rh的环境进行16-24小时干燥，经袋装密封后即为可使用的光学反应板，于-20℃保存备用。

（2）t3反应液的制备

取100ml容量瓶，分别加入6mkcl0.833ml，1mtris-hcl2ml，1mmgcl20.2ml，100mmdntp0.2ml，10×sybrgreeni1ml，25μmroxreferencedye0.12ml。用双重蒸馏水补足体积到100ml，以转子使之充分混匀，按1.53ml/支分装到离心管中，-20℃保存备用。

2、核酸提取

采用已备案的核酸提取试剂盒进行核酸提取，提取后用微量紫外分光亮度计测核酸纯度，其od260/od280应在1.6~2.0之间。

3、加样上机

（1）反应混合物配制

取出光学反应板、t3反应液解冻，取出核酸聚合酶保持于冰盒上，取9.2µl的核酸聚合酶加入t3反应液中，震荡混匀，短暂离心。

（2）加样

取15µl的上述混合液分装至abdrdq反应板的a1反应孔，于a1孔加入3μl的灭菌超纯水，然后将提取好的样本取303µl加入t3反应液的混合液中，震荡混匀，短暂离心后，分装18µl至光学反应板的其余反应孔中。将光学封膜密封后，短暂离心，立即进行pcr扩增反应。

（3）上机检测

1）循环条件设置

96℃2分30秒；进入以下循环：96℃15秒，65℃1分钟，共10循环；进入以下循环95℃15秒，62℃50秒，72℃30秒（信号收集），共22循环；进入熔解曲线分析:95℃15秒，60℃1分钟，60℃至95℃以1%的升温速率执行信号收集，95℃15秒，60℃15秒。

2）仪器检测信道选择

荧光素设定为fam、rox。

4、结果判断

（1）a1孔不出现75-79.5的tm值；（2）每孔的阴性与阳性判断应参考下表的判断值范围；(3)appliedbiosystems7500仪器选择转存为含results和multicomponentdata的txt文件，然后导入hla-abdrdq结果分析软件中进行分析，直接得出hla等位基因的分型检验结果。

实施例2

1、试剂特异性验证

（1）实验样本

采取6份特异性样本对试剂的特异性进行验证，样本购自国际认可的ihwg(http://www.ihwg.org/cellbank/)标准品。

（2）实验过程

用hla-abdrdq(荧光pcr熔解曲线法)核酸检测试剂盒分别检测以上6份特异性样本，分析检测结果，验证试剂的特异性。

（3）实验结果

6份特异性样本检测结果皆符合预期，表明试剂特异性好，无交叉反应情况。具体结果见下表：

特异性检测结果

2、试剂精密性验证

（1）实验样本

采取1份精密性样本（浓度为10ng/μl）对试剂的精密性进行验证，样本购自国际认可的ihwg(http://www.ihwg.org/cellbank/)标准品。

（2）实验过程

用hla-abdrdq(荧光pcr熔解曲线法)核酸检测试剂盒分别检测以上精密度样本10次，分析检测结果，验证试剂的精密性。

（3）实验结果

精密性样本批内变异系数（cv值）均＜5%，表明试剂重复性好。具体结果见下表：

精密性检测结果

3、试剂最低检测限验证

（1）实验样本

取不同基因型的5临床样本，稀释核酸浓度至10ng/µl进行扩增，验证试剂的最低检测限。

（2）实验过程

用hla-abdrdq(荧光pcr熔解曲线法)核酸检测试剂盒分别重复检测以上最低检测限10次，分析检测结果，验证试剂的最低检测限。

（3）实验结果

最低检测限验证结果符合预期型别，试剂的最低检测限为10ng。具体结果见下表：

实施例3：检测30例临床样本的结果

1、按照实施例1所示的配制方法，配制试剂盒相关组分，于-20℃保存备用。

2、采用德必碁生物科技（厦门）有限公司生产的核酸提取试剂（全血型）提取30例临床样本的基因组dna，用紫外分光亮度计检测dna样本的纯度，30例样本od260/od280皆在1.6~2.0之间。

3、按照实施例1所示的步骤，进行dna加样并上荧光定量pcr仪进行检测，本次使用的仪器为abi7500.

4、按照实施例1所示判断标准，对结果进行判读并统计，结果如下表：

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>德必碁生物科技(厦门)有限公司

<120>一种荧光pcr熔解曲线法检测hla基因型的试剂盒

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<210>99

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>99

gtgccccgcttcatct16

<210>100

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>100

tggagatctgtgtctc16

<210>101

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>101

cgagtccgaggatggc16

<210>102

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>102

cttggagatctgtgtg16

<210>103

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>103

gcgggcatgtccagtc16

<210>104

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>104

gtatctgcggagcccg16

<210>105

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>105

cgagtccgaggatggc16

<210>106

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>106

tggttgtagtagcgga16

<210>107

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>107

tgggctacgtggacgg16

<210>108

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>108

atactccggcccctct16

<210>109

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>109

acgtggacgacacgct16

<210>110

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>110

tgtgccttggccttgc16

<210>111

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>111

ccgcgagtcagaggac16

<210>112

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>112

cgcaggttccgcaggc16

<210>113

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>113

gagccccgcatcatct16

<210>114

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>114

gcagggtccacaggtc16

<210>115

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>115

ctggcataaccagtta16

<210>116

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>116

gccactccaagcacgt16

<210>117

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>117

gcaggagaggccggaa16

<210>118

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>118

tggttgtagtagcgga16

<210>119

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>119

cggagcgcgagcgtta16

<210>120

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>120

tgcggagctccaactg16

<210>121

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>121

gcgggcataaccagtt16

<210>122

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>122

tgccctccaggtaggt16

<210>123

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>123

tcacaccctccagagg16

<210>124

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>124

gcgcgctcctgcttgt16

<210>125

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>125

aggtatttccacacct16

<210>126

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>126

ctcctgctctatccat16

<210>127

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>127

gcgggcatgaccagta16

<210>128

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>128

ctgtcctgttccgcca16

<210>129

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>129

gcgggcataaccagta16

<210>130

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>130

ctcagctgttccgcca16

<210>131

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>131

tatttctacaccgcca16

<210>132

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>132

gcaggttctctcggtc16

<210>133

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>133

gcaggctcactcggtc16

<210>134

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>134

gccaggtctcacatca16

<210>135

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>135

aggtatctgcggagcg16

<210>136

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>136

ggaacacacagatctg16

<210>137

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>137

cggggtcacacaccgt16

<210>138

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>138

agggtctcacacttgg16

<210>139

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>139

aggtatctgcggagcg16

<210>140

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>140

cgagtccgaggatggc16

<210>141

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>141

tgcctggcgcttgtac16

<210>142

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>142

aggtatttctacaccg16

<210>143

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>143

gcagggtccacaggtc16

<210>144

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>144

ccgcgagtcagagaga16

<210>145

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>145

aagtctgtgtgttggt16

<210>146

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>146

ttcgacagcgacgcca16

<210>147

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>147

tagtagcggagcgcgg16

<210>148

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>148

gccatgaggtatttcc16

<210>149

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>149

ctcctgctctatccat16

<210>150

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>150

ctcacacttggcagac16

<210>151

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>151

gccactccacgcacag16

<210>152

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>152

ctacgtggacgacacc16

<210>153

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>153

tgtgcctggaccttgt16

<210>154

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>154

tgtgccttggccttgc16

<210>155

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>155

catccagaggatctat16

<210>156

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>156

ccgcggtccaggagct16

<210>157

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>157

gcgggctccgtgggtg16

<210>158

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>158

aggttccgcaggctct16

<210>159

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>159

ctgaacgaggacctga16

<210>160

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>160

ctcagctgttccgcct16

<210>161

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>161

cacagactgtccgagt16

<210>162

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>162

cggggtcactcaccgt16

<210>163

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>163

tatttctacaccgcca16

<210>164

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>164

tgtgcctggaccttgt16

<210>165

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>165

tcacaccctccagagc16

<210>166

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>166

ctcagctgttccgcca16

<210>167

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>167

ctcacatcatccaggt16

<210>168

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>168

gccactccaagcacag16

<210>169

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>169

ccgcgagtccgaggac16

<210>170

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>170

ggtaagtctgcgcgga16

<210>171

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>171

ggaacacacagatctt16

<210>172

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>172

tggttgtagtagcgga16

<210>173

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>173

ctccgcggataccgg15

<210>174

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>174

ctccacgcaagtgcca16

<210>175

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>175

ctacgtggacgacacc16

<210>176

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>176

tggagatctgtgtctc16

<210>177

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>177

ggagccccgattcatt16

<210>178

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>178

tggttgtagtagcgga16

<210>179

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>179

tctcccagcgcaagtt16

<210>180

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>180

ccagcgcgcaccagct16

<210>181

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>181

gagccccgcttcatct16

<210>182

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>182

tgtgcctggaccttgt16

<210>183

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>183

gacacgctgatcgtga16

<210>184

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>184

gacacccagatcgtga16

<210>185

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>185

tggttgtagtagcgga16

<210>186

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>186

gacacscagttcgtga16

<210>187

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>187

tagtagccgcgcaggt16

<210>188

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>188

ctcacacttggcagac16

<210>189

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>189

gccactccaagcacgt16

<210>190

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>190

tacgtccgagtgtcaa16

<210>191

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>191

tgtcgaagcgcacgaa16

<210>192

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>192

gcagcttaagtttgaa16

<210>193

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>193

gcctctgctccaggag16

<210>194

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>194

cagcttaagtttgaat16

<210>195

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>195

gctcgtcttccaggat16

<210>196

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>196

tgtggcagcctaagag16

<210>197

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>197

cggcacgcacctgct15

<210>198

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>198

tgtggcagcctaagag16

<210>199

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>199

gcctgtcttccaggag16

<210>200

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>200

gcctgtcttccaggaa16

<210>201

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>201

ggagcgggagcggta15

<210>202

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>202

ttccagtactcggcat16

<210>203

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>203

tggagtactctacgtc16

<210>204

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>204

gttatggaagtatctc16

<210>205

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>205

cttcaccaacgggacc16

<210>206

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>206

gttgtgtctgcatacg16

<210>207

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>207

tggagcaggttaaaca16

<210>208

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>208

actgtgaagctctcca16

<210>209

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>209

actgtgaagctctcac16

<210>210

<211>15

<212>dna

<213>人工序列

<400>210

ggggcggcatgatga15

<210>211

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>211

gcactgtgaagctctc16

<210>212

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>212

cggagcgcgtgcgtta16

<210>213

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>213

cggagcgcgtgcgtct16

<210>214

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>214

cgcggtaccccacctc16

<210>215

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>215

cgcggaacgacacctc16

<210>216

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>216

tggagtactctacggg16

<210>217

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>217

cgctgtcgaagcgcag16

<210>218

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>218

gtcttgtgagcagaag16

<210>219

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>219

tgcggagctccaactg16

<210>220

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>220

tggagtactctacgtc16

<210>221

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>221

gctcgtcttccaggat16

<210>222

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>222

gcctgtcttccaggaa16

<210>223

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>223

ataaccaggaggagtt16

<210>224

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>224

ctgttccagtactcct16

<210>225

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>225

tggagtactctacgtc16

<210>226

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>226

ctgttccagtgctccg16

<210>227

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>227

ctgttccagtactcgg16

<210>228

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>228

ctgttccagtactcag16

<210>229

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>229

ctggacagatacttcc16

<210>230

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>230

caataggtgtccacct16

<210>231

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>231

cgctgggtcagcctgc16

<210>232

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>232

tgcacaccgtgtccaa16

<210>233

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>233

tggagtactctacgtc16

<210>234

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>234

ctgttccagtgctccg16

<210>235

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>235

cataaccaggaggaga16

<210>236

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>236

cgcggcccgactctgc16

<210>237

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>237

cataaccaggaggaga16

<210>238

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>238

agtaggtgtccaccag16

<210>239

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>239

tggcagggtaagtata16

<210>240

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>240

cctggccccgcctgtc16

<210>241

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>241

tggagtactctagggg16

<210>242

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>242

agtaggtgtccaccag16

<210>243

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>243

cgggtgcggtatctgc16

<210>244

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>244

catgcttacctcgcct16

<210>245

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>245

ttgctggaaagacgcg16

<210>246

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>246

actgtgaagctctcac16

<210>247

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>247

taccagtttaagggcc16

<210>248

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>248

gtgtctggtcacaccc16

<210>249

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>249

tgcagcaggataagta16

<210>250

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>250

ttccagtactcagcgt16

<210>251

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>251

cacgtttcttggagct16

<210>252

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>252

ggccccgctactgctc16

<210>253

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>253

ttttctcctagtccaa16

<210>254

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>254

ccttctcttcctggct16

<210>255

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>255

tggagtactctacgtc16

<210>256

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>256

tccacccggacccgct16

<210>257

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>257

tctggacatgcttgct16

<210>258

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>258

tggaggagactccaaa16

<210>259

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>259

tctggacatgcttgct16

<210>260

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>260

tgtacataggaagacc16

<210>261

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>261

aggctgtgtatttgtc16

<210>262

<211>16

<212>dna

<213>人工序列

<400>262

tgctcaatgatagctc16