专利名称：辣椒疫病菌分子检测引物及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术的领域，更具体涉及一种辣椒疫病菌分子 检测引物及其应用。
背景技术：
辣椒疫病是由辣椒疫霉菌(户/^o; /^om co/wZc/)侵染引起的一种毁灭性病害，该病于 1918年首次在美国新墨西哥州发现，现已成为世界各国辣椒生产上的主要病害(Ristaine et al.，1999)。辣椒疫霉菌寄主范围广，除辣椒外，还可侵染茄科和葫芦科的番茄、茄子、西瓜和 西葫芦等50多种作物(Tianetal.，2004; Hausbeck， et al., 2004)，其发生面积广，危害十分严重， 在适宜发病条件下，病害大流行可造成寄主作物绝收(Gevensetal.,2007;姜彦全等,2008; 刘学敏等，2007)。同时，辣椒疫霉菌是一种土传病原菌，它可以经雨水、土壤、病残体等从 发病区向未发病区传播，而且其侵染能力强，由其引起的病害多属于多循环病害，在较短的 时间内可造成植株死亡、根茎和果实腐烂。因此，开展辣椒疫霉菌检测，防止其从发病区向 未发病区传播，以及在其发病初期进行诊断检测，对辣椒疫病的及时控制具有重要意义(Silvar， etal,2005)。
自从发现辣椒疫霉菌以来，各国研究人员便对其检测技术进行研究，传统的检测方法是 采用选择性培养基从土壤、植物组织或水体中分离菌株，再对这些菌株的形态等进行鉴定， 来确定是否存在辣椒疫霉菌，或者用肉眼和借助显微镜技术对发病症状进行判定是否由辣椒 疫霉菌引起的病害。传统的检测方法不仅费时、准确度低，而且要求检测人员要有丰富的经 验，最重要一点是它不能满足病害防治中制定最佳防治时期的需求，因此传统病原学检测方 法已不能满足现代植物病理学研究的需要，因其很容易错过病害防治的最佳时期(Kelly， et al.， 2006; Schena， et al., 2008)。
随着分子生物学技术的发展，应用PCR技术对病原菌进行特异、灵敏的快速分子检测的 成功例子己越来越多(Li etal，2003)。国内外有学者利用基于ITS碱基序列设计引物对辣椒疫 霉菌的分子检测开展研究(Silvar et al., 2005; Zhang, et al.， 2006)，但是ITS在病原菌的近缘种 之间变化很小，从ITS序列上设计引物很难将两个相以性高的种区分开(Martin and Tooley， 2003)，很难从ITS序列上对它们进行区分(Brasier et al,2004)。因此要对辣椒疫霉菌进行高灵 敏性和特异检测，应从疫霉菌其它基因上设计引物进行检测。已有研究表明，疫霉菌属中的YPT1基因(ras-related protein)含有多个外显子和内含子，多个外显子具有保守性，而这些 内含子在不同种之间具有多变性，非常适合于设计引物进行疫霉属卵菌近缘种的分子检测， 区分不同种的疫霉菌(Schenaeta1，2006)。
发明内容
本发明的目的是提供一种辣椒疫病菌分子检测引物及其应用，针对现有技术中辣椒疫病 菌的生物学检测方法所需周期长、目前辣椒疫病菌分子检测测方法特异性差，灵敏度低的问 题，提供一种辣椒疫病菌的特异分子检测引物，方法结果可靠、易于操作、特异性强、灵敏 度高，可用于带菌的植物组织和土壤的高灵敏度快速分子检测，同时可用于田间辣椒疫病的 早期诊断和病菌的监测和鉴定，此技术对于辣椒疫霉菌引起病害显症之前的早期监测，确定 病害防治最佳时期具有十分重要的意义。
实现本发明的目的包括下列步骤
1. 根据辣椒疫病YPT基因序列的特异性，设计了对辣椒疫病菌具有特异扩增作用的一 对PCR引物，即特异分子检测引物的序列为
上游引物PCA1F: 5'- GTATAGCAGAGGTTTAGTGAA -3， 下游引物PCA2R: 5'- ACTGAAGTTCTGCGTGCGTT -3，，
2. 辣椒疫病菌特异分子检测体系的建立
(1) 被辣椒疫病菌、辣椒疫病菌感染的植物组织或存在辣椒疫病菌的土壤中提取DNA;
(2) PCR扩增PCR反应体系25pl，包括2.5pl 10xPCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg2+， 50nmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCA1F和PCA2R各0.5pmol/L和10ng模板 DNA， d.d.H20补足25pl， PCR反应条件为95°C预变性2min; 94。C变性lmin,60。C退火 30 sec ，72。C延伸lmin共35个循环；72 。C延伸10 min。
① 当在用于植株组织中存在辣椒疫病菌时，采用CTAB法提取辣椒疫病菌的DNA，按如 下的PCR反应体系和反应条件用所设计的引物进行PCR扩增PCR反应体系25^1，包括 2.5^1 10xPCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg2+， 50nmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引 物PCA1F和PCA2R各0.5pmol/L和lOng模板DNA, d.d.H20补足25^1， PCR反应条件为 95°C预变性2min; 94。C变性lmin， 60。C退火30sec， 72。C延伸lmin共35个循环；72 °C 延伸10min。
② 当在土壤样品中存在辣椒疫病菌条件下，采用土壤DNA提取法(步骤见具体实施例4) 提取土壤中辣椒疫病菌的DNA，按如下的PCR反应体系和反应条件用所设计的引物进行PCR 扩增PCR反应体系25^il，包括2.5^1 10xPCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg2+， 50nmol/L dNTPs，1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCAIF和PCA2R各0.5nmol/L和lOng模板DNA， d.d.H20补 足25pl， PCR反应条件为95°C预变性2min; 94'C变性lmin， 60。C退火30 sec， 72'C延 伸lmin共35个循环；72 'C延伸10 min。
(3) 然后将8(ilPCR产物用重量浓度1.5。/。琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫外 灯下根据扩增产物的大小判定结果。
(4) 如果能特异性地扩增出364bp产物时，即可判断所述的植株组织或土壤样品中存在 辣椒疫病菌；否则所述的植株组织或土壤样品中未存在辣椒疫病菌。
本发明的关键性技术是辣椒疫病菌的高效特异扩增的引物序列及其扩增方法。为了获得 辣椒疫病菌的特异引物序列，本发明以我国福建、安徽和北京等省的42株辣椒疫病菌和多个 疫霉属近缘种以及常见的几种病原真菌为供试材料，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA， 具体方法如下取50mg冷冻干燥后的菌丝粉于1.5ml离心管中，加入卯Opl重量浓度2% CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液(重量浓度2。/。CTAB; 100 m mol/L Tris-HCl, PH 8.0; 20mmol/LEDTA， pH8.0; 1.4 mol/LNaCD禾B 90^1重量浓度10% SDS (十二烷基苯磺酸钠) 后混匀，于55 6(TC水浴1.5h，每10min振荡混匀一次，水浴1.5h后离心(12,000rpm)15min，
取上清液加入等体积的酚、氯仿和异戊醇混合溶液，所述混合溶液中酚氯仿异戊醇的体
积比为25 : 24 : 1,离心(12,000rpm)5 min，取上清液(水相)，加入等体积氯仿抽提一次 (12,000rpm离心5min)，吸上清液，加0.1体积的3mol/LNaAC溶液和2体积的—20。C无水 乙醇，一20。C下沉淀30min后12，000rpm离心5min，轻轻地倒去上清液，加入700W体积浓 度70%的一20"乙醇进行洗涤(稍离心，倾掉上清)，在超净工作台上自然晾干无酒精味后 用lxTE (10mmol/LTris-HCL， 0.1mmol/LEDTA， pH8.0)溶液进行溶解，得到DNA溶液， 用紫外分光光度计检测DNA浓度并稀释至50ng4U待用。在辣椒疫病菌特异DNA片段序列 的基础上应用ClustalX软件比对设计特异引物，经对供试菌株和42株辣椒疫病菌的特异性进 行PCR验证(具体的反应体系是PCR反应体系25^1，包括2.5^1 10xPCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg2+, 5Opmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCA1F和PCA2R各0.5pmol/L和10ng 模板DNA， d.d.H20补足25pd， PCR反应条件为95°C预变性2min; 94。C变性lmin， 60°C 退火30sec， 72'C延伸lmin共35个循环；72 'C延伸10min，此特异引物在辣椒疫病菌上特 异性地扩增出364bp的产物。这说明该引物可被用于生产实践中发病植物组织和土样中辣椒 疫病菌快速可靠的检测和鉴定。
本发明有益效果本发明针对现有技术中存在的缺陷，通过测定辣椒疫病菌及其它疫霉 菌的YPT1基因，并进行多重比对分析，针对辣椒疫病菌的YPT1基因内含子特异序列设计出了一对引物，用于带辣椒疫病菌的植物组织和土壤的高灵敏度快速分子检测，建立辣椒疫 霉菌快速、简便、特异性强、灵敏度高的实时定量监测技术体系。此技术可应用于辣椒疫霉 菌引起病害显症之前的早期监测，对于确定病害防治最佳时期具有重要的作用，为防治策略 的制定提供科学依据。
本发明方法适用于土样和植物组织中辣椒疫病菌的快速可靠的检测和鉴定，对于农业生 产中辣椒疫病菌引起的病害的防治具有重要的实用价值；本发明与现有技术相比，具有以下 的技术优势和积极效果 .
1、 特异性强本发明检测方法是利用辣椒疫霉菌的YPT1基因具有保守性外显子和多变 性内含子特点，根据多变性内含子特异序列设计引物进行检测。已经对源于来自我国福建、 安徽、北京等不同地区的辣椒疫病菌和疫霉菌近缘种及其它卵菌的验证，结果具有很强的特 异性；
2、 实用性好本发明所设计出的一对特异性引物，可用于带辣椒疫病菌的植物组织和土 壤的高灵敏度快速分子检测，因此本方法的实用性强，可满足对带菌土壤和发病植物组织中 存在的辣椒疫病菌进行快速可靠的检测和鉴定的需要；
3、 操作简便快速应用本发明方法，对带辣椒疫病菌的土样和植物组织进行病菌DNA 提取、PCR扩增和常规的琼脂糖电泳后即可判定结果，无需对扩增产物进行限制性内切酶酶 切。 一般整个检测过程可在8小时内完成。
图1为本发明所要检测的辣椒疫病菌的特异PCR扩增图。
图中泳道l和泳道22为100bpladder分子量marker，泳道2-14为辣椒疫病菌，泳道15为 大豆疫病菌，泳道16为致病疫病菌，泳道17为掘氏疫病菌，泳道18为烟草疫病菌，泳道 19为恶疫霉菌，泳道20为黄瓜霜霉菌，泳道21为瓜果腐霉菌。
图2为本发明辣椒疫病菌的灵敏性检测扩增结果图。
图中泳道1和15为1 OObp ladder分子量marker，泳道2为1吗，泳道3为1 OOng，泳道4为1 Ong， 泳道5为lng,泳道6为100pg,泳道7为10pg，泳道8为lpg，泳道9为100fg，泳道10为10fg， 泳道ll为lfg，泳道12为100ag，泳道13为10ag，泳道14为阴性对照。
图3为本发明发病组织和带菌土壤的检测结果图。 图中泳道1为100bp ladder分子量marker,泳道2为阴性对照，泳道3， 4， 5， 6为 发病的辣椒植物组织，泳道7和泳道8为辣椒疫病发病田土壤。
具体实施例方式
本发明的技术内容包括辣椒疫病菌的特异检测引物，所设计的引物及其序列为
PCA1F: 5'國GTATAGCAGAGGTTTAGTGAA國3' PCA2R:: 5'- ACTGAAGTTCTGCGTGCGTT -3';
利用该引物可从辣椒疫病菌上特异扩增出364bp的产物。 以下结合实施例具体阐述本发明 实施例l:引物对辣椒疫病菌的特异性扩增
1. 辣椒疫病菌的特异检测
PCR反应体系25^d，包括2.5^1 10xPCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg2+， 50nmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCA1F和PCA2R各0.5pmol/L和10ng模板DNA， d.d.H20 补足25pl， PCR反应条件为95°C预变性2min; 94。C变性lmin， 60。C退火30sec， 72°C 延伸lmin共35个循环；72 'C延伸10 min。
2. 检测结果
检测的特异性除了来自我国福建、安徽、江苏等省份的辣椒疫病菌DNA可特异地扩 增出364 bp的产物外，检测了卵菌的其它13种疫霉种、霜霉菌、腐霉菌及其它的真菌和细 菌等菌株DNA均未能扩增出任何产物，具有很强的特异性。 实施例2:引物对辣椒疫病菌的灵敏性检测
1. DNA浓度稀释提取的辣椒疫病菌基因组DNA，经分光光度计测定浓度后，采用系 列浓度稀释。
2. 辣椒疫病菌的灵敏性检测
PCR反应体系25^1，包括2.5pl 10xPCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg2+， 50nmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCA1F/PCA2R各0.5pmol/L和lOng模板DNA， d.d.H20补足 25nl， PCR反应条件为95°C预变性2min; 94。C变性lmin， 60。C退火30 sec， 72。C延伸 lmin共35个循环；72 。C延伸10 min。
3. 检测结果在25pl反应体系中，lpg辣椒疫病菌基因组DNA可获得明显扩增条带， 检测灵敏度可达lpg。
实施例3:发病植物组织中辣椒疫病菌的检测。
1. 样品采集植物组织样品采自福建省福州市郊南通镇蔬菜基地
2. DNA提取及检测
发病植物组织采用CTAB法提取DNA，按上述试剂盒实施的方法进行PCR扩增，PCR反应体系25nl，包括2.5^110xPCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg2+， 50nmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCAIF和PCA2R各0.5pmol/L和lOng模板DNA， d.d.H20补足25jil， PCR反应条件为95°C预变性2min; 94。C变性lmin， 60。C退火30 sec， 72。C延伸lmin共 35个循环；72'C延伸10min。电泳检测扩增产物。 3.检测结果
结果见图3，见到一条清晰的分子量为364bp的特异条带，因而判断发病组织感染辣椒 疫病菌。
实施例4: 土壤样品中辣椒疫病菌的检测。
1. 样品采集土壤样品采自福建省龙海市浮宫镇辣椒蔬菜基地
2. DNA提取及检测
(1) 从发病土壤样品中提取DNA:
取过筛的土壤冷冻抽干24-48 h后加少量石英砂，倒入液氮充分研磨，将研磨后的土壤细 粉分装至1.5ml离心管中，每管加入500 nl重量浓度0.4%脱脂奶粉溶液，涡旋混匀，12000 卬m离心15min。取上清加入等体积蛋白酶K缓冲液，加终浓度为1(Vg/ml蛋白酶K， 55°C 水浴1-3 h，水浴结束后，加入1/2体积的7.5 M NH4AC溶液，上下颠倒混匀，12000 rpm离 心15min，吸上清液加2倍体积无水乙醇—2(TC沉淀(沉淀时间1.5h)。沉淀结束后，12000 rpm离心15 min。用体积浓度70%乙醇洗漆沉淀后倾去，室温晾干。每份样品所提DNA用 10plTE (或无菌超纯水)溶解，-2(TC保存备用。
(2) 辣椒疫病菌的PCR检测 按上述方法进行PCR扩增，PCR反应体系25nl，包括2.5^11 10xPCR反应缓冲液，2.0mmol/L
Mg2+， 50nmol/L dNTPs, 1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCA1F和PCA2R各0.5nmol/L和10ng 模板DNA， d.d,H20补足25nl， PCR反应条件为95°C预变性2min; 94'C变性lmin， 60°C 退火30sec， 72。C延伸lmin共35个循环；72。C延伸10min。电泳检测扩增产物。
3. 检测结果
结果见图3,见到一条清晰的分子量为364bp的特异条带，可以判断土壤样品侵染辣椒 疫病菌。核苷酸序列表
<110>福建省农业科学院植物保护研究所
<120>辣椒疫病菌分子检测引物及其应用
<160>2
<210> 1
<211>21
<212>DNA
<213>辣椒疫病菌(P一o卢/wra c印由')
<220>
<400> 1
5'- gtatagcagaggtttagtgaa -3，
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>辣椒疫病菌(P/ vtop/^wraca/w/d)
<220>
<400> 2
5'-actgaagttctgcgtgcgtt -3"
10
权利要求
1. 一种辣椒疫病菌分子检测引物，其特征在于所述辣椒疫病菌分子检测引物的序列为PCA1F5‘-GTATAGCAGAGGTTTAGTGAA-3’PCA2R5‘-ACTGAAGTTCTGCGTGCGTT-3’。
2. 根据权利要求1所述的辣椒疫病菌分子检测引物，其特征在于所述辣椒疫病菌分子检 测引物PCA1F和PCA2R对辣椒疫病菌特异性扩增出364bp的产物。
3. 根据权利要求2所述的辣椒疫病菌分子检测引物，其特征在于所述辣椒疫病菌分子检 测引物特异引物序列获得方法为以辣椒疫病菌和多个疫霉属近缘种以及常见的几种病 原真菌为供试材料，采用CTAB法提取供试菌株基因组DNA，具体方法如下取50mg冷 冻干燥后的菌丝粉于1.5ml离心管中，加入900pl重量浓度2%十六垸基三甲基溴化铵 CTAB提取液和90jil重量浓度10%十二垸基苯磺酸钠SDS后混匀，于55 6(TC水浴1.5 h, 每10 min振荡混匀一次，水浴1.5h后离心15min,离心速度为12,000rpm，取上清液加入等体积的酚、氯仿和异戊醇混合溶液，所述混合溶液中酚氯仿异戊醇的体积比为25:24:1,离心5min，离心速度为12，000rpm，取上清液，即水相，加入等体积氯仿抽 提一次，离心5min，离心速度为12,000rpm,吸上清液，力[]0.1体积的3mol/L NaAC溶 液和2体积的一20'C无水乙醇，一20。C下沉淀30min后12,000rpm离心5 min，轻轻地倒 去上清液，加入70(^1体积浓度70%的_20°0]乙醇进行洗涤，稍离心，倾掉上清，在超 净工作台上自然晾干无酒精味后用lxTE溶液进行溶解，得到DNA溶液，用紫外分光光 度计检测DNA浓度并稀释至50ng4U待用；在辣椒疫病菌特异DNA片段序列的基础上 应用ClustalX软件比对设计特异引物，获得辣椒疫病菌分子检测引物特异引物序列，经 对供试菌株和42株辣椒疫病菌的特异性进行PCR验证，所述特异引物在辣椒疫病菌上特 异性地扩增出364bp的产物。
4. 根据权利要求3所述的辣椒疫病菌分子检测引物，其特征在于所述CTAB提取液为重 量浓度2% CTAB; 100 m mol/LTris-HCl， PH 8.0; 20mmol/L EDTA，pH8.0: 1.4 mol/L NaCl。
5. 根据权利要求3所述的辣椒疫病菌分子检测引物，其特征在于所述lxTE溶液为 10腿ol/LTris-HCL， 0.1腿ol/LEDTA, pH8.0。
6. 根据权利要求3所述的辣椒疫病菌分子检测引物，其特征在于所述对供试菌株和42株 辣椒疫病菌的特异性进行PCR验证的具体的反应体系是PCR反应体系25^1，包括2.5^1 10xPCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg2+， 50pmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引物 PCA1F和PCA2R各0.5iimol/L和lOng模板DNA, d.d.H20补足25jJ， PCR反应条件为 95。C预变性2min; 94。C变性lmin， 60。C退火30sec , 72'C延伸lmin，共35个循环； 72。C延伸10min。
7. —种如权利要求1、 2、 3、 4、 5或6所述的辣椒疫病菌分子检测引物的应用，其特征在 于所述的辣椒疫病菌分子检测引物应用于辣椒疫病菌的快速分子检测诊断，按照以下 步骤检测G) 从被辣椒疫病菌、辣椒疫病菌感染的植物组织或存在辣椒疫病菌的土壤中提取 DNA;(2) 以该DNA为模板用所述的一对引物PCA1F和PCA2R通过聚合酶链式反应PCR扩 增；PCR反应体系25^1，所述PCR反应体系为2.5^ 10xPCR反应缓冲液，2.0mmol/L Mg2+， 50pmol/L dNTPs， 1.25U Taq DNA聚合酶，引物PCA1F和PCA2R各0.5pmol/L 禾卩10ng模板DNA,d.d.H2O补足25jxl; PCR反应条件为95。C预变性2min; 94°C 变性lmin， 6(TC退火30sec， 72。C延伸lmin共35个循环；72 。C延伸10min;(3) 然后取适量步骤(2)的PCR扩增产物用琼脂糖电泳分离，经溴化乙锭染色后于紫 外灯下观察，根据扩增产物的大小判定结果，如果能特异性地扩增出364 bp的产物， 即可判断所述的植物组织或土壤样品中存在辣椒疫病菌。
8. 根据权利要求7所述的辣椒疫病菌分子检测引物的应用，其特征在于当植株组织中存 在辣椒疫病菌时，采用CTAB法提取辣椒疫病菌的DNA。
9. 根据权利要求7所述的辣椒疫病菌分子检测引物的应用，其特征在于采用土壤DNA提 取法提取土壤中辣椒疫病菌的DNA:取过筛的土壤冷冻抽干24-48 h后加少量石英砂， 倒入液氮充分研磨，将研磨后的土壤细粉分装至1.5ml离心管中，每管加入500 ^1重量 浓度0.4%脱脂奶粉溶液，涡旋混匀，12000 rpm离心15 min，取上清加入等体积蛋白酶 K缓冲液，加终浓度为10 Mg/ml蛋白酶K， 55'C水浴l-3h，水浴结束后，加入1/2体积 的7.5 M NH4AC溶液，上下颠倒混匀，12000 rpm离心15 min，吸上清加2倍体积无水 乙醇一20'C沉淀，沉淀时间1.5h，沉淀结束后，12000 rpm离心15 min，用体积浓度70% 乙醇洗涤沉淀后倾去，室温晾干，每份样品所提DNA用10WTE或无菌超纯水溶解，-20 'C保存备用。
10. 根据权利要求7所述的辣椒疫病菌分子检测引物的应用，其特征在于所述步骤(3)为 取8 pi PCR产物用重量浓度1.5%琼脂糖电泳分离。
全文摘要
本发明提供一种辣椒疫病菌分子检测引物及其应用，该特异引物上游引物PCA1F5‘-GTATAGCAGAGGTTTAGTGAA-3’；下游引物PCA2R5‘-ACTGAAGTTCTGCGTGCGTT-3’；经过PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳，可在辣椒疫病菌纯DNA、带菌的发病组织及土壤上特异性地扩增出片段长度为364bp的特异扩增产物，对辣椒疫病菌快速检测；本发明的特异分子检测引物及其用法可被用于生产实践中辣椒疫病菌感染的植物组织和土壤中辣椒疫病菌的快速、灵敏、特异的检测，同时可用于田间病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定，为辣椒疫病菌引起的病害的防治提供可靠的技术和理论依据。
文档编号C12Q1/68GK101445825SQ20081007243
公开日2009年6月3日 申请日期2008年12月23日 优先权日2008年12月23日
发明者兰成忠, 李本金, 翁启勇, 健 赵, 陈庆河 申请人:福建省农业科学院植物保护研究所