专利名称：利用分子标记技术鉴定猴头菇猴杰菌种的方法
利用分子标记技术鉴定猴头菇猴杰菌种的方法技术领域 本发明涉及一种微生物的鉴定方法，具体涉及利用分子 标记技术鉴定猴头菇猴杰菌种的方法，属生物技术领域。
背景技术：
猴头菇(f/er/"^m w/"""^)猴头菇是著名的八大山珍之 一，与燕窝、鱼翅、海参并列为四大名肴。传统中医认为猴头菇性平、 味甘，有助消化、利五脏、润六肺的功能和补虚损的功效，能提高人体免 疫能力，对慢性胃炎、十二指肠溃疡、胃溃疡等多种消化道疾病和神经衰 弱均有较好疗效。猴头菇营养丰富，是一种高蛋白、低脂肪，富含人体必 需的多种氨基酸、多肽、多糖和脂肪族的酰胺物质及多种维生素的优良保 健食品。我国食用菌资源丰富，品种比较多，近年来,由于菌种管理制度不健全, 致使猴头菇菌种混乱,出现同名异物、同物异名的现象。大量的混淆不清的 菌种名称不但使产业技术无从规范,也使我国近10年来几乎没有按食用菌 育种技术规范选育出的优良品种。而大量使用的多数是十几年前选育的未 经系统筛选和测试的组织分离物。这些非品种的菌种又常被冠以新名,而其 区别性、 一致性和稳定性无从知晓。这种混淆和混乱不仅给生产环节带来 诸多不便，也对食用菌的科学研究与学术交流造成障碍。猴头菇的人工栽培己逐渐形成较大规模,创造了较好的经济效益。优质 的猴头菇菌种是获得高单产和高质量的前提与基础，这就决定了猴头菇菌 种在猴头菇产业中的重要地位。因此为了保证每批次的用种都准确无误， 减少不必要的损失，需要开发简便、快速、准确的菌株鉴定技术。
发明内容
本发明的目的是提供一种利用分子标记技术鉴定猴头菇 猴杰菌种的快速检测方法。本发明的利用分子标记技术鉴定猴头菇猴杰菌种的方法，包括菌丝培 养与收集、基因组DNA的提取、SCAR-PCR分子标记的检测建立和SCAR-PCR 产物的检测；其特征在于1、 SCAR-PCR分子标记的检测，使用的检测引物是猴杰F/R，其中，猴 杰F是5'- CGCAACCAAAACAAAAACGACAATG -3'，，猴杰R是5'-CGTTCCACCCCTACGTTTAGCCTCA -3';2、 SCAR-PCR分子标记的检测建立SCAR-PCR扩增体系为10XPCR buffer 2. 5 jal， 25,ol/L MgCL2 1 (il， 2.5 m mol/L dNTP 2 |il， 5 U/ul Taq DNA Polymerase 0.3 jal， 10 u mol/L检测引物各1 ^d， lng 10ng/pl模板 DNA l(xl， ddH20 16.2 jil;SCAR-PCR反应条件为94°C lmin; 94°C 45second， 62°C 45second， 72°C lmin， 30个循环;72°C 5rain;3、 SCAR-PCR产物的检测结果在电泳检测的DNA图谱中显示，扩增 出的分子量为4〗4bp的特异DNA条带，为猴头菇猴杰菌种的标志。本发明提供的利用分子标记技术鉴定猴头菇菌种的方法，具有灵敏度 高，所需要的DNA用量少，与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比， 具有检测时间短、准确性高、容易判断、重复性好等优点。具体如下1、 检测时间短该检测方法所需时间只需要2—3天，而常规的拮抗 试验所需时间至少需要两周时间，常规形态学检测和出菇试验则需要至少 2个月的时间。2、 准确性高、容易判断，而且重复性好该检测方法以基因组DNA 为材料，DNA是稳定的遗传物质，不易受外界因素等的影响，同时它的 1012bp或371bp的显性标记判断一目了然，减少人为判断的偏差，大大提 高了准确性；常规的拮抗试验中，拮抗表现形式至少有3种，甚至更多， 有时表现形式不明显，还受培养环境的影响，拮抗表现不仅在种内的不同 品种之间会出现，同时在种间的菌株之间也会表现出来，给准确判断造成 困难；出菇试验更容易受到环境、时间等各方因素的影响，重复性差，加 大了检测困难；形态学检测在同一属种内的不同品种之间可区别的特征少， 有些甚至没有什么差异，同时还需要判断者具有丰富的知识与经验，方可 做出准确的判断。3、 此外该方法得到的显性标记可减少猴头菇新品种认定的工作量，检 测时该方法只需要1个阳性菌株和1个阴性菌株对照便可快速比较，而用 常规形态学、拮抗试验、出菇试验方法来认定一个新品种，需要将所有同 种内的不同品种一起搬出来比较，才能做出正确的认定，这就要很大的人 力和物力，当品种多时可能使得认定工作无法进行。本发明对猴头苋种质资源的利用和新品种的登记工作，提供了更为有 效的菌种鉴定体系，以及加强对我国猴头燕种质资源的保护工作都具有重 要意义。
图1为使用引物猴杰F/R检测猴头菇菌种扩增的DNA图 谱。其中M 17为泳道编号；左侧的数字表示DNA片段的分子量，箭头 所指是猴杰菌株特异性标记。
具体实施方式
为了充分公开本发明的利用分子标记技术鉴定猴头 菇猴杰菌种的方法，以下结合实施例加以说明。实施例1: 一种利用分子标记技术鉴定猴头燕猴杰菌种的方法 一种利用分子标记技术鉴定猴头菇猴杰菌种的方法，包括以下歩骤 一、菌丝培养与收集(一) 若供测试猴头燕菌株的保藏时间小于6个月，则菌丝培养按如下 方法进行1、 用接种耙耙碎含猴头菇菌丝的PDA培养基，转接入250ml三角瓶， 含100 ml PDA液体培养基中；2、 放置在25。C摇床上，转速90 130r/min培养7 10d;3、 用纱布过滤培养好的菌丝，蒸馏水冲洗，滤纸吸干；4、 称取0.5 1.3g菌丝,用滤纸包好，保存于-2(TC备用。(二) 若供测试猴头燕菌株保藏时间不小于6个月，则菌丝培养采用如 下方法1、 取猴头菇菌种豆块大小转接到PDA斜面上，25'C培养7 10天；2、 用接种耙耙碎含猴头菇菌丝的PDA培养基，转接入250ml三角瓶， 含100 ml PDA液体培养基中；3、 放置在25。C摇床上，转速90 130r/min培养7 10d;4、 用纱布过滤培养好的菌丝，蒸馏水冲洗，滤纸吸干；5、 称取0.5 1.3g菌丝，用滤纸包好，保存于-20。C备用。二、基因组DNA的提取，所述基因组DNA可以从菌株的菌丝体或子 实体中提取。1、取保存备用的猴头菇菌丝0.5 1.3g，或子实体0.5 1.3g，放入研钵，加入液氮迅速研磨成粉末，转入7ml的离心管；2、 加2.5mL65r预热的抽提液，同时加入50 jil巯基乙醇，上下震荡， 使蛋白质变性沉淀；3、 65'C水浴lh，每隔10min振荡l次；4、 加入2.5 ml的氯仿异戊醇混匀，除去蛋白质；5、 8000 r/min， 4。C离心10min，取上清到7ml离心管；6、 力Q 1/5体积65"预热的CTAB/NaCl混匀，加入2. 5 ml的氯仿异戊 醇混匀；7、 10000r/min， 4。C离心10min，取上清；8、 加入2.5ml 65。C预热的CTAB沉淀液，颠倒混匀，65。C水浴lh至沉淀可见或可过夜；9、 12000r/min, 4。C离心10min后，小心去除上清液；10、 用O. 5ml TE溶液或无菌水溶解沉淀10min;11、 加入0. 25ml饱和酚和0. 25m L氯仿异戊醇，混匀；12、 12000 r/min， 4。C离心10min，取上清，加入2倍体积预冷的无 水乙醇，混匀；13、 放置-20。C冰箱lh或过夜；14、 12000 r/min， 4。C离心10 min，弃上清；15、 自然风干沉淀，用30 ^ TE溶液或无菌去离子水溶解沉淀，-20°C 保存备用。三、SCAR-PCR分子标记的检测建立SCAR-PCR扩增体系10XPCR buffer 2. 5 pl， 25mmol/L MgCU 1 (il ， 2.5 m mol/L dNTP 2 jal， 5 U/ul Taq DNA Polymerase 0.3 [il， 10 u mol/L 专用检测引物猴杰F/R l|il， lng 10ng/Vl模板DNA l(il， ddH20 16. 2 (il。SCAR-PCR反应条件:94°C lmin; 94°C 45second， 62°C 45second， 72°C lmin， 30个循环；72°C 5min。所述专用检测引物猴杰F/R，是采用PCR技术，经过大量的筛选试验， 获得了猴头菇猴杰菌种的特异DNA片断，以此片段的DNA序列为基础，设 计猴杰菌种的特异检测引物。所述专用检测引物猴杰F/R具体内容为猴 杰F是5'- CGCAACCAAAACAAAAACGACAATG -3'，猴杰R是5'-CGTTCCACCCCTACGTTTAGCCTCA -3'。四、PCR扩增产物检测具体检测方法为，取PCR扩增产物8 ^tl加上1. 5 ^ 6X溴酚蓝上样 缓冲液，混匀，在1. 0%琼脂糖凝胶，含GoldView DNA染料进行电泳，5V/cm 恒压电泳50min，通过紫外凝胶成像系统观察并照像。或者，取PCR扩增 产物8 ^，与1.5 6X溴酚蓝上样缓冲液混匀，点样于1%的琼醋糖凝胶 上，于0. 5 X TBE缓冲液中，5V/cm恒压电泳0. 5 lh，电泳结束后，用 EB染色，然后在凝胶成像仪上照相。PCR扩增产物检测结果采用检测引物猴杰F/R对猴头菇菌株进行 SCAR—PCR扩增，只有猴杰菌株能扩增出分子量为414bp的DNA条带。本发明所使用的主要试剂如下(所有化学试剂均为分析纯)1、 CTAB抽提液100 mmol/L Tris-HCl， 2. 0% CTAB， 20 mmol/L EDTA， 1. 4 mol/L NaCl， pH 8. 0;2、 CTAB沉淀液50mmol/LTris-HCl， 1.0%CTAB， 10誦ol/L EDTA， pH 8. 0;3、 CTAB/NaCl: 0.7 mol/X NaCl，10% CTAB;4、 TE缓冲液10咖ol/L Tris HC1 ， 1咖ol/L EDTA;5、 0.5XTBE: 44.5廳1/L Tris， 50 ,1/L ■:,、 1腿ol/L EDTA;6、 上样缓冲液0.1%溴酚蓝,40%蔗糖；7、 EB: 10mg/ml溴化乙锭；8、 PCR扩增试剂购自大连宝生物公司。本发明所使用的主要仪器如下SW-CJ-1FB型单人水平垂直两用净化 工作台苏州净化设备有限公司； 手提式灭菌锅上海三申； HYG-A全温摇瓶柜太仓市实验室；冷冻离心机Sigma 3K30;PCR扩增仪Eppendorf AG22331 Hamburg;掌型离心机江苏海门市麒麟医用仪器厂Lx-100手掌型离心机； 凝胶成像系统TANON-2008。2525Untitledl. ST25 SEQUENCE LISTING<110〉祸建农林人学< 120〉利用分子标记技术鉴定猴头菇猴杰菌种的方法<130〉<160〉 2<170〉 Patentln version 3.1〈400〉 1cgc幼cc胆a. a.caaaaacga caatg<40()〉 2cgttccaccc ct.acgtttag cctca<210〉 <2]1〉 〈212> <213〉225DNA猴头竊范2 CA头s丽猴
权利要求
1、一种利用分子标记技术鉴定猴头菇猴杰菌种的方法，包括菌丝培养与收集、基因组DNA的提取、SCAR-PCR分子标记的检测建立和SCAR-PCR产物的检测；其特征在于(1)SCAR-PCR分子标记的检测，使用的检测引物是猴杰F/R，其中，猴杰F是5′-CGCAACCAAAACAAAAACGACAATG-3′’，猴杰R是5′-CGTTCCACCCCTACGTTTAGCCTCA-3′；(2)SCAR-PCR分子标记的检测建立，SCAR-PCR扩增体系为10×PCR buffer 2.5μl，25mmol/L MgCL2 1μl，2.5m mol/L dNTP 2μl，5U/ulTaq DNA Polymerase 0.3μl，10μmol/L检测引物各1μl，1ng～10ng/μl模板DNA 1μl，ddH2O 16.2μl；SCAR-PCR反应条件为94℃ 1min；94℃ 45second，62℃ 45second，72℃ 1min，30个循环；72℃ 5min；(3)SCAR-PCR产物的检测结果在电泳检测的DNA图谱中显示，扩增出的分子量为414bp的特异DNA条带，为猴头菇猴杰菌种的标志。
全文摘要
一种利用分子标记技术鉴定猴头菇猴杰菌种的方法，包括菌丝培养与收集、基因组DNA的提取、SCAR-PCR分子标记的检测建立和SCAR-PCR产物的检测。本发明提供的利用分子标记技术鉴定猴头菇菌种的方法，具有灵敏度高，所需要的DNA用量少，与常规形态学检测、拮抗试验、出菇试验相比，具有检测时间短、准确性高、容易判断、重复性好等优点。为猴头菇种质资源的利用和新品种的登记工作，提供了快速有效的菌种鉴定体系，对科研和生产具有重要的意义。
文档编号C12Q1/68GK101402994SQ20081007213
公开日2009年4月8日 申请日期2008年11月18日 优先权日2008年11月18日
发明者刘新锐, 坚 朱, 江玉姬, 谢宝贵, 邓优锦 申请人:福建农林大学