一种用于修复土壤芘和茚并(1,2,3-cd)芘污染的生物煤渣粒的制作方法
【技术领域】
[0001]本发明属于环境净化技术领域，具体涉及一种用于修复土壤芘和茚并(1，2，3-cd)芘污染的生物煤渣粒。
【背景技术】
[0002]PAHs是一类含有2个或2个以上苯环的具有“三致”作用(致癌、致畸、致突变)的芳烃。而高分子量PAHs(HMW-PAHs)是由4个及以上的苯环组成，由于它们不仅化学结构复杂、很难被氧化，而且疏水性强、热稳定性强、生物可利用性低，其自然降解过程十分缓慢。芘是具有4个苯环的稠环芳烃，高度对称，是检测多环芳烃污染的指示物，其代谢物醌(Quinone)比芘毒性更大，具有致突变性。分子量较大的6个环的茚并(1，2，3_cd)芘的光解、水解和生物降解是很微弱的，带来的环境污染问题日益突出。目前对污染的治理方法主要有物理法、化学法和生物法，普遍认为微生物降解是去除PAHs的最有效手段之一。然而传统的游离微生物降解PAHs存在许多不足，如单位体积内有效降解菌浓度低、与土著菌竞争处于劣势、对环境条件敏感、抗毒性侵害能力差等。而固定化微生物技术可以克服这些弊端，使修复效果得到大大改善。
[0003]微生物固定化技术是20世纪80年代兴起的一种新型生物技术，是利用物理或化学的手段，将游离的微生物细胞或酶定位于限定的空间区域内，使其保持活性并能反复使用的一种技术。固定化方法有很多，其中包埋法催化活性、保留能力和存活力都较高，应用灵活，有较好的综合性能，是较为实用方便的固定化方法。
[0004]包埋固定化法是使微生物包裹在高分子凝胶中，或包裹在半透性高分子膜中，使微生物细胞扩散进入多孔性载体内部，小分子底物及代谢物可自由进入孔隙，而微生物却不能移动。尽管包埋固定化法已经广泛应用于有机物污染的土壤修复中，但是应用在土壤中高分子量多环芳烃(HMW PAHs)的净化中的研宄还较少。限制包埋固定化法在土壤修复中应用的主要原因有两方面:一方面是由于非流体介质本身所具有的复杂性和特殊性，给该技术提出了许多不同于在流体介质中应用固定化技术时所面临的科学问题，如微生物固定化的载体如何选择，如何克服污染物浓度的非均质性对固定化颗粒造成的冲击，如何提高固定化颗粒的机械强度以抵抗环境胁迫造成的物理损伤；另一方面是包埋法本身存在的缺陷，如颗粒的扩散传质性能差、空气不均匀、抗温度变化能力弱等。此外，未开发出广谱性的固定化技术，尚未解决混合菌的固定化问题。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种用于修复土壤芘和茚并(1，2，3-cd)芘污染的生物煤渣粒，从而弥补现有技术的不足。
[0006]本发明以经过预处理的煤渣为载体材料，以改性PVA为凝胶剂，使固定化条件更加简化和温和，并可对不同属微生物进行固定化。将制得的固定化颗粒应用于受石油污染的土壤中高分子量多环芳烃的净化中，结果表明按照该配方制得的固定化颗粒机械强度高，对高分子量多环芳烃的净化具有良好的效果，从而促成了本发明。
[0007]本发明首先提供一种用于制备微生物固定化颗粒的凝胶液，该凝胶液包含有改性聚乙烯醇有机粘合剂(改性PVA)和煤渣；
[0008]其中改性PVA有机粘合剂和煤渣的体积质量百分比为5?10 % (mL: g)
[0009]所述的改性PVA，其制备方法如下:在85°C水浴条件下将粉末状的1799型聚乙烯醇溶于去离子水中，溶解后加入丁二酸，待溶解反应后冷却至室温即得高效PVA有机粘合剂，其中去离子水、聚乙烯醇、丁二酸的配比为80:5.6:l(mL:g:g)。
[0010]载体煤渣的制备方法是磨碎的煤渣过100目筛子，用盐酸溶液浸泡24h，弃去上清液，用去离子水清洗煤渣至其pH为6?7，烘干。
[0011]其中盐酸溶液的浓度为6mol/L ；
[0012]本发明还提供一种用于降解芘和茚并(1，2，3-cd)芘的微生物固定化颗粒，是将细菌种子液与已灭菌的凝胶液混匀，在室温条件下经制粒机得到颗粒，再经交联剂交联，最后以无菌水浸泡得到；将浸泡后的颗粒加入到接种了微生物的增殖培养基中进行培养3d，培养后得到微生物固定化颗粒。
[0013]所述的微生物，为能降解芘和茚并(1，2，3-cd)芘的微生物；
[0014]所述的交联剂为CaCl2水溶液；
[0015]所述的增殖培养基的组成如下:葡萄糖4%，酵母膏0.3%，KH2PO40.05%,MgSO4.7H20 0.02%, NH4Cl 0.1%, pH 7.0。
[0016]本发明的高效降解菌的固定化选用煤渣等多孔介质材料做载体，具有成本低、无二次污染等优点，非常适合投入实际应用中。
【具体实施方式】
[0017]本发明以滨海湿地中石油污染的土壤和PAHs—芘和茚并(1，2，3-cd)芘为研宄对象，下面通过实施例对本发明作进一步详细说明。
[0018]实施例1 (比较例)
[0019]1、芘和茚并(1，2，3-cd)芘高效降解菌的选取
[0020]本发明微生物，为能降解芘和茚并(1，2，3-cd)芘的微生物；在本发明具体实施例中固定化所用到的高效降解菌为混合菌种(Methylobacterium sp.lxb-3,甲基杆菌属，保藏编号为CGMCC N0.3713和Rhodococcus sp.lxb-6,红球菌属，保藏编号为CGMCCN0.3715)，混合比例为1:1。
[0021]2、降解菌的固定化
[0022]I)将培养到对数期的降解菌悬液离心浓缩到0D_= 1.0，细菌含量2x10 9Cells/
mLo
[0023]2)凝胶液的制备:改性PVA的制备方法是在85°C水浴条件下，将粉末状的聚乙烯醇溶于去离子水中，溶解后加入丁二酸，待溶解后冷却至室温即得高效PVA有机粘合剂。其中，去离子水、聚乙烯醇、丁二酸的配比为80:5.6:l(mL:g:g)。
[0024]载体煤渣的制备方法是磨碎的煤渣过100目筛子，用6mol/L的盐酸浸泡24h，弃去上清液，用去离子水反复清洗煤渣至其pH为6?7，烘干。
[0025]改性PVA溶液和载体煤渣(100目)的体积质量百分比为5% (mL:g, 5ml改性PVA溶液添加到10g载体煤渣中)。制得的凝胶液于121°C、0.1MPa条件下湿式灭菌20min。
[0026]3)交联剂:4% CaCljK溶液。
[0027]4)增殖培养基:葡萄糖4%，酵母膏 0.3%,KH2PO40.05%,MgSO4.7Η200.02%,NH4Cl
0.1%, pH 7.0。
[0028]按照重量10%的比例将细菌种子液与凝胶液混匀，在室温条件下，通过4?1mm的制粒器，得到固定化颗粒，再经交联剂12h化学交联，最后以无菌水浸泡4d，将制得的固定化颗粒在无菌条件下加入增殖培养基中，于30°C、150rpm条件下振荡增殖培养24h后，更换培养基，共三次培养，得到微生物固定化颗粒。按照以上步骤，将制得的芘和茚并(I, 2，3-cd)芘降解菌固定化颗粒投加到PAHs污染较严重的土壤中，投粒比为20%，30d后米集土壤样品。
[0029]通过超声萃取提取PAHs，具体过程如下:称取2.0g 土壤样品与2.0g无水硫酸钠于离心管中，混匀，向其中加入20mL正己烷与二氯甲烷的混合液(体积比为1:1)，超声萃取20min。静置30min后，转移上清液至平底烧瓶，重复上述操作2次。将上清液合并，旋蒸至2mL，用胶头滴管吸取平底烧瓶中的液体至填装完毕的层析柱中，用适量正己烷淋洗烷烃，弃去洗脱下来的液体。用30mL正己烷与二氯甲烷的混合液(体积比为7:3)洗脱层析柱(3cm氧化销，6cm娃胶，0.5cm无水硫酸钠)。最后将溶液旋转蒸发至lmL，氮吹定容至lmL，待上机测定。用气相色谱一质谱联用仪(GC-MS)分析各土壤样品中高环PAHs的含量。GC-MS仪器条件如下:进样口温度290°C，进样量I μ L，无分流比；起始柱温50°C，保持2min ;以8 0C.miiT1的速度升温至230 °C ;再以3.5°C.min <的速度升温至300°C，保持7min。
[0030]本发明使用了改性的PVA，从而使制备的固定化颗粒更稳定，能够更好地使微生物来处理芘和茚并(1，2，3-cd)芘。土壤中芘的初始浓度为204ng/g时，30d后，芘的去除率为70.7%，茚并(1，2，3-cd)芘的初始浓度为80.5ng/g，30d后去除率为80.9% ;而使用没有改性的PVA制备的固定化颗粒，稳定性不好，且处理效率也不高，芘的去除率仅为51.1%,茚并(I, 2, 3-cd)芘的去除率仅为45.9%。
[0031]实施例2 (比较例)
[0032]与实施例1不同之处在于:将制得的芘和茚并(1，2，3-cd)芘降解菌固定化颗粒投加到PAHs污染程度较低的土壤中，其中芘的初始浓度为143ng/g，茚并(1，2，3-cd)芘的初始浓度为33ng/g。
[0033]添加使用了改性的PVA制备的固定化颗粒，30d后，芘的去除率为58.9 %，茚并(I, 2，3-cd)芘的去除率为60.8% ;而使用没有改性的PVA制备的固定化颗粒，其去除效果不理想，芘的去除率仅为40.7%，茚并(1，2，3-cd)芘的去除率仅为46.5%。
【主权项】
1.一种用于制备微生物固定化颗粒的凝胶液，其特征在于，所述的凝胶液包含有改性聚乙烯醇有机粘合剂和煤渣。
2.如权利要求1所述的凝胶液，其特征在于，所述的改性聚乙烯醇有机粘合剂和煤渣的体积质量百分比为5?10%。
3.如权利要求1或2所述的凝胶液，其特征在于，所述的改性聚乙烯醇有机粘合剂的制备方法如下:在85°C水浴条件下将粉末状的1799型聚乙烯醇溶于去离子水中，溶解后加入丁二酸，待溶解反应后冷却至室温即得高效PVA有机粘合剂，其中去离子水、聚乙烯醇、丁二酸的配比为80:5.6:lo
4.如权利要求1或2所述的凝胶液，其特征在于，所述的煤渣的制备方法是磨碎的煤渣过100目筛子，用盐酸溶液浸泡24h，弃去上清液，用去离子水清洗煤渣至其pH为6?7，烘干完成制备。
5.一种用于降解芘和茚并(l，2，3-cd)芘的微生物固定化颗粒，其特征在于，所述的固定化颗粒是将细菌种子液与权利要求1所述的凝胶液混匀，在室温条件下经制粒机得到颗粒，再经交联剂交联，以无菌水浸泡；将浸泡后的颗粒加入到接种了微生物的增殖培养基中进行培养，培养后得到微生物固定化颗粒。
6.如权利要求6所述的凝胶液所述的微生物固定化颗粒，其特征在于，所述的微生物为能降解芘和茚并(l，2，3-cd)芘的微生物。
7.如权利要求6所述的凝胶液所述的微生物固定化颗粒，其特征在于，所述的增殖培养基的组成如下:葡萄糖4%，酵母膏0.3%, KH2PO40.05%, MgSO4.7H20 0.02%, NH4Cl0.1%, pH 7.0。
【专利摘要】本发明提供一种用于净化受石油污染的土壤中高分子量多环芳烃芘和茚并(1,2,3-cd)芘的生物煤渣粒的制备方法，以强化净化污染土壤中的芘和茚并(1,2,3-cd)芘，其特征在于首先从已报道出的芘和茚并(1,2,3-cd)芘降解菌中选取其高效降解菌；然后将上述菌种接种于液体富集培养基中，得到芘和茚并(1,2,3-cd)芘降解菌浊液；以经过预处理的煤渣为载体材料，改性PVA为凝胶剂制得凝胶液；最后按照重量10％～20％的比例将细菌浊液与灭菌的凝胶液混匀，在室温条件下，通过4～10mm的制粒机，得到固定化颗粒，再经交联剂12h化学交联，以无菌水浸泡4d，增殖培养3d，即制得生物煤渣粒。本发明利用煤渣的多孔隙和高负载能力，使得固定于颗粒内部的降解菌的生存环境得到改善，进而耐环境冲击力增强。
【IPC分类】B09C1-10, C12N11-02, C12N11-08
【公开号】CN104651343
【申请号】CN201510109324
【发明人】田伟君, 黄汝英, 刘庆, 俞慧博, 金鑫, 赵阳国
【申请人】中国海洋大学
【公开日】2015年5月27日
【申请日】2015年3月12日