专利名称：：利用分子标记技术区分凤尾菇与糙皮侧耳的方法
技术领域：
：本发明涉及一种利用分子标记技术鉴别食用菌的方法，确切地说是一种利用分子标记技术快速区分凤尾菇与糙皮侧耳的方法。
背景技术：
：凤尾燕(plcuroluspulmonarius(Fr，)Sing.)是热带和亚热带地区的一种食用菌。又称印度鲍鱼菇、环柄侧耳等。凤尾菇栽培粗放，生产周期短，出菇温度范围广。1974年印度首先开始人工栽培凤尾菇。1980年凤尾菇人工栽培技术引入我国，现分布各省栽培。在不少有关食用菌产量统计或栽培技术介绍的文章和书籍中，常见凤尾菇与糙皮侧耳归在一起。凤尾菇和糙皮侧耳在子实体的形态上难以区分，虽然两者在菌盖颜色深浅、厚度，担孢子大小有细微的差别，凤尾菇的生长速度比糙皮侧耳的快些，但仅凭这些特点仍然很难区分凤尾菇与糙皮侧耳；凤尾菇与糙皮侧耳的一个较显著的差别是两者在野外发生的季节不同，在欧洲和北美糙皮侧耳通常出现在深秋和冬季，而凤尾菇的子实体则出现在仲夏和早秋。所以在生产上仅靠子实体形态判别它们，就可能引起菌种的混淆。由于凤尾菇和糙皮侧耳在子实体的形态上难以区分，因此，探索快速鉴别凤尾菇真伪的方法，主要是探索快速有效地鉴别凤尾菇与糙皮侧耳的方法
发明内容本发明的目的是提供一种利用分子标记技术快速区分凤尾菇与糙皮侧耳的方法，以免在科研和生产上引起混乱，造成不必要的损失。本发明的利用分子标记技术区分凤尾菇与糙皮侧耳的方法，包括菌丝的培养与收集、基因组DNA的提取、ITS-PCR扩增、特异酶切片段标记的产生和酶切产物的电泳检测；其特征在于1、特异酶切片段标记的产生:在48plPCR扩增产物，加入lplHaeIII酶的酶切Buffer,0.31filHaeIII酶，2.2~2.8[ilddH20，37。C水浴410h;所述Haein酶的酶切Buffer成份为100mmoL/LTris-HCl,pH7.5，100mmoL/LMgCl2，10mmoL/LDithiothreitol和500mmoL/LNaCl;2、酶切产物的电泳检测取HaeIII酶的酶切产物lOuL，与2"L上样缓冲液混匀，点样于1.2%的琼脂糖凝胶上，于0.5XTBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳；经电泳检测，分子量为425435bp和175185bp的DNA标记条带，是凤尾燕菌株的标志；分子量为235245bp和175200bp的DNA标记条带，是糙皮侧耳菌株的标志。所述上样缓冲液0.1%溴酚蓝，40%蔗糖。本发明的利用分子标记技术区分凤尾菇与糙皮侧耳的方法，该方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，准确性高、容易判断、重复性好等优点。1、检测时间短该检测所需时间短，一般只需要23天，而常规的拮抗试验所需时间至少需要两周时间，出菇试验则需要至少2个月的时间，形态学检测需要综合分析菌丝体阶段与子实体阶段的微观与宏观的特征，所需时间与出菇试验相当。2、准确性高、重复性好本发明以基因组DNA为材料，DNA是稳定的遗传物质，是区分物种的本质表现所在，而DNA序列中的保守序列更是稳定，是物种长期进化的分子标记，不易受外界因素等的影响，因此以保守序列开发的鉴定技术准确性高，有很强的重复性；然而常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验容易受到环境条件、鉴定者的知识水平等因素影响，已经造成判断上的混乱。3、容易判断本发明的判断依据是在琼脂糖电泳上出现的DNA标记条带，DNA标记条带少、清晰，一目了然，不会出现像常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验上模棱两可的现象，而给判断造成误差。图1为HaeIII酶的酶切电泳图；1M为泳道编兮；右侧的数字表示DNA片段的分子量。图中，15泳道和78泳道所示的分子量为430bp和182bp的DNA标记条带，是凤尾菇菌株的标志；6和9泳道所示的分子量为243bp和190bp的DNA标记条带，是糙皮侧耳菌株的标志。具体实施方法为了充分公开本发明的利用分子标记技术区分凤尾燕与糙皮侧耳的方法，以下结合实施例加以说明。实施例一利用分子标记技术区分凤尾菇与糙皮侧耳的方法利用分子标记技术区分凤尾菇与糙皮侧耳的方法，具体包括以下步骤一、菌丝培养与收集(一)若测试菌株保藏时间小于6个月，则菌丝培养按如下方法进行1、用接种耙耙碎含凤尾菇菌丝的PDA培养基，转接入250ml三角瓶，含100mlPDA液体培养基中；2、放置在25。C摇床上，转速90130r/min培养710d;3、用纱布过滤培养好的菌丝，蒸馏水冲洗，滤纸吸干；4、称取0.51.3g菌丝,用滤纸包好，保存于-2(TC备用。(二)若测试菌株保藏时间大于6个月，则菌丝培养采用如下方法1、取凤尾菇菌种豆块大小转接到PDA斜面上，25"培养710天；2、用接种耙耙碎含菌丝的PDA培养基，转接入250ml三角瓶，含100mlPDA液体培养基中；3、放置在25。C摇床上，转速卯130r/min培养710d;4、用纱布过滤培养好的菌丝，蒸馏水冲洗，滤纸吸干；5、称取0.51.3g菌丝,用滤纸包好，保存于-2(TC备用。二、基因组DNA的提取，所述基因组DNA可以从菌株的菌丝体或子实体中提取。1、取保存备用的菌丝l包或0.51.3g的子实体，放入研钵，加入液氮迅速研磨成粉末，转入7ml的离心管；2、加2.5mL65。C预热的抽提液，同时加入50pl巯基乙醇，上下震荡，使蛋白质变性沉淀；3、65。C水浴lh，每隔10min振荡1次；4、加入2.5ml的氯仿异戊醇混匀，除去蛋白质；5、8000r/min，4。C离心10min，取上清到7ml管；6、加1/5体积65。C预热的CTAB/NaCl混匀，加入2.5ml的氯仿异戊醇混匀；7、10000r/min，4。C离心10min，取上清；8、加入2.5ml65。C预热的CTAB沉淀液，颠倒混匀，65。C水浴lh至沉淀可见或可过夜；9、12000r/min，4。C离心10min后，小心去除上清液；10、用0.5mlTE溶液或无菌水溶解沉淀10min;11、加入0.25ml饱和酚和0.25mL氯仿异戊醇，混匀；12、12000r/min，4。C离心10min，取上清，加入2倍体积预冷的无水乙醇，混匀；13、放置-2(TC冰箱lh或过夜；14、12000r/min，4。C离心10min，弃上清；15、可选做步骤加O.51mL70%乙醇洗涤，12000r/min，4°C离心8min，弃上清；重复一次16、自然风干沉淀，用30^TE溶液或无菌去离子水溶解沉淀，-2CTC保存备用。三、ITS-PCR扩增ITS-PCR扩增反应体系1fil含量1(K40ng的DNA，2.5pi10XPCRbuffer,2pl浓度为2.5mmol/L的dNTP，1)il浓度为10Umol/L的ITS1,1jil浓度为10mol/L的ITS4，0.3pl酶活为5U/ul的TaqDNAPolymerase,17.2jilddH20。ITS-PCR扩增反应程序94。C预变性5min;94。C变性45s，55。C退火45s，72。C延伸1min，35个循环;72。C延伸10min。四、特异酶切片段标记的产生6pi扩增产物，1[ilHaeIII酶的酶切Buffer,0.31plHaeHI酶，2.22.8ddH20，37。C水浴4h。五、酶切产物的电泳检测取HaeIII酶的酶切产物lO(il，与2pl上样缓冲液混匀，点样于1.2%的琼脂糖凝胶上，同时使用DL2000的DNAMARK作为片段大小的参照，于0.5XTBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳4560min，电泳结束后，用EB染色，然后在凝胶成像仪上照相。电泳图上显示15泳道和78泳道所示的分子量为430bp和182bp的DNA标记条带，是凤尾菇菌株的标志；6和9泳道所示的分子量为243bp和190bp的DNA标记条带，是糙皮侧耳菌株的标志。本发明的利用分子标记技术区分凤尾菇与糙皮侧耳的方法，选用的HaeIII酶，是应用DNAMAN软件库中的180种酶，对食用菌侧耳属基因组的保守序列进行软件酶切分析后，获得的可用于准确区分凤尾菇菌种和糙皮侧耳菌种的酶。本发明所使用的主要试剂如下(所有化学试剂均为分析纯)1、CTAB抽提液100mmol/LTris-HCl，2.0%CTAB，20咖ol/LEDTA，1.4mol/LNaCl，pH8.0;2、CTAB沉淀液50咖ol/LTris-HC1，1.0。/。CTAB，10咖ol/LEDTA，pH8.0;3、CTAB/NaCl:0.7mol/LNaCl，10%CTAB;4、TE缓冲液10画1/LTrisHC1，1聽1/LEDTA;5、0.5XTBE:44.5画1/LTris，50画1/LHB03、1咖ol/LEDTA;6、上样缓冲液0.1%溴酚蓝,40%蔗糖；7、EB:10mg/ml溴化乙锭;8、ITS1:5,-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3，；9、ITS4:5,-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3，；10、PCR扩增试剂及酶均购自大连宝生物公司。本发明所使用的主要仪器如下SW-CJ-1FB型单人水平垂直两用净化工作台苏州净化设备有限公司手提式灭菌锅上海三申HYG-A全温摇瓶柜太仓市实验室冷冻离心机Sigma3K30PCR扩增仪EppendorfAG22331Hamburg掌型离心机江苏海门市麒麟医用仪器厂Lx-100手掌型离心机凝胶成像系统TANON-2008表一9个凤尾菇菌株信息<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>实施例一的取样来自全国凤尾菇的主栽品种，共收集9个原生产使用的凤尾菇菌株，详见菌株信息见表一。利用分子标记技术对所述9个菌株进行区分检测，结果如下采用1对ITS引物对凤尾菇菌株进行PCR特异性扩增后加入HaeIII酶酶切，经电泳检测，如图1所示，15泳道和78泳道所示的分子量为430bp和182bp的DNA标记条带，是凤尾菇菌株的标志；对应表一所列的菌株中，序号15的菌株凤杰1号、凤尾菇、凤831、凤尾PF1、凤尾5号，为凤尾菇菌株；序号7和8的菌株高温凤尾菇、327，为凤尾菇菌株。然而，6和9泳道所示的分子量为243bp和190bp的DNA标记条带，是糙皮侧耳菌株的标志；其所对应的序号6和9的菌株巴西凤平和凤尾菇，实际为糙皮侧耳，并不是凤尾菇，只是在生产上被误当作凤尾菇使用，必须给予纠正。目前，利用本发明的方法已对285个收集自全国各地的糙皮侧耳生产用菌种及科研用菌种进行鉴定，检测出20个凤尾菇菌株，纠正了生产和科研用的糙皮侧耳菌株与凤尾菇菌株相互混淆现象。权利要求1、一种利用分子标记技术区分凤尾菇与糙皮侧耳的方法，包括菌丝的培养与收集、基因组DNA的提取、ITS-PCR扩增、特异酶切片段标记的产生和酶切产物的电泳检测；其特征在于(1)特异酶切片段标记的产生在4～8μlPCR扩增产物，加入1μlHaeIII酶的酶切Buffer，0.3～1μlHaeIII酶，2.2～2.8μlddH2O，37℃水浴4～10h；(2)酶切产物的电泳检测取HaeIII酶的酶切产物10μL，与2μL上样缓冲液混匀，点样于1.2％的琼脂糖凝胶上，于0.5XTBE缓冲液中，5V/cm电压下电泳；经电泳检测，分子量为425～435bp和175～185bp的DNA标记条带，是凤尾菇菌株的标志；分子量为235～245bp和175～200bp的DNA标记条带，是糙皮侧耳菌株的标志。2、根据权利要求1所述的一种利用分子标记技术区分凤尾菇与糙皮侧耳的方法，其特征在于(1)特异酶切片段标记的产生6pl扩增产物，1plHaein酶的酶切Buffer,0.7plHaeIII酶，2.6ddH20，37°C水浴4h;(2)酶切产物的电泳检测经电泳检测，分子量为430bp和182bp的DNA标记条带，是凤尾燕菌株的标志；分子量为243bp和190bp的2个条带，是糙皮侧耳菌株的标志。全文摘要利用分子标记技术区分风尾菇与糙皮侧耳的方法，包括菌丝的培养与收集、基因组DNA的提取、ITS-PCR扩增、特异酶切片段标记的产生和酶切产物的电泳检测。本发明的方法与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短，只需2-3天时间；以基因组DNA为材料，准确性高、重复性好；检测结果一目了然，容易判断等优点，有效纠正了生产和科研用的糙皮侧耳菌株与凤尾菇菌株相互混淆现象。文档编号C12Q1/04GK101392288SQ20081007213公开日2009年3月25日申请日期2008年11月18日优先权日2008年11月18日发明者刘新锐,吴小平,坚朱,谢宝贵,邓优锦申请人:福建农林大学