专利名称：一种快速鉴定辣椒抗疫病相关基因功能的方法
技术领域：
本发明属于植物育种领域，具体涉及一种利用病毒诱导的基因沉默技术鉴定辣椒抗疫病相关基因功能的方法，该方法具有操作简单、无需进行植物遗传转化、周期短，且可以在不同遗传背景下进行鉴定等优点，是一种快速、有效鉴定植物基因功能的方法。
背景技术：
辣椒(Capsicumannuum L.)属于爺科(Solanaceae)辣椒属(Capsicum),—年生草本植物，原产于中南美洲热带亚热带地区，现在世界各地普遍栽培，也是我国种植面积最大的蔬菜作物之一。辣椒疫病是由疫霉菌(Phytophthora capsici L.)引起的一种毁灭性土传病害，世界上许多国家均有发生。辣椒疫病是我国辣椒产业的重要病害，且有逐年加重的趋势，从而造成严重的经济损失。目前生产上主要以化学防治的方法来控制辣椒疫病的发生，不仅防治效果差，而且污染产品和环境，造成辣椒产品残毒超标，严重制约着我国辣椒产业在国际市场上的竞争力。选育抗病品种是控制辣椒疫病最为经济和有效的方法。随着分子生物学技术的快速发展，很多与辣椒疫病抗性相关的基因被克隆出来(Park, C. -J. , Shin, R. , Park, J. Μ. , Lee, G. -J. , Yoo, T. H. and Paek, K. -H. A hot peppercDNA encoding a pathogenesis-related protein 4is induced during the resistanceresponse to Tobacco mosaic virus [J] · Mol. Cells, (2001a) 11，122-127),并利用传统的遗传转化方法对其功能进行分析。然而，这种常规遗传转化技术存在着许多的局限性，其主要表现在于操作程序复杂、周期长、转化条件要求苛刻、转化效率低且受辣椒品种影响，甚至对某些生物体具有致死效应，严重地制约着分子育种的进程。因此，需要寻找一种快速高效的基因功能鉴定方法。病毒诱导的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)是从研究病毒和寄主之间的相互作用发展而来。在这个系统中，带有目的基因片段的病毒载体被传递到植物细胞，植物细胞识别入侵病毒的威胁并且利用保护性防卫机制来摧毁病毒和病毒载体上所携带的任何外源基因，从而影响植物本身目的基因的转录过程，导致目的基因mRNA发生特异性降解。即指携带与植物内源功能基因同源序列的病毒在侵染植物之后，能够使植物发生基因沉默从而出现表型突变，可以通过植物表型或生理指标上的变化来反映该基因的功倉泛。病毒诱导的基因沉默是近年来发展起来的一种快速鉴定植物基因功能的方法，它能最大限度地克服传统方法的局限性，具有操作简单、周期短、沉默效率高，且可以在不同遗传背景下生效等优点。因此，适用于大规模的基因功能筛选。以下是发明人给出的相关参考文献I、刘珂珂，辣椒对疫病的抗性及其机理研究[D].西北农林科技大学博士学位论文(导师巩振辉)，2009。2、罗德旭，巩振辉，李大伟.辣椒疫病抗病性分子鉴定技术研究[J].西北农业学报，2008，17 (5) 76-80o3、 Rugang Chen, Hanxia Li， Liying Zhang, Junhong Zhang, Jinghua Xiao andZhibiao Ye. CaMi, a root-knot nematode resistance gene from hot pepper (Capsiumannuum L.) confers nematode resistance in tomato[J]. Plant cell reports，2007，26(7) :895-905。4、Park, C. -J.，Shin, R.，Park, J. M.，Lee，G. -J.，Yooj T. H. and Paekj K. _H. A hotpepper cDNA encoding a pathogenesis-related protein 4is induced during theresistance response to Tobacco mosaic virus[J]· Mol. Cells，2001，11 :122127。5、AndreC. Velasquez, Suma Chakravarthyj Gregory B. Martin. Virus-inducedGene Silencing (VIGS) in Nicotiana benthamiana and Tomato[J]. Journal ofVisualized Experiments, 2009, (28) :el292，DOI:10. 3791/1292。
发明内容
针对上述现有技术中关于辣椒基因功能鉴定中存在的问题，本发明的目的在于，提出一种快速鉴定辣椒抗疫病相关基因功能的方法。该方法具有操作简单、无需遗传转化、周期短且可以适宜不同品种遗传背景等优点，是一种快速、有效鉴定辣椒基因功能的方法。为了实现上述任务，本发明釆用如下的技术解决方案一种快速鉴定辣椒抗疫病相关基因的方法，其特征在于，该方法利用病毒诱导的基因沉默技术与辣椒离体叶片抗病性相结合的方法，进行辣椒疫病抗性相关基因的功能分析，具体步骤如下I)辣椒材料的准备供试材料为辣椒高抗疫病品种CM334，选择籽粒饱满的辣椒种子，55°C温汤浸种20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工气候箱中进行催芽；经4d种子露白，播于穴盘中。然后转到25V /18°C、16h/8h昼夜温光周期条件下进行培养，期间浇Hoagland’ s营养液；待苗子两片真叶展平时，可用于病毒诱导的基因沉默注射；2)辣椒疫霉菌孢子悬浮液的准备选择辣椒疫霉菌生理小种phi作为接种病原菌，供试辣椒材料CM334对辣椒疫霉菌生理小种Phl表现为抗性的方法(刘珂珂，辣椒对疫病的抗性及其机理研究[D].西北农林科技大学博士学位论文，2009)。病原菌的准备具体参考(罗德旭，巩振辉，李大伟.辣椒疫病抗病性分子鉴定技术研究[J].西北农业学报，2008，17 (5) :76-80)的方法。3)重组病毒载体的构建(I)辣椒叶片总RNA的提取与cDNA第一链合成采用Trizol 法提取辣椒叶片总 RNA (Rugang Chen, Hanxia Li, Liying Zhang,Junhong Zhang，Jinghua Xiao and Zhibiao Ye. CaMi,a root-knot nematode resistancegene from hot pepper (Capsium annuum L.) confers nematode resistance intomato [J]. Plant cell reports，2007，26 (7):895_905)，按 Promega 公司的反转录试剂盒操作说明进行cDNA第一链合成。(2)目的基因片段的克隆用于病毒沉默载体构建的基因片段大小一般要求在150_500bp之间，本申请中所涉及的基因引物设计均遵循本原则。根据NCBI公布的或已克隆的辣椒疫病抗性相关基因序列，设计合适的引物序列，以步骤(I)合成的cDNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，DNA回收试剂盒(TaKaRa公司)回收目的基因。利用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)将回收产物连接到克隆载体PMD19-T上，16°C过夜。转化到大肠杆菌DH5a中，菌落PCR检测初步确定连接成功后，送上海生物工程公司进行测序。确认克隆基因片段序列与目的基因序列一致时，即可用于构建基因沉默表达载体。(3)重组载体构建选择病毒载体为烟草脆裂病毒的载体pTRVl和pTRV2。选择合适的酶切位点对病毒载体pTRV2和步骤(2)经过测序验证含有目的基因序列的克隆载体进行双酶切，37°C过夜，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，凝胶成像系统拍照并切胶，用DNA回收试剂盒(TaKaRa公司)回收。利用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)将回收到的目的基因片段连接到病毒载体片段上，16°C过夜。转化DH5a，用菌落PCR和双酶切方法检测出目的基因片 段，证明目的基因已经成功转入病毒载体中。(4)转化农杆菌利用冻融法将携带pTRVl载体、pTRV2空载体和步骤(3)构建好的病毒载体分别导入农杆菌菌株GV3101中，经PCR检测确定为目的基因，保存菌液以备用。4)农杆菌菌液注射( I)农杆菌菌液准备将携带pTRVl载体、pTRV2空载体和步骤3)构建好的病毒载体的农杆菌菌液按已知的方法进行活化，具体参考(Andr6C. Velasquez, Suma Chakravarthy, GregoryB. Martin.Virus-induced Gene Si lencing(VIGS) in Nicotiana benthamiana andTomato[J]. Journal of Visualized Experiments, 2009, (28) el292, DOI:10. 3791/1292)的方法。(2)注射接种先用针头分别在辣椒两片真叶叶脉附近打个小孔，然后用去掉针头的I. OmL注射器在叶片正面注射菌液，若能看到整个叶面出现水溃状，证明菌液已被注射进植株体内。将注射接种后的辣椒植株放入人工气候箱，18°C、暗培养2d后，转入22°C /18°C、16h/8h、60%湿度条件下进行培养，观察并记录辣椒的表型变化，期间以Hoagland’s营养液进行浇灌。5)基因沉默效果检测(I)沉默表型观察辣椒叶片农杆菌注射接种约25d左右就会出现不同程度的病毒症状，证明病毒载体已经成功进入植株体内。(2)辣椒尚体叶片接种鉴定待检测基因功能选带有病毒症状的辣椒离体叶片接种辣椒疫霉菌phi。离体叶片接种浓度为I. OX IO4个，每个叶片10 μ L0接种辣椒疫霉菌孢子悬浮液后，于28°C，相对湿度95%，50001x人工气候箱进行培养，5d后观察表型症状的变化。观察方法是，在叶片接种部位出现明显病斑的，说明被检测基因与辣椒抗疫病相关；相反，在叶片接种部位没有出现明显病斑的，则说明被检测基因与辣椒抗疫病无关，或是无功能基因。本发明创制的鉴定辣椒基因功能的方法操作简单、周期短、无需基因全长序列、无需转基因植株、表型获取快等诸多优点，可用于快速、高效、高通量地分析基因功能研究。
图I为辣椒CaPOD基因沉默的表型观察图片。其中，左图为pTRV_00 (空载体，不含目的基因)，右图为pTRV-CaP0D (重组载体，携带目的基 因)。图2为辣椒CaPOD基因沉默离体叶片接种辣椒疫霉菌的表型观察图片。其中，图左边为pTRV-00 (空载体，不含目的基因)，图右边为PTRV-CaP0D (重组载体，携带目的基因)。图3为辣椒CaRGAl基因沉默的表型观察图片。其中，左图为pTRV_00 ；(空载体，不含目的基因)，右图为=PTRV-CaRGAl (重组载体，携带目的基因)。图4为辣椒CaRGAl基因沉默离体叶片接种辣椒疫霉菌的表型观察图片。其中，图左边为pTRV-00 ；(空载体，不含目的基因)，图右边为pTRV-CaRGAl (重组载体，携带目的基因)。以下结合附图和发明人给出的应用实施例对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式按照本发明的技术方案，发明人给出以下具体的应用实施例，需要说明的是，以下实施例仅是说明性的，本发明的应用并不限于这些实施例。应用实施例I :本实施例利用病毒诱导的基因沉默技术与辣椒离体叶片抗病性相结合的方法，进行辣椒疫病抗性相关基因的功能分析，具体如下I、辣椒材料的准备供试材料为辣椒高抗疫病品种CM334。选择籽粒饱满的辣椒种子，55°C温汤浸种20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工气候箱中进行催芽。经4d种子露白，播于穴盘中。然后转到25°C /18°C、16h/8h昼夜温光周期条件下进行培养，期间浇Hoagland’s营养液。待苗子两片真叶展平时，可用于病毒诱导的基因沉默注射。2.辣椒疫霉菌孢子悬浮液的准备选择辣椒疫霉菌生理小种Phl作为接种病原菌，供试辣椒材料CM334对其表现为抗性(刘珂珂，辣椒对疫病的抗性及其机理研究[D].西北农林科技大学博士学位论文，2009)。病原菌的准备具体参考(罗德旭，巩振辉，李大伟，辣椒疫病抗病性分子鉴定技术研究[J].西北农业学报，2008，17 (5) 76-80)的方法。3、重组病毒载体的构建(I)辣椒叶片总RNA的提取与cDNA第一链合成采用Trizol法提取辣椒叶片总RNA (Rugang Chen, Hanxia Li, Liying Zhang, Junhong Zhang, Jinghua Xiao and ZhibiaoYe. CaMij a root-knot nematode resistance gene from hot pepper (Capsium annuumL) confers nematode resistance in tomato[J]. Plant cell reports，2007，26 (7):895-905)，按Promega公司的反转录试剂盒操作说明进行cDNA第一链合成。(2)目的基因片段的克隆用于病毒沉默载体构建的基因片段大小一般要求在150-500bp之间，本申请中所涉及的基因引物设计均遵循本原则。根据申请人课题组克隆的辣椒过氧化物酶(CaPOD)基因序列(NCBI GenBank登录号FJ596178)(刘珂珂，辣椒对疫病的抗性及其机理研究[D]. 2009)，设计合成一对带有Xba I和Bam HI双酶切位点的引物序列(正向引物5’ -GGGTCTAGAGTGCTCAACACACACTTTATTCTTCTC-3> ;反向引物5’ -GGG GGATCCCCAAGAATGACAACAGAGTCCCTA-3J )，片段大小为480bp。以步骤(I)合成的cDNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，DNA回收试剂盒(TaKaRa公司)回收目的基因。利用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)将回收产物连接到克隆载体pMD19_T上，16°C过夜。转化到大肠杆菌DH5a中，菌落PCR检测初步确定连接成功后，送上海生物工程公司进行测序。经分析得出扩增的基因片段序列与设计目的基因序列一致，即可用于基因沉默载体的构建。(3)重组载体构建用于本实施例的病毒载体为烟草脆裂病毒的载体pTRVl和PTRV2。选用Xba I和Bam HI内切酶对病毒载体pTRV2和经步骤(2)验证过的克隆载体T-CaPOD进行双酶切，37°C过夜，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，凝胶成像系统拍照并切胶，用DNA回收试剂盒(TaKaRa公司)回收。利用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)将回收到的目的基因片段连接到病毒载体片段上，16°C过夜。转化DH5a，用菌落PCR和双酶切方法检测出480bp大小的目的基因片段，证明重组病毒载体pTRV-CaPOD已经构建成功，可用于下一步农杆菌侵染。 (4)转化农杆菌利用冻融法将携带pTRVl载体、pTRV2空载体和步骤(3)构建好的病毒载体pTRV-CaPOD分别导入农杆菌菌株GV3101中，PCR检测确定扩增出480bp的目的条带，保存菌液以备用。4、农杆菌菌液注射(I)农杆菌菌液准备将携带pTRVl载体、pTRV2空载体和步骤3构建好的病毒载体pTRV-CaPOD的农杆菌菌液按已知的方法进行活化，具体参考(Andr6C. Velasquez, SumaChakravarthy, Gregory B. Martin. Virus-induced Gene Silencing(VIGS) in Nicotianabenthamiana and Tomato [J]. Journal of Visualized Experiments,2009, (28) e1292，DOI: 10. 3791/1292)方法。(2)注射接种先用针头分别在辣椒两片真叶叶脉附近打个小孔，然后用去掉针头的I. OmL注射器在叶片正面注射菌液，若能看到整个叶面出现水溃状，证明菌液已被注射进植株体内。将注射接种后的辣椒植株放入人工气候箱，18 °C、暗培养2d后，转入22 °C /18 °C、16h/8h、60%湿度条件下进行培养，观察并记录辣椒的表型变化，期间以Hoagland’s营养液进行烧灌。5.基因沉默效果检测(I)沉默表型观察农杆菌注射接种大约25d后，辣椒叶片出现明显的病毒症状表现(见图I):部分叶脉褪绿，周围出现黄绿色病毒斑点，有些叶片边缘甚至卷曲，说明重组病毒载体pTRV-CaPOD已经成功进入植株体中。(2)辣椒尚体叶片接种鉴定待检测基因功能选带有病毒症状的pTRV-CaPOD辣椒离体叶片进行辣椒疫霉菌phi接种。离体叶片接种浓度为I. OX IO4个每个叶片10 μ L。接种辣椒疫霉菌孢子悬浮液后，于28°C，相对湿度95%，50001x人工气候箱进行培养，5d后观察到的表型症状变化情况(见图2)pTRV-CaPOD病毒沉默植株离体叶片出现明显的坏死反应，而对照pTRV_00植株的离体叶片没有坏死斑，这一结果说明CaPOD与辣椒的抗疫病相关。应用实施例2:本实施例利用病毒诱导的基因沉默技术与辣椒离体叶片抗病性相结合的方法，进行辣椒疫病抗性相关基因的功能分析，具体如下I、辣椒材料的准备供试材料为辣椒高抗疫病品种CM334。选择籽粒饱满的辣椒种子，55°C温汤浸种20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工气候箱中进行催芽。经4d种子露白，播于穴盘中。然后转到25°C /18°C、16h/8h昼夜温光周期条件下进行培养，期间浇Hoagland’s营养液。待苗子两片真叶展平时，可用于病毒诱导的基因沉默注射。2、辣椒疫霉菌孢子悬浮液的准备选择辣椒疫霉菌生理小种phi作为接种病原菌，供试辣椒材料CM334对其表现为抗性(刘珂珂，辣椒对疫病的抗性及其机理研究[D].西北农林科技大学博士学位论文，2009)。病原菌的准备具体参考(罗德旭，巩振辉，李大伟.辣椒疫病抗病性分子鉴定技术研究[J].西北农业学报，2008，17 (5):76-80)的方法。
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3、重组病毒载体的构建(I)辣椒叶片总RNA的提取与cDNA第一链合成采用Trizol法提取辣椒叶片总RNA (Rugang Chen, Hanxia Li, Liying Zhang, Junhong Zhang, Jinghua Xiao and ZhibiaoYe. CaMi, a root-knot nematode resistance gene from hot pepper(Capsium annuumL.) confers nematode resistance in tomato[J]. Plant cell reports, 2007，26 (7):895-905),按Promega公司的反转录试剂盒操作说明进行cDNA第一链合成。(2)目的基因片段的克隆用于病毒沉默载体构建的基因片段大小一般要求在150-500bp之间，本发明中所涉及的基因引物设计均遵循本原则。根据申请人课题组克隆的辣椒CaRGAl基因序列(NCBI GenBank登录号GQ386945. I),设计合成一对带有Eco RI和Bam HI双酶切位点的引物序列(正向引物5，-GGGGAATTCAAGTCCTCAAACCACACCCCT-3'反向引物5’ -GGGGGATCCCAACATACTCCACCTCCGCAG-3’)，片段大小为 210bp。以步骤(I)合成的cDNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，DNA回收试剂盒(TaKaRa公司)回收目的基因。利用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)将回收产物连接到克隆载体pMD19-T上，16°C过夜。转化到大肠杆菌DH5a中，菌落PCR检测初步确定连接成功后，送上海生物工程公司进行测序。经分析得出扩增的基因片段序列与设计目的基因序列一致，即可用于构建基因沉默载体。(3)重组载体构建用于本实施例的病毒载体为烟草脆裂病毒的载体pTRVl和PTRV2。选用Eco RI和Bam HI内切酶对病毒载体pTRV2和经步骤(2)验证过的克隆载体T-CaRGAl进行双酶切，37°C过夜，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，凝胶成像系统拍照并切胶，用DNA回收试剂盒(TaKaRa公司)回收。利用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)将回收到的目的基因片段连接到病毒载体片段上，16°C过夜。转化DH5a，用菌落PCR和双酶切方法检测出2IObp大小的目的基因片段，证明重组病毒载体pTRV-CaRGAl构建成功，可用于下一步的农杆菌侵染。(4)转化农杆菌利用冻融法将携带pTRVl载体、pTRV2空载体和步骤(3)构建好的病毒载体的PTRV-CaRGAl分别导入农杆菌菌株GV3101中，PCR检测确定扩增出210bp的目的条带，保存菌液以备用。4、农杆菌菌液注射
(I)农杆菌菌液准备将携带pTRVl载体、pTRV2空载体和步骤3构建好的病毒载体pTRV-CaRGAl的农杆菌菌液按已知的方法进行活化,具体参考(Andr6C. Velasquez, SumaChakravarthy, Gregory B. Martin. Virus-induced Gene Silencing(VIGS) in Nicotianabenthamiana and Tomato[J].Journal of Visualized Experiments,2009, (28) e1292，DOI: 10. 3791/1292)方法。(2)注射接种先用针头分别在辣椒两片真叶叶脉附近打个小孔，然后用去掉针头的I. OmL注射器在叶片正面注射菌液，若能看到整个叶面出现水溃状，证明菌液已被注射进植株体内。将注射接种后的辣椒植株放入人工气候箱，18 °C、暗培养2d后，转 入22 °C /18 °C、16h/8h、60%湿度条件下进行培养，观察并记录辣椒的表型变化，期间以Hoagland’s营养液进行烧灌。5.基因沉默效果检测(I)沉默表型观察农杆菌注射接种大约25d后，辣椒叶片出现不同程度的病毒症状(见图3):即叶片表面有花绿色病毒斑点出现，证明重组病毒载体pTRV-CaRGAl已成功导入辣椒体内。(2)辣椒尚体叶片接种鉴定待检测基因功能选带有病毒症状的pTRV-CaRGAl辣椒离体叶片，接种辣椒疫霉菌phi。离体叶片接种浓度为I. OX IO4个· mr1，每个叶片10 μ L。接种辣椒疫霉菌孢子悬浮液后，于28°C，相对湿度95%，50001x人工气候箱进行培养，5d后观察到的表型症状变化情况(见图4)pTRV-CaRGAl病毒沉默植株离体叶片出现轻度的坏死斑，而对照pTRV_00植株几乎没变化，证明CaRGAl参与辣椒对疫病的抗性反应。应用实施例3:本实施例利用病毒诱导的基因沉默技术与辣椒离体叶片抗病性相结合的方法，进行辣椒疫病抗性相关基因的功能分析，具体如下I、辣椒材料的准备供试材料为辣椒高抗疫病品种CM334。选择籽粒饱满的辣椒种子，55°C温汤浸种20min，清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工气候箱中进行催芽。经4d种子露白，播于穴盘中。然后转到25°C /18°C、16h/8h昼夜温光周期条件下进行培养，期间浇Hoagland’s营养液。待苗子两片真叶展平时，可用于病毒诱导的基因沉默注射。2、辣椒疫霉菌孢子悬浮液的准备选择辣椒疫霉菌生理小种phi作为接种病原菌，供试辣椒材料CM334对其表现为抗性(刘珂珂，辣椒对疫病的抗性及其机理研究[D].西北农林科技大学博士学位论文，2009)。病原菌的准备具体参考(罗德旭，巩振辉，李大伟.辣椒疫病抗病性分子鉴定技术研究[J].西北农业学报，2008，17 (5):76-80)的方法。3、重组病毒载体的构建(I)辣椒叶片总RNA的提取与cDNA第一链合成采用Trizol法提取辣椒叶片总RNA (Rugang Chen, Hanxia Li, Liying Zhang, Junhong Zhang, Jinghua Xiao and ZhibiaoYe. CaMij a root-knot nematode resistance gene from hot pepper (Capsium annuumL.) confers nematode resistance in tomato[J]. Plant cell reports，2007，26 (7):895-905)，按Promega公司的反转录试剂盒操作说明进行cDNA第一链合成。(2)目的基因片段的克隆用于病毒沉默载体构建的基因片段大小一般要求在150-500bp之间，本发明中所涉及的基因引物设计均遵循本原则。根据NCBI公布的辣椒线粒体Caatp6基因序列(GenBank登录号DQ: 126681),设计合成一对带有Eco RI和Bam HI双酶切位点的引物序列(正向引物5’ -CCGGAATTCGCTTCGCCTTCGTATAGTAGTTC-3，;反向引物5’ -CGCGGATCCAGTCATAGTGCTCACCCTGTTTG-3> )，片段大小为 300bp。以步骤(I)合成的cDNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，DNA回收试剂盒(TaKaRa公司)回收目的基因。利用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)将回收产物连接到克隆载体pMD19-T上，16°C过夜。转化到大肠杆菌DH5a中，菌落PCR检测初步确定连接成功后，送上海生物工程公司进行测序。经分析得出扩增的基因片段序列与设计目的基因序列一致，即可用于构建基因沉默载体。(3)重组载体构建用于本发明的病毒载体为烟草脆裂病毒的载体pTRVl和PTRV2。选用Eco RI和Bam HI内切酶对病毒载体pTRV2和经步骤(2)验证过的克隆载体T-Ca-atp6-2进行双酶切，37°C过夜，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，凝胶成像系统拍照并切胶，用DNA回收试剂盒(TaKaRa公司)回收。利用T4DNA连接酶(TaKaRa公司)将回收到的目的基因片段连接到病毒载体片段上，16°C过夜。转化DH5a，用菌落PCR 和双酶切方法检测出300bp大小的目的基因片段，证明重组病毒载体pTRV-Ca-atp6-2构建成功，可用于下一步的农杆菌侵染。(4)转化农杆菌利用冻融法将携带pTRVl载体、pTRV2空载体和步骤(3)构建好的病毒载体pTRV-Ca-atp6-2分别导入农杆菌菌株GV3101中，PCR检测确定扩增出300bp的目的条带，保存菌液以备用。4、农杆菌菌液注射(I)农杆菌菌液准备将携带pTRVl载体、pTRV2空载体和步骤3构建好的病毒载体pTRV-Ca-atp6-2的农杆菌菌液按已知的方法进行活化,具体参考(Andr6C. Velasquez, SumaChakravarthy, Gregory B. Martin. Virus-induced Gene Silencing(VIGS) in Nicotianabenthamiana and Tomato[J]. Journal of Visualized Experiments,2009, (28)el292, DOI: 10. 3791/1292)方法。(2)注射接种先用针头分别在辣椒两片真叶叶脉附近打个小孔，然后用去掉针头的I. OmL注射器在叶片正面注射菌液，若能看到整个叶面出现水溃状，证明菌液已被注射进植株体内。将注射接种后的辣椒植株放入人工气候箱，18 °C、暗培养2d后，转入2 2 °C /18 °C、16 h / 8 h、6 O %湿度条件下进行培养，观察并记录辣椒的表型变化，期间以Hoagland’s营养液进行烧灌。5.基因沉默效果检测(I)沉默表型观察农杆菌注射接种大约25d后，辣椒叶片出现轻度病毒病斑症状，叶片有卷曲现象，证明重组病毒载体pTRV-Ca-atp6-2已成功导入辣椒植株体内。(2)辣椒离体叶片接种鉴定待检测基因功能选带有病毒症状的pTRV-Ca-atp6_2辣椒离体叶片，接种辣椒疫霉菌phi。离体叶片接种浓度为I. OX IO4个每个叶片10 μ L0接种辣椒疫霉菌孢子悬浮液后，于28°C，相对湿度95%，50001x人工气候箱进行培养，5d后观察到的表型症状变化情况，发现pTRV-Ca-atp6-2病毒沉默植株离体叶片与对照pTRV-ΟΟ植株离体叶片无明显差异，说明Ca-atp6-2基因与辣椒疫病抗性无关。
权利要求
1. 一种快速鉴定辣椒抗疫病相关基因的方法，其特征在于，该方法利用病毒诱导的基因沉默技术与辣椒离体叶片抗病性相结合的方法，进行辣椒疫病抗性相关基因的功能分析，具体步骤如下 1)辣椒材料的准备 供试材料为辣椒高抗疫病品种CM334。选择籽粒饱满的辣椒种子，55°C温汤浸种20min,清水浸泡5h，28°C，全黑暗人工气候箱中进行催芽；经4d种子露白，播于穴盘中，然后转到25°C/18°C、16h/8h昼夜温光周期条件下进行培养，培养期间浇Hoagland’s营养液，待苗子两片真叶展平时，用于病毒诱导的基因沉默注射； 2)辣椒疫霉菌孢子悬浮液的准备 选择辣椒疫霉菌生理小种Phl作为接种病原菌，供试辣椒材料CM334对辣椒疫霉菌生理小种phi表现为抗性的方法。
3)重组病毒载体的构建 (1)辣椒叶片总RNA的提取与cDNA第一链合成 采用Trizol法提取辣椒叶片总RNA,按Promega公司的反转录试剂盒操作说明进行cDNA第一链合成； (2)目的基因片段的克隆 用于基因沉默表达载体构建的基因片段大小要求在150-500bp之间；根据NCBI公布的或已克隆的辣椒疫病抗性相关基因序列，设计合适的引物序列；以步骤(I)合成的cDNA为模板进行PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，DNA回收试剂盒回收目的基因；利用T4DNA连接酶将回收产物连接到克隆载体pMD19-T上，16°C过夜，然后转化到大肠杆菌DH5a中，菌落PCR检测初步确定连接成功后，进行测序，确认克隆基因片段序列与目的基因序列一致时，即可用于构建基因沉默表达载体； (3)重组载体构建 选择病毒载体为烟草脆裂病毒的载体pTRVl和pTRV2 ;选择合适的酶切位点对病毒载体pTRV2和步骤(2)经过测序验证含有目的基因序列的克隆载体进行双酶切，37°C过夜，酶切产物经2%琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色，凝胶成像系统拍照并切胶，用DNA回收试剂盒回收，利用T4DNA连接酶将回收到的目的基因片段连接到病毒载体片段上，16°C过夜，转化DH5a，用菌落PCR和双酶切方法检测出目的基因片段，证明目的基因已经成功转入病毒载体中； (4)转化农杆菌 利用冻融法将携带PTRVl载体、pTRV2空载体和步骤(3)构建好的病毒载体分别导入农杆菌菌株GV3101中，经PCR检测确定为目的基因，保存菌液以备用。
4)农杆菌菌液注射 (1)农杆菌菌液准备 将携带PTRVl载体、pTRV2空载体和步骤3)构建好的病毒载体的农杆菌菌液按已知的方法进行活化； (2)注射接种先用针头分别在辣椒两片真叶叶脉附近打个小孔，然后用去掉针头的I.OmL注射器在叶片正面注射菌液，若能看到整个叶面出现水溃状，证明菌液已被注射进植株体内；将注射接种后的辣椒植株放入人工气候箱，18 °C、暗培养2d后，转入22 °C /18 °C,16h/8h、60%湿度条件下进行培养，观察并记录辣椒的表型变化，培养期间以Hoagland’s营养液进行浇灌； 5)基因沉默效果检测 (1)沉默表型观察 辣椒叶片农杆菌注射接种25d就会出现不同程度的病毒症状，证明病毒载体已经成功导入植株体内； (2)辣椒尚体叶片接种鉴定待检测基因功能 选带有病毒症状的辣椒离体叶片接种辣椒疫霉菌phi。离体 叶片接种浓度为1.0X104个-mr1,每个叶片10 μ L ;接种辣椒疫霉菌孢子悬浮液后，于28°C，相对湿度95%，50001x人工气候箱中进行培养，5d后观察表型症状的变化； 观察方法是，在叶片接种部位出现明显病斑的，说明被检测基因与辣椒抗疫病相关；相反，在叶片接种部位没有出现明显病斑的，则说明被检定基因与辣椒抗疫病无关，或是无功能基因。
全文摘要
本发明公开了一种快速鉴定辣椒抗疫病相关基因功能的方法。利用病毒诱导的基因沉默技术与辣椒离体叶片抗病性技术相结合的方法对辣椒的抗疫病相关基因CaPOD和CaRGA1进行功能鉴定，主要包括构建基因沉默表达载体，经农杆菌GV3101介导侵染辣椒叶片并观察叶片的表型变化，产生沉默效果的辣椒植株叶片表现出明显地病毒症状；对沉默植株的离体叶片接种辣椒疫霉菌病原，在叶片接种部位出现明显坏死病斑的，说明被检测基因与辣椒抗疫病相关；相反，在叶片接种部位没有出现明显病斑的，则说明被检定基因与辣椒抗疫病无关，或是无功能基因。该发明为大规模验证辣椒抗病基因功能奠定了基础，从而可极大地加快辣椒分子育种的进程。
文档编号A01G7/06GK102812836SQ201210296540
公开日2012年12月12日 申请日期2012年8月20日 优先权日2012年8月20日
发明者巩振辉, 王军娥, 李大伟, 张莹丽, 贺玉梅 申请人:西北农林科技大学