一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌的制作方法

专利名称：一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌的制作方法
专利说明一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌 所属技术领域 本发明涉及一种微生物菌株，特别是一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌菌株。
背景技术 胆汁酸(bile acid)是一类结构相似化合物的统称。根据来源上分类可分为初级胆汁酸和次级胆汁酸两大类。初级胆汁酸是由肝细胞以胆固醇为原料直接合成，包括胆酸和鹅脱氧胆酸。初级胆汁酸在肠道中受细菌作用生成的胆汁酸，称为次级胆汁酸(secondary bile acid)，包括脱氧胆酸和石胆酸。大部分进入肠内的初级和次级胆汁酸可以被小肠和大肠分别吸收。由于胆汁酸的主要代谢过程是由肝脏完成的，因此肝功能的异常会影响胆汁酸的代谢。现代临床研究表明，以末梢血管中血液胆汁酸的浓度变化作为衡量肝功能的一个指标是非常可靠的。早期胆汁酸的测定方法主要包括气相色谱法、高效液相色谱法和放射免疫法等。由于这些方法测定所需样品量大，测定时间长，使临床应用受到了限制。为此，近年来人们提出了以酶促反应测定胆汁酸的方法，拟解决以上测定方法中存在的问题。
睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroni)是一种革兰氏阴性菌，类固醇诱导下会诱导表达多种羟类固醇脱氢酶，其中之一为3α-羟类固醇脱氢酶(3α-hydroxysteroid dehydrogenase，简称3α-HSD)。睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD酶可作用于多种类固醇基质，可逆地催化C19-27的类固醇3位羟基/酮基的氧化还原反应。医学上，用3α-HSD酶进行血液中总胆汁酸(total bile acid，TBA)的测定。3α-HSD酶主要有两个来源，一是通过基因工程技术在大肠杆菌中表达重组3α-HSD酶，二是直接从睾丸酮丛毛单胞菌中提取天然3α-HSD酶。重组3α-HSD酶由于酶活性低下，因此将其应用于TBA临床测定还未见报道。因此，目前TBA测定中所用的工具酶3α-HSD均是从睾丸酮丛毛单胞菌中直接提取而来的。然而，自然条件下睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD酶的表达量低，在经多步层析和制备性凝胶电泳技术纯化后，酶得率低下，这使得直接从细菌中分离的天然3α-HSD酶价格昂贵，在一定程度上限制了TBA测定的临床推广。
因此，应用生物技术手段对细菌进行定向调控，提高睾丸酮丛毛单胞菌3α-HSD酶的表达量，势必可以解决3α-HSD酶得率低下的问题，对降低医疗成本，解决3α-HSD酶依赖进口的现状具有很强的现实意义。

发明内容
本发明的目的在于应用DNA重组技术对睾丸酮从毛单胞菌进行定向调控，构建高表达3α-HSD酶的睾丸酮丛毛单胞菌工程菌。
本发明的一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌(Comamonas testosteroniAMP8，简称工程菌AMP8)，已于2008年1月25日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.2365。保藏单位的地址北京市朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的菌体呈杆状，大小为0.8μm×1.5μm，革兰氏染色阴性，偏端丛生鞭毛，运动。
工程菌AMP8(CGMCC No.2365)是应用DNA重组技术将含tac强启动子的pK18载体整合到睾丸酮丛毛单胞菌(Comamonas testosteroniATCC11996，简称C.test)的teiR基因上游表达调控区，筛选获得的高效表达3α-HSD酶的菌株。
本发明的工程菌AMP8(CGMCC No.2365)，其特征在于 ①基因组DNA中具有tac启动子，其序列为序列表中SEQ ID NO1中所示的碱基序列； ②基因组DNA中具有pK18序列，该序列为序列表中SEQ ID NO2中所示的碱基序列。
③具有卡那霉素抗性。
所述的tac启动子指Amann et al.构建的启动子，pK18质粒指Pridmore构建的质粒载体，均由市场购得。
本发明的工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的构建方法如下 ①C.test teiR基因的克隆； ②含有tac强启动子的同源重组基因打靶载体pKtac2-teiR的构建； ③同源重组基因打靶载体电穿孔转化细菌C.test； ④工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的Southern blot筛选验证； ⑤不同培养条件下工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的3α-HSD酶表达； ⑥工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的3α-HSD酶表达稳定性检测。
本发明的工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的培养方法如下将工程菌AMP8(CGMCC No.2365)接种于添加了60μg/mL氨苄青霉素和30μg/mL卡那霉素的LB或M8培养基中，进行摇床振荡培养，转速为180r/min，培养温度30℃，培养8～12小时。
所述LB培养基为常用培养基，可在市场购得。
所述的M8无机盐培养基的配制方法如下取12.8g Na2HPO4.7H2O，3g KH2PO4，2.5g NaCl，5.0g NH4Cl，2mL 1M MgSO4，0.1mL 1M CaCl2，0.2g Yeast Extact，加蒸馏水至1L，用NaOH或HCl调节pH值至7.0，120℃条件下灭菌18分钟，冷却后4℃保存备用。
本发明的工程菌AMP8(CGMCC No.2365)在不同培养条件下均能提高3a-HSD酶的表达量。如表1所示，工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的3a-HSD酶表达量最高可达野生型菌株3a-HSD酶表达量的20倍，最低可达1.2倍，增加的幅度在1.2-20倍之间。本发明的工程菌AMP8(CGMCC No.2365)可作为天然3a-HSD酶发酵生产的菌种，可以解决3α-HSD酶得率低下的问题，对降低医疗成本，解决3α-HSD酶依赖进口的现状具有很强的现实意义。
表1 工程菌AMP8与野生型菌株不同培养条件下3a-HSD酶表达量检测



图1.pKtac2-teiR的Xba I和Kpn I酶切验证图谱。其中M为DNA marker，1为pKtac2-teiR双酶切电泳条带。
图2.AMP8(CGMCC No.2365)的southern blot检测。其中1为野生型睾丸酮丛毛单胞菌C.test，2为睾丸酮丛毛单胞菌工程菌AMP8(CGMCCNo.2365)，3为阳性对照pKtac2，4为ddH2O。
图3.AMP8(CGMCC No.2365)与野生型菌株C.test在不同培养条件下3α-HSD酶蛋白的表达量检测。其中横坐标1为LB培养基，2为含0.27mg/L睾丸酮的LB培养基，3为含0.2mg/L胆固醇的LB培养基，4为含5g/L醋酸盐的M8培养基，5为含0.27mg/L睾丸酮的M8培养基，6为含0.2mg/L胆固醇的M8培养基。纵坐标为3α-HSD酶蛋白在细菌总蛋白中的含量(单位μg·mg-1)。
图4.AMP8的稳定性检测。其中纵坐标为3α-HSD酶蛋白在细菌总蛋白中的含量(单位μg·mg-1)，横坐标数值为培养的天数。
具体实施例 为了充分公开本发明的一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌，以下结合实施例加以说明。
实施例一、一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌的构建方法 睾丸酮丛毛单胞菌工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的构建方法，包括以下步骤 1、C.test teiR基因的克隆 参照《精编分子生物学实验指南》的方法从过夜培养的C.test中提取菌体的总DNA，做为PCR扩增模板。以C.test的染色体DNA为模板，根据teiR基因序列设计引物(两端引物中分别添加了Xba I和Kpn I的酶切位点及保护碱基)，引物由上海生物工程有限公司合成。用大连TaKaRa公司的Ex Taq酶进行PCR扩增teiR基因。
Primer1(+)(正向引物)5’-GCTCTAGAATGTGCCCATATTTCGACACC-3’； Primer2(-)(反向引物)5’-TCGGGGTACCTCACTTGTTCCCCAGCCA-3’。
PCR产物进行1％琼脂糖电泳，用TaKaRa公司的PCR FragmentRecovery Kit回收目的片断。
2、含有tac强启动子的同源重组基因打靶载体pKtac2-teiR的构建 将质粒pBBtac12以Xba I和Sma I进行双酶切后，进行1％琼脂糖凝胶电泳回收tac启动子，然后与Xba I、Sma I酶切后的pK18在T4连接酶的作用下进行连接，获得pKtac2质粒。所述tac启动子，其序列为序列表中SEQ ID NO1中所示的碱基序列；所述pK18，其序列为序列表中SEQID NO2中所示的碱基序列。
将质粒pKtac2和teiR基因的PCR回收产物分别以Xba I和Kpn I酶进行双酶切后，T4连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌HB101感受态细胞(由市场购得)，转化的产物在含有卡那霉素的固体培养基上37℃培养过夜，挑选单克隆进行液体扩大繁殖。用碱裂解法提取重组质粒，Xba I和Kpn I进行双酶切验证。如图1所示，重组质粒酶切后有两条条带，说明同源重组基因打靶载体pKtac2-teiR构建正确。
3、同源重组基因打靶载体电穿孔转化细菌C.test 将培养的C.test细菌细胞沉淀下来，用10％冰冷的甘油制备感受态细胞，4℃保存备用。取10μL pKtac2-teiR质粒，加入190μL H2O，10μL 5M NaCl和450μL无水乙醇，13,000r/min离心10min；去除上清，加入450μL70％酒精，13,000r/min离心5min，去除上清液；加入450μL 70％酒精，13,000r/min离心5min，去除上清液；将Eppendorf管倒扣在滤纸上干燥。
取100μL感受态细胞加入到干燥的质粒pKtac2-teiR中，混合；将Eppendorf管放在冰上5min；然后将感受态细胞倒入电击杯中(1mm宽)；将电击杯放入冰上预冷5min；然后放入电融合仪的狭缝中，500V，5次；取出电击杯，加入1mL LB培养基，30℃，110r/min振荡培养1小时；将转化后的细菌涂布在含抗生素(Amp 60μg/mL，Kan 30μg/mL)的固体培养基上，在30℃的生化培养箱过夜培养。挑单菌落扩大培养。
4、工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的Southern blot筛选验证 以限制性内切酶EcoR I酶切质粒pK18作为探针，提取PCR检测阳性的细菌染色体DNA，用EcoR I进行酶切，酶切的产物进行1.0％的琼脂糖凝胶电泳，电压60V。以pKtac2的EcoR I酶切产物作为阳性对照，ddH2O作为阴性对照进行Southern blot检测(试剂盒为Roche公司产品)。如图2所示，阳性对照及工程菌AMP8(CGMCC No.2365)有阳性条带，其余没有条带，说明已经成功地将tac启动子整合到teiR基因上游。
5、不同培养条件下工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的3α-HSD酶表达 工程菌AMP8(CGMCC No.2365)分别接种于LB培养基、含0.27mg/L睾丸酮的LB培养基、含0.2mg/L胆固醇的LB培养基、含0.27mg/L睾丸酮的M8培养基、含0.2mg/L胆固醇的M8培养基、含5g/L醋酸盐的M8培养基中过夜培养，培养温度30℃，转速为180r/min。提取细菌过夜培养物的总蛋白，ELISA检测1mg/mL总蛋白中的3α-HSD酶蛋白的表达量。如图3所示，不同培养条件下的工程菌AMP8(CGMCC No.2365)3α-HSD酶蛋白的表达量均比相应条件下的野生型菌株C.test的表达量高。
细菌总蛋白的提取方法如下(1)取3mL过夜培养的细菌，13,000r/min，离心沉淀细菌，去掉上清液；(2)用PBS洗三遍，最后加入200μL的PBS溶液重悬沉淀；(3)加入1μL的溶菌酶(溶菌酶的浓度为5mg/mL)；(4)该溶液经过3次(每次30min以上)反复冻融；(5)经反复冻融的溶液在13,000r/min，20min，取上清夜进行蛋白定量。
6、工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的3α-HSD酶表达稳定性检测 工程菌AMP8(CGMCC No.2365)每天传代培养一次，连续传代培养50d，培养温度30℃，转速为180r/min。每隔5d，取3mL传代培养的工程菌，提取细菌的总蛋白ELISA检测1mg/mL总蛋白中的3α-HSD酶蛋白的表达量。如图4所示，工程菌AMP8(CGMCC No.2365)每毫克蛋白中3α-HSD酶蛋白的表达量均稳定在25μg左右，说明工程菌AMP8(CGMCC No.2365)是可以稳定遗传的，可作为3a-HSD酶发酵生产的菌种。
二、工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的3α-HSD酶的发酵培养 将-80℃保存的工程菌AMP8接种于LB固体培养基中，30℃培养48h。将菌落转接入种子培养基中，30℃、180r/min振荡培养12h。以0.1％的接种量接入发酵培养基(20mL装液量/100mL锥形瓶)，30℃、200r/min培养到对数期。发酵液离心收集菌体，菌体沉淀复溶于1M Tris-Cl中超声波裂解细菌，利用酶联免疫吸附实验(ELISA)测定3α-HSD酶蛋白的表达量。按照此发酵条件，经检测3α-HSD酶蛋白的产量可以达到25μg/mg，产量比野生型菌株提高了10倍。
LB培养基为常用培养基，可在市场购得。
种子培养基蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，12.8g/L Na2HPO4.7H2O，3g/L KH2PO4，pH 7.0。
发酵培养基蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，12.8g/L Na2HPO4.7H2O，3g/L KH2PO4，2.5g/L steroid。
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SEQUENCE LISTING
<110>福建农林大学
<120>一种睾丸酮从毛单胞菌工程菌
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>244
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>1
<210>2
<211>2661
<212>DNA
<213>大肠杆菌(Escherichia coli)
<400>权利要求
1、一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌，其特征在于该菌为睾丸酮丛毛单胞菌工程菌(Comamonas testosteroni AMP8)CGMCC No.2365。
2、根据权利要求1所述的一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌，其特征在于
①基因组DNA中具有tac启动子，其序列为序列表中SEQ ID NO1中所示的碱基序列；
②基因组DNA中具有pK18序列，该序列为序列表中SEQ ID NO2中所示的碱基序列。
3、根据权利要求1或2所述的一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌，其特征在于具有卡那霉素抗性。
4、一种睾丸酮丛毛单胞菌工程菌的构建方法，其特征在于构建步骤如下
①C.test teiR基因的克隆；
②含有tac强启动子的同源重组基因打靶载体pKtac2-teiR的构建；
③同源重组基因打靶载体电穿孔转化细菌C.test；
④工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的Southern blot筛选验证；
⑤不同培养条件下工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的3 α-HSD酶表达；
⑥工程菌AMP8(CGMCC No.2365)的3 α-HSD酶表达稳定性检测。
全文摘要
本发明通过DNA重组技术对睾丸酮丛毛单胞菌进行定向调控，从而获得高表达3α-HSD酶的睾丸酮丛毛单胞菌工程菌AMP8(CGMCCNo.2365)，本发明的工程菌AMP8(CGMCC No.2365)可作为天然3a-HSD酶发酵生产的菌种，在不同培养条件下均能提高3a-HSD酶的表达量，可以解决3α-HSD酶得率低下的问题，对降低医疗成本，解决3α-HSD酶依赖进口的现状具有很强的现实意义。
文档编号C12Q1/04GK101434929SQ200810072459
公开日2009年5月20日 申请日期2008年12月25日 优先权日2008年12月25日
发明者潘大仁, 陈建秋, 周以飞 申请人:福建农林大学