一种与辣椒抗疫病基因紧密连锁的分子标记及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种与辣椒抗疫病基因紧密连锁的分子标记 及其应用。
【背景技术】
[0002] 辣椒疫病（Phytophthora bligh)是由疫霉菌（Phytophthora capsici Leon.)引 起的一种毁灭性的土传病害。该病1918年首次在美国发现，现已在世界各地的辣椒种植区 发生。我国自20世纪50年代在江苏发现辣椒疫病以来，至今已在多个省份发生过，成为影 响我国辣椒生产的主要障碍。该病可在辣椒生长的任何时期，侵染植株的任何部位，雨水、 土壤、气流等均可成为疫病的传播途径。目前生产上防治疫病的方法主要是化学防治，但该 方法会造成环境污染，并且由于选择压力的存在，疫霉菌易发生变异而产生抗药性，从而增 加了防治的难度。
[0003] 国内外研宄和生产实践证明，选育抗病品种是防治和减轻疫病危害的最经济、安 全和有效的防治方法。为此，在抗源材料的筛选以及抗疫病基因定位方面已经有很多报道。 现在被公认的抗源材料有CM334、PI 201234、Perennial等。关于抗疫病基因的定位，大部 分研宄都是将辣椒的该抗性作为数量性状抗性进行定位，并将抗病性位点定位在多个染色 体上，但最近的研宄得出的较为一致的结论为，控制抗性的主要QTL位点位于辣椒的5号染 色体上，并且在该染色体的三个QTL位点（Pc5. l、Pc5. 2和Pc5. 3)中，Pc5. 1对抗性的贡献 率最高。
[0004] 随着现代生物技术的迅猛发展，分子标记辅助选择育种成为育种工作的重要辅助 手段。该技术是利用与决定特定性状基因紧密连锁的分子标记，通过对标记进行检测来确 定基因是否存在，从而大大加速育种进程，节约大量成本，显著缩短了育种周期。另外，在聚 合育种方面，分子标记辅助选择的优势更加明显。因此，开发有效的分子标记对于新品种的 选育具有重要意义。
【发明内容】
[0005] 本发明的一个目的是提供一种用于鉴定待测辣椒是否抗辣椒疫病的引物对。
[0006] 本发明提供的用于鉴定待测辣椒是否抗辣椒疫病的引物对由SEQ ID No. 1所示的 DNA分子和SEQ ID No. 2所示的DNA分子组成。
[0007] 本发明的另一个目的是提供一种用于鉴定待测辣椒是否抗辣椒疫病的PCR试剂。
[0008] 本发明提供的用于鉴定待测辣椒是否抗辣椒疫病的PCR试剂包括上述引物对。
[0009] 本发明还有一个目的是提供一种用于鉴定待测辣椒是否抗辣椒疫病的试剂盒。
[0010] 本发明提供的用于鉴定待测辣椒是否抗辣椒疫病的试剂盒包括上述引物对或上 述PCR试剂。
[0011] 上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒中，所述辣椒疫病的病原菌为辣椒疫病 生理小种2。
[0012] 上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否抗辣 椒疫病中的应用也属于本发明的保护范围。
[0013] 上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒在鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否为抗 辣椒疫病品种中的应用也属于本发明的保护范围。
[0014] 本发明的另一个目的是提供一种鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否抗辣椒疫病的方 法。
[0015] 本发明提供的鉴定或辅助鉴定待测辣椒是否抗辣椒疫病的方法包括如下步骤：
[0016] (1)用上述引物对对待测辣椒进行PCR扩增，得到PCR扩增产物；
[0017] (2)检测所述PCR扩增产物的大小；
[0018] 若PCR扩增产物含有大小为195bp的片段，则待测辣椒抗辣椒疫病或候选抗辣椒 疫病；
[0019] 若PCR扩增产物含有大小为152bp的片段且不含有195bp，则待测辣椒不抗椒疫病 或候选不抗辣椒疫病；
[0020] 上述方法中，所述PCR扩增的模板为待测辣椒的基因组DNA。
[0021] 上述方法中，所述PCR扩增的退火温度为50°C。
[0022] 上述引物对或上述PCR试剂或上述试剂盒或上述方法在辣椒疫病分子标记辅助 育种或抗病基因定位中的应用也属于本发明的保护范围。
[0023] 本发明的有益效果：
[0024] (1)本发明所提供的分子标记ZL6726(引物对）可用于分子标记辅助育种，具有特 异性强、稳定性尚的特点；
[0025] (2)本发明的分子标记ZL6726(引物对）对检测设备和底物模板质量的要求不 高，且所扩增的特异片段较小且在抗感材料间差异明显，检测周期短，适合高通量、自动化 操作，适用于现代分子标记辅助育种的实践；
[0026] (3)本发明为辣椒抗疫病基因的精细定位及克隆提供了重要的遗传学信息，可进 一步通过染色体步移法精细定位基因，从而克隆该基因；
[0027] (4)本发明的分子标记ZL6726(引物对）可应用于辣椒育种工作，不仅可以极大降 低辣椒疫病流行对辣椒生产造成的经济损失，还可降低生产成本，降低农药的使用量。
[0028] 本发明采用灌根接种法对辣椒抗疫病材料PI 201234和高度感病材料上海园椒 及其构建的Fp F2、BC1Pp BC1P2群体进行抗病性鉴定，通过分析发现PI 201234对辣椒疫病 生理小种2的抗性符合单基因显性遗传模式。通过引物筛选以及对F2群体的基因型进行 分析，发现位于5号染色体上的分子标记ZL6726与抗病基因紧密连锁。根据连锁遗传图谱 显示，分子标记ZL6726(引物对）与抗病基因的遗传距离均为1.3cM。通过实验证明：本发 明的分子标记ZL6726 (引物对）特异性强，可用于辣椒分子标记辅助育种，通过苗期筛选即 可对抗病植株进行选择，可节约成本，提高选择效率，大大加速育种进程，为进一步通过染 色体步移法精细定位并克隆抗病基因奠定了基础。
【附图说明】
[0029] 图1为辣椒抗疫病基因的SSR标记连锁遗传图谱。其中，X代表抗病基因。
[0030] 图2为分子标记ZL6726在双亲、抗感池以及F2群体中随机挑选的抗病和感病单 株中的扩增结果。其中，1:感病亲本上海园椒；2:抗病亲本PI 201234 ;3:感病池；4:抗病 池；5-14 :F2群体中10株抗病单株；15-24 :F2群体中10株感病单株。
[0031] 图3为分子标记ZL6726在各抗感品种中的扩增结果。其中，1 :农大40 ;2 :茄门； 3 !Early Calwonder ;4 :卡佩诺；5 :脆龙216 ;6 :超级108 ;7 :益都红；8 :辛香4号；9 :遵椒 2 号；10 :PI201234 ;11 :PBC602。
【具体实施方式】
[0032] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0033] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0034] 下述实施例所用的辣椒感疫病品种上海园椒作为母本（P1),辣椒抗疫病品种 PI201234作为父本（P2)，利用两个亲本配制得到Fp BC1Pn BC1PjP F 2群体。
[0035] 下述实施例中的辣椒感疫病品种上海园椒在文献"青椒一代杂种上海园椒X茄 门及其制种技术"中公开过；辣椒抗疫病品种PI 201234在文献"Resistance To Foliar Blight And Crown Rot Of Pepper Caused by Phytophthora capsici" 中公开过，公众可 从中国农业大学农学与生物技术学院获得。
[0036] 茄门和Early Calwonder均为高度感病的辣椒品种，茄门在文献"A Novel Pepper(Capsicum annuum L. )WRKY Gene, CaffRKY30, Is Involved in Pathogen Stress Responses" 中公开过；EarIy Calwonder 在文献"Effect of soil matric potential and periodic floodingon mortality of peppercaused by Phytophthora capsici" 中公开 过，公众可从中国农业大学农学与生物技术学院获得。
[0037] 下述实施例中的辣椒疫病的病原菌属于生理小种2,在文献"Genetically Diverse Long-Lived Clonal Lineages of Phytophthora capsici from Pepper in Gansu，China"中公开过，公众可从中国农业大学农学与生物技术学院获得。
[0038] 下述实施例中的辣椒疫病病原菌的孢子悬浮液的制备方法：用直径为Icm的打孔 器在辣椒疫病的病原菌菌落边缘选取带有菌丝的培养基，将其置于装有CA培养基（CA培养 基的制备方法：称取200g胡萝卜，切成小块放入榨汁机并加少量水，将其粉碎后用四层纱 布将滤液过滤到烧杯中，称取Hg琼脂粉放入滤液中并混匀，加水将溶液定容至1L，将混匀 后的溶液转入2L的锥形瓶中，高压蒸汽灭菌40分钟，每个培养皿中倒入约15ml培养基） 的培养皿中心，密封好后将培养皿置于培养箱中，温度控制在25°C，暗培养5~6天。然后， 将培养皿换至光照下培养，光周期为12h光照/12h黑暗，温度为25°C。光暗交替培养5-7 天后，疫霉菌可产生大量孢子囊，在培养基表面加入IOml无菌去离子水，然后将培养皿放 到4°C冰箱内，30min后移至室温放置，30~60min后游动孢子释放。用两层纱布过滤得到 孢子悬浮液，借助于血球计数板计算孢子的数量，用无菌去离子水稀释至每毫升约IO 5个孢 子，得到辣椒疫病病原菌的孢子