一种食酸菌及其应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种食酸菌，食酸菌（Acidovorax?sp.）SHS-01，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC?No.8388，保藏日期为2013年10月24日。本发明一种食酸菌具有较广的降解谱，能使畜禽粪便中四环素的残留量降低80％以上，从而促进堆肥的腐熟程度，成功的解决了含有畜禽粪便中由于含四环素而对微生物产生抑制作用而难以进行有效堆肥的问题，大大降低了生产和使用过程中的工作量，降低了生产和使用成本。本发明对于保护生态环境，保护人类的身体健康具有重要的意义。此外本发明一种食酸菌，食酸菌（Acidovorax?sp.）SHS-01，培养条件简单、生产使用成本低，容易保存，使用方便，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
【专利说明】一种食酸菌及其应用
【技术领域】
[0001]本发明属于环境及生物【技术领域】,尤其涉及一种食酸菌(Acidovorax sp.) SHS-Ol及其在四环素降解中的应用。
【背景技术】
[0002]抗生素具有杀死微生物、抑制微生物繁殖或生长，疾病等功效，因而大量的饲用抗生素被用作饲料添加剂预防和治疗细菌引起的，称之为抗菌生长促进剂。抗生素在畜禽机体内，仅有少部分经过羟基化、裂解和葡萄糖普酸化等代谢反应生成无活性产物，大部分仍以原形随粪尿排出体外，所以，畜禽粪便中普遍含有抗生素类物质。
[0003]四环素是目前畜禽养殖中使用最为普遍的抗生素之一，是一种广谱抗生素。相关研究显示，粪便中的四环素浓度最高可达到200mg/kg。在粪便施用之前对其进行处理以降低抗生素含量，将有效减小四环素可能带来的环境风险。将畜禽粪便进行堆肥处理，具有成本低、效率高、无二次污染、生态恢复性好等优点，所以筛选出四环素降解菌对于处含四环素畜禽粪的堆肥具有重大意义。
【发明内容】
[0004]发明目的:为了克服现有技术的不足，本发明的第一目的在于提供一种对四环素具有降解作用的食酸菌。
[0005]本发明的第二目的在于提供一种食酸菌在四环素降解中的应用。
[0006]技术方案:为 了解决上述第一目的，本发明所采用的技术方案为:一种食酸菌，其分类命名为食酸菌(Acidovorax sp.)SHS_01,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)，保藏单位地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码为100101，保藏编号为:CGMCC N0.8388，保藏日期为2013年10月24曰。
[0007]为了解决上述的第二目的，本发明所采用的技术方案为:所述食酸菌在四环素降解中的应用。
[0008]具体应用为:
[0009](I)将降解四环素残留的食酸菌SHS-Ol的试管种接种于LB培养基中，振荡培养至对数期；
[0010](2)将步骤(1)培养好的菌种按10%的接种量接种入500L的种子罐，无菌空气的通气量为1:0.6-1:1.2，搅拌速度为180-240r/min，培养温度为30-35°C，培养时间为60h，培养至对数生长期，得到种子液；
[0011](3)将步骤(2)所得到种子液按10%的接种量接入生产罐进行发酵培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，无菌空气的通气量为1:0.6-1:1.2，搅拌速度为180-240r/min，培养温度为30_35°C，培养时间为60h，发酵完成后的培养液即为应用于四环素降解中的菌剂。[0012]更进一步的，所述步骤(1)中LB培养基的配方为:1000mL蒸馏水，酵母粉5.0g，蛋白胨 10.0g,氯化钠 10.0g, pH7.0。
[0013]更进一步的，所述步骤(2)中种子罐所用培养基的配方为:葡萄糖0.8%，(NH4)2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏 0.02%, pH 值 7.2-7.5。
[0014]本发明中所述的食酸菌(Acidovorax sp.) SHS-Ol的生理活性特征如下:
[0015]所述食酸菌(Acidovorax sp.) SHS-01主要生物学特性为G-，对数生长期菌体为短杆状，该菌能液化明胶，水解葡萄糖、果糖、乳糖和麦芽糖，不能水解甘露醇、核糖、木糖和蔗糖。
[0016]有益效果:与现有技术相比，本发明的优点是:
[0017](I)本发明公开的一种食酸菌(Acidovorax sp.) SHS-01具有较广的降解谱,能使畜禽粪便中四环素的残留量降低80%以上，大大降低了生产和使用过程中的工作量，降低了生产和使用成本。所制备的菌剂具有生产使用成本低，使用方便，去除效果好的优点，适合在畜禽粪便堆肥过程中使用。本发明对于保护生态环境，保护人类的身体健康具有重要的意义。使用该菌剂可以是畜禽粪便中的四环素含量明显降低从而促进堆肥的腐熟程度。本发明成功的解决了含有畜禽粪便中由于含四环素而对微生物产生抑制作用而难以进行有效堆肥的问题。 [0018](2)食酸菌(Acidovorax sp.) SHS-01培养条件简单、生产使用成本低,容易保存，使用方便，易于工业化生产，具有良好的开发应用前景。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1为本发明菌株SHS-01菌体结晶紫染色照片(1000x)；
[0020]图2为本发明菌株SHS-01对四环素的摇瓶降解试验结果示意图；
[0021]图3为本发明使用菌株SHS-01进行堆肥试验对四环素降解情况示意图。
【具体实施方式】
[0022]下面结合实验例详细阐述本发明食酸菌(Acidovorax sp.) SHS-01的应用。
[0023]食酸菌(Acidovorax sp.) SHS-01的筛选、分离和鉴定:
[0024](I)取从生产四环素的某农药厂生产车间的废水处理池中得到的活性污泥3.0mL加入四环素浓度为100mg/L的IOOmL无机盐液体培养中，其配方为:1000mL蒸懼水、1.50gΚ2ΗΡ04、0.50g ΚΗ2Ρ04、0.20g MgSO4.7Η20、1.00g NaClU.00g (NH4) 2S04，ρΗ7.0，于 160r/min，30°C条件下振荡培养，每隔5天按3%的接种量转接到新鲜的无机盐培养基中，连续转接5次；
[0025](2)取上面得到的富集菌液1.0mL，加入9.0mL无菌水中，配成KT1的富集液，再吸取1.0mL配好的KT1的富集液加入9.0mL无菌水中，充分混匀配成10_2的富集液，以此类推，对富集液进行梯度稀释。吸取各梯度的稀释液0.1mL涂布于含四环素的浓度为IOOmg/L无机盐固体培养基(培养基配方为:1000mL蒸馏水、1.50g Κ2ΗΡ04、0.50gKH2P04、0.20gMgSO4.7Η20、1.0Og NaClU.0Og (NH4) 2S04, 20.0Og 琼脂，ρΗ7.0)上，30°C培养 7 天；
[0026](3) 7天后从上述无机盐固体培养基上挑取单菌落，于3.0mL的LB液体培养基中培养24小时后，LB液体培养基配方为:1000mL蒸馏水、NaCl 10.00g、蛋白胨10.00g、酵母粉5.0Og、pH7.0于8000r/min的条件下离心2min,倒去上清液,加入3.0mL的无菌水摇匀,仍于8000r/min的条件下离心2min,按此方法用无菌水洗两遍后,加入3.0mL无菌水重悬该菌。吸取1.0mL该菌液加入IOOmL四环素浓度为100mg/l的无机盐液体培养基中，于160r/min，30°C条件下振荡培养7天后，用高效液相色谱测其降解效果。将降解效率较高的一株囷株保存，进行后续实验；
[0027](4)将降解菌株接种于LB固体培养基上，其配方为:1000mL蒸馏水，酵母粉5.0g,蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g, PH7.0 ;30°C恒温培养48h后观察菌落形态，用光学显微镜观察菌体形态(1000X)。菌株的生理生化鉴定按照《常见细菌系统鉴定手册》进行。鉴定为SHS-Ol属(Acidovorax sp.);命名为:SHS_01。其结晶紫染色照片如图1所示，主要生物学特性为G-，对数生长期菌体为短杆状，该菌能液化明胶，水解葡萄糖、果糖、乳糖和麦芽糖，不能水解甘露醇、核糖、木糖和蔗糖。
[0028]将食酸菌(Acidovorax sp.) SHS-01进行摇瓶试验，检验其对四环素的降解效果:
[0029]在含100mg/L四环素的无机盐培养基中，其配方为:1000mL蒸馏水、1.50g K2HPO4,0.50g ΚΗ2Ρ04、0.20g MgSO4.7Η20、1.0Og NaClU.0Og(NH4)2SO4, ρΗ7.0，按 3% 的接种量接种SHS-01，于30°C振荡培养，48小时取样测定。与空白相比，如图2所示，处理样品的吸收峰明显下降，四环素被降解90%以上。
[0030]食酸菌(Acidovorax sp.) SHS-01在四环素降解中的应用:
[0031]实施例1:
[0032](I)将食酸菌SHS-01的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200ml LB培养基的1000ml摇瓶中，恒温振荡培养至对数期；其中LB培养基的配方为:1000mL蒸馏水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g, pH7.0 ；
[0033](2)准备接种种子罐，种子罐500升，投料量400升，其中培养基配方为:葡萄糖
0.8%, (NH4) 2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏 0.02%, pH 值7.2。投料完毕后121°C高压湿热灭菌，冷却至30°C后，培养60h，将上述培养好的摇瓶菌种按10%的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为180r/min，无菌空气通入量为1:0.6 ;
[0034](3)将到达对数期的种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1 kg/cm2的压力下，121°C高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35°C以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制 在30°C，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.6，搅拌速度为180r/min，培养60h。发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上，即为应用于四环素降解中的菌剂。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
[0035]实施例2:
[0036](I)将食酸菌SHS-01的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200ml LB培养基的1000ml摇瓶中，恒温振荡培养至对数期；其中LB培养基的配方为:1000mL蒸馏水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g, pH7.0 ；
[0037](2)准备接种种子罐，种子罐500升，投料量400升，其中培养基配方为:葡萄糖
0.8%, (NH4) 2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏 0.02%, pH 值7.5。投料完毕后121°C高压湿热灭菌，冷却至35°C后，培养60h，将上述培养好的摇瓶菌种按10 %的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为240r/min，无菌空气通入量为1:1.2 ;
[0038] (3)将到达对数期的种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1 kg/cm2的压力下，121°C高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35°C以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在35°C，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:1.2，搅拌速度为240r/min，培养60h。发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上，即为应用于四环素降解中的菌剂。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
[0039]实施例3:
[0040]( 1)将食酸菌SHS-Ol的原种在培养皿上活化，并测定降解性能，接种于试管斜面上备用。试管种接种于含200ml LB培养基的1000ml摇瓶中，恒温振荡培养至对数期；其中LB培养基的配方为:1000mL蒸馏水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g, pH7.0 ；
[0041](2)准备接种种子罐，种子罐500升，投料量400升，其中培养基配方为:葡萄糖
0.8%, (NH4) 2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏 0.02%, pH 值
7.4。投料完毕后121°C高压湿热灭菌，冷却至33°C后，培养60h，将上述培养好的摇瓶菌种按10 %的接种量接种入500升种子罐，培养至对数生长期，搅拌速度为220r/min，无菌空气通入量为1:0.9 ;
[0042](3)将到达对数期的种子液按10%的接种量接入生产罐培养，生产罐所用培养基成分与种子罐培养基相同。生产罐容量5吨，投料量4.5吨。投料后的生产罐1.1 kg/cm2的压力下，121°C高压湿热灭菌，灭菌后冷却至35°C以下，通无菌空气保持无菌状态备用。接种后的生产罐温度控制在33°C，生产罐的培养过程中无菌空气的通气量为1:0.9，搅拌速度为220r/min，培养60h。发酵结束后菌体数量达到10亿个/mL以上，即为应用于四环素降解中的菌剂。发酵完成后培养液出罐直接用塑料包装桶或包装瓶分装成液体剂型或采用泥炭吸附用包装袋分装成固体菌剂剂型。
[0043]食酸菌(Acidovorax sp.) SHS-01在堆肥试验中对四环素降解的应用:
[0044]堆肥采用新鲜奶牛粪便，选取原料配比为牛粪:稻草段:稻草粉末:自来水为
17.6:0.36:0.23:0.45，此原料中的C/N为25:1，含水率控制在75%，四环素含量为50mg/kg。将上述实施例1-3制备的菌剂和经过灭菌处理(121°C，30min)上述实施例1_3制备的菌剂的以0.5% (质量比)的接种量接种至堆体中，混合均匀后开始堆置。经过50天堆肥过程后，分别测定肥堆中四环素含量，如图3所示，未经灭菌处理的菌剂50d后对四环素的降解率达80%以上，而经灭菌处理后的菌剂50d后对四环素的降解率仅30%左右，结果表明，本发明一种食酸菌(Acidovorax sp.)SHS_01可直接用于畜禽粪便堆肥中对四环素降解，成功的解决了含有畜禽粪便中由于含四环素而对微生物产生抑制作用而难以进行有效堆肥的问题。
【权利要求】
1.一种食酸菌，其分类命名为食酸菌(Acidovorax sp.) SHS-OI,保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为=CGMCC N0.8388，保藏日期为2013年10月24曰。
2.权利要求1所述的食酸菌在四环素降解中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，采用以下生产流程得到应用于四环素降解中的食酸菌: (1)将降解四环素残留的食酸菌SHS-Ol的试管种接种于LB培养基中，振荡培养至对数期； (2)将步骤(1)培养好的菌种按10%的接种量接种入500L的种子罐，无菌空气的通气量为1:0.6-1:1.2，搅拌速度为18 0-240r/min，培养温度为30_35°C，培养时间60h，培养至对数生长期，得到种子液； (3)将步骤(2)所得到种子液按10%的接种量接入生产罐进行发酵培养，生产罐所用培养基与种子罐培养基相同，无菌空气的通气量为1:0.6-1:1.2，搅拌速度为180-240r/min，培养温度为30-35°C，培养时间60h，发酵完成后的培养液即为应用于四环素降解中的菌剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述步骤(1)中LB培养基的配方为:1000mL蒸馏水，酵母粉5.0g，蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g, pH7.0。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于:所述步骤(2)中种子罐所用培养基的配方为:葡萄糖 0.8%, (NH4) 2S041%, K2HPO40.2%, MgSO40.05%, NaCl0.01%, CaCO30.3%,酵母膏0.02%, pH 值 7.2-7.5。
【文档编号】C12R1/01GK103923852SQ201410083651
【公开日】2014年7月16日 申请日期:2014年3月7日 优先权日:2014年3月7日
【发明者】马爱军, 何任红, 张小华 申请人:江苏农林职业技术学院