一种半边莲与通泉草的分子鉴别引物及方法与流程

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种半边莲与通泉草的分子鉴别引物及方法。

背景技术：

半边莲(lobeliachinensislour.)为桔梗科多年生小草本植物，全草入药，是常用中药之一。《本草纲目》载：“生阴湿塍堑边，就地细梗引蔓，节节而生细叶，秋开小花，淡红紫色，止有半边，如莲花状。”故称为“半边莲”，分布较广，主产于福建、江苏、浙江、安徽、江西、广东与广西等省。具有清热解毒，利水消肿等功效，主治毒蛇咬伤，烧伤，扁桃体炎，阑尾炎，痈肿疗疮，肝硬化腹水及多种癌症等，全草含有生物碱类，黄酮类与多炔类等成分，现代药理实验证实具有镇痛消炎、抗肿瘤、抑制α-葡萄糖苷酶、调节内皮细胞与抗心肌缺血再灌注等方面作用，已被广泛应用于各种临床实践中，且取得了良好的治疗效果。

玄参科植物通泉草（mazuspumilus）同为矮生草本，生态位宽度较大，在中国分布广泛，适应性强，资源较丰富，由于与半边莲生长环境相似，且两者全草有具有相似的形态特征等原因，市场上有以通泉草的干燥全草冒充半边莲的现象。伪品通泉草与半边莲的主治功效不一样，不能代替半边莲药用，药材在市场流通时需要准确相互辨别。目前，对半边莲的鉴定主要通过性状鉴别、显微鉴别与理化鉴别等传统生药鉴定方法，而传统生药鉴定方法比较依赖个人经验，不利于推广。随着分子生物学的发展，dna条形码(dnabarcoding)鉴别技术因不受被检测对象形态特征的影响，通用性强，重复性和稳定性高，有统一易于掌握的操作标准和流程，方便于推广等优点，已经成为中药鉴定有效工具。

长期以来，植物dna条形码多选用叶绿体上的dna序列片段，其中，rbcl在光合作用及光呼吸中起关键性作用，受其功能的限制，rbcl进化速度较慢，主要存在种以上水平的遗传变异，在物种水平遗传变异较小，rbcl序列片段全长约1300bp，具有引物通用性强、易扩增、易比对等特点，在pcr分子鉴定中可以提供长度差异较明显的扩增片段进行辨别，因为物种鉴别方便，实际研究中常选取其作为分子鉴定的dna条形码。本研究拟对来源于不同居群的半边莲与通泉草的rbcl序列进行聚类分析，并利用其rbcl区的snp位点，基于这些位点设计引物，利用该特异引物分别建立特异扩增半边莲与通泉草的pcr体系，并在pcr产物中加入sybrgreeni染料对真伪结果进行快速检测。结合dna快速提取技术，可大大提高检测效率，从而建立2种药材便捷的鉴定方法。

技术实现要素：

本发明的目的在于提供一种半边莲与通泉草的分子鉴别引物及方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种半边莲与通泉草的分子鉴别引物，所述引物序列为：半边莲的鉴别引物lcf：atgtcaccacaaacagaractaaagc；通泉草的鉴别引物mpf：gcgaagaaatgatgaaaagaggtat；共同反向引物lmr：catttccccacggatgtcctaa。

一种半边莲与通泉草的分子鉴别方法，反应体系为：总体积20μl，其中包括taq酶1u，10×buffer缓冲液2.0μl，所述的引物各0.2μm，dntp20nm，ddh2o补足20μl；pcr反应程序：95℃预变性4min后，94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸90s，35个循环后72℃延伸8min；pcr产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳，以goldview染色观察。

本发明的优点在于：

本发明方法的关键在于特异鉴别引物的设计，其难易程度在于可用于鉴别的snp位点的多寡，应用连续2-3个snp位点用于特异鉴别，可提高特异鉴别pcr的稳定性与重复性。另外，由于特定样品中叶绿体dna比核dna具有更多的拷贝数，基于核dna的分子鉴别方法比较容易受到dna降解的影响，应用来源于叶绿体dna的条形码进行分子鉴别更适于干燥的中药材的分子鉴别。经典pcr检测方法，需经制胶，凝胶，电泳与成像等多个步骤才能完成检测，比较繁琐，本发明可对样品的阳性与阴性检测进行快速识别，大大提高了检测速度，为本发明借鉴该方法建立了快速简便的检测体系。

附图说明

图1基于nj法构建rbcl序列的半边莲与通泉草的系统聚类树。

图2半边莲与通泉草鉴别方法示意图。

图3特异性pcr鉴别半边莲与通泉草凝胶电泳与荧光检测图（电泳图上方为荧光检测图），(m:dl2000dnamaker;1-9:来源不同产地的半边莲样品，10-16：不同产地的通泉草样品)。

图4特异性pcr鉴别通泉草与半边莲凝胶电泳与荧光检测图（电泳图上方为荧光检测图）(m:dl2000dnamaker;1-7:来源不同产地的通泉草样品，8-16：不同产地的半边莲样品)。

具体实施方式

1仪器与材料

pcr仪（eppendorf，型号5332），低温冷冻离心机（eppendorf，型号5810r）,微量移液器（eppendorf）,电泳系统（北京市六一仪器厂，型号dyy—12），凝胶成像分析仪（bio-radchemidocxrs），手持式紫外灯。

ctab提取液，tae缓冲液，琼脂糖（promega公司），goldview(北京索莱宝科技有限公司)，dnataq聚合酶（takara公司），1000*sybrgreeni染料(invitrogen公司)，三氯甲烷、无水乙醇、异丙醇均为国产分析纯。

本实验样品是由福建中医药大学鉴定并收集，采自不同产地的半边莲(lobeliachinensislour.)9份，通泉草（mazuspumilus）7份。

表1实验材料概况

2方法

2.1样品基因组dna的提取

采取ctab法提取干燥样品的基因组dna，所提dna稀释后做为pcr模版用于后续实验检测。

2.2扩增受试样品的rbcl序列

利用通用引物rbclf与rbclr扩增rbcl序列：总体积20μl，其中包括taq酶1u，10×buffer缓冲液2.0μl，引物各0.2μm，dntp20nm，ddh2o补足20μl。pcr反应程序:95℃预变性4min后，94℃变性30s，55℃退火60s，72℃延伸90s，35个循环后72℃延伸8min。pcr产物用1.2%的琼脂糖凝胶电泳，以goldview染色观察。

2.3聚类分析

对16个受试样品的rbcl序列进行测序，获得16条rbcl序列，用clustalx2.1软件进行多重序列比对，利用mega5.0进行邻接（nj）系统聚类树分析。

2.4引物设计

用clustalx2.1软件对所有序列进行多重序列比对，分析半边莲与通泉草的2组样品之间的snp位点，筛选2组样品之间的鉴别位点，根据特异引物的设计原则，利用鉴别位点设计半边莲与通泉草的相互鉴别的特异引物。

2.5特异性pcr鉴别受试半边莲与通泉草样品

利用所设计的可鉴别半边莲与通泉草的特异性引物lcf、mpf分别与共用反向引物lmr构建一个pcr体系，反应体系同上，通过退火温度梯度实验(50，50.5，51.6，53.2，55.1，56.7，57.6，58℃)考察不同退火温度对该pcr扩增体系扩增效果的影响。为了建立简便的快速鉴别方法，在20μlpcr产物中加入2μlsybrgreeni染料于365nm紫外波长下检测荧光。

3结果分析

3.1聚类分析

经测序，获得半边莲与通泉草所有受试样品的rbcl序列，用clustalx2.1软件对所有序列进行多重序列比对，进一步应用meg5.0软件构建nj系统聚类树分析所有受试样品rbcl序列，分析其相互进化关系，见图1。nj系统聚类树结果显示9个不同来源的半边莲样品单独聚为一类，与7个不同来源的通泉草样品没有交叉，表明rbcl序列适用于半边莲与通泉草之间的相互鉴别，可应用rbcl序列建立半边莲与通泉草的分子鉴别方法。

3.2引物设计

用clustalx2.1软件对所有受试样品rbcl序列进行多重序列比对，筛选获得半边莲与通泉草的snp位点，筛选二者之间的特异鉴别位点，设计半边莲的鉴别引物lcf，通泉草的鉴别引物mpf，这2条特异引物可与共同反向引物lmr分别构建特异pcr，所构建的pcr鉴别体系中，半边莲样品则可产生969bp的pcr扩增片段，而通泉草样品则可产生501bp的pcr扩增片段。根据pcr扩增片段的大小则可进行样品的鉴别，引物设计位置及引物序列见图2及表2。

表2本发明所用引物

3.3特异性pcr快速鉴别受试半边莲与通泉草样品

利用半边莲与通泉草的特异性鉴别引物lcf、mpf分别与共同的反向引物lmr构建pcr反应体系，通过设计退火温度梯度，分析不同退火温度的pcr扩增效果，结果显示，此反应体系在退火温度51.6～58℃条件下均能扩增出半边莲969bp的特征鉴别条带，通泉草601bp的特征鉴别条带。

以退火53℃，应用以上建立的pcr反应体系，分别对受试所有半边莲与通泉草样品进行检测，受试9个半边莲样品，7个通泉草样品均能检测到相应的阳性特征条带（见图3-图4），而相对应的阴性样品则扩增不到条带。表明该pcr体系具有特异性，可以用于鉴别半边莲与通泉草样品。

为了建立更加快捷简便的检测方法，添加2μlsybrgreeni染料于20μlpcr产物中，然后于365nm紫外波长下检测荧光，所建立的pcr鉴别体系所检测的阳性样品均可见荧光，而阴性样品均无荧光（见图3-图4，电泳图上方为荧光检测图）。表明该方法可用于对受试样品的快捷鉴别。

4小结

dna条形码技术通过比较一段通用dna片段，对物种进行快速、准确的识别和鉴定，是近年来生物分类和鉴定的研究热点。在中药鉴定领域，dna分子标记可以弥补和克服传统鉴定方法的一些问题与缺点，为中药鉴定提供了一个强大的工具，应用该方法鉴定中药原植物及其药材和饮片，取得了快速发展，大大加快了中药鉴定标准化的进程。基于条形码snp位点的特异性pcr方法对中药基源进行鉴定为解决药材的识别提供了快速有效的分子手段，有利于解决日益扩大的中药材国内与国际贸易中需要准确快速鉴定药用植物及其混伪品的问题。

该方法的关键在于特异鉴别引物的设计，其难易程度在于可用于鉴别的snp位点的多寡，应用连续2-3个snp位点用于特异鉴别，可提高特异鉴别pcr的稳定性与重复性。另外，由于特定样品中叶绿体dna比核dna具有更多的拷贝数，基于核dna的分子鉴别方法比较容易受到dna降解的影响，应用来源于叶绿体dna的条形码进行分子鉴别更适于干燥的中药材的分子鉴别。经典pcr检测方法，需经制胶，凝胶，电泳与成像等多个步骤才能完成检测，比较繁琐，本发明方法对样品的阳性与阴性检测进行快速识别，大大提高了检测速度，为本研究借鉴该方法建立了快速简便的检测体系。本发明显示特异性pcr方法检测灵敏高，20μlpcr体系中20ng模板dna即可检测到阳性条带，实验重复性好，可用于半边莲与通泉草植物及其药材的简便鉴别，也将为今后有关半边莲与通泉草的相互鉴别提供思路。由于二者的两者功效和主治均不相同，本技术也为防止药材的混用误用提供依据，具有实际应用价值。

以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所做的均等变化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。

sequencelisting

<110>福建农林大学

<120>一种半边莲与通泉草的分子鉴别引物及方法

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