一种应用于甲基结合蛋白测序中的甲基化dna富集方法
【专利摘要】本发明涉及分子生物学领域，公开了一种应用于甲基结合蛋白测序中的甲基化DNA富集方法，包含以下步骤：(1)磁珠的活化与甲基结合蛋白交联反应；(2)甲基结合蛋白-磁珠复合物与片段化DNA的孵化；(3)去除非甲基化DNA；(4)甲基化DNA洗脱；(5)乙醇沉淀，得到富集的甲基化DNA。同现有技术相比，本发明在去除非甲基化DNA这步，依次采用160mM?NaCl与200mM?NaCl对片段化DNA与甲基结合蛋白-磁珠复合物的混合物进行洗脱，更完全地除去了非甲基化DNA，保留甲基化DNA，提高了最后富集到的DNA中甲基化DNA的比例，从而提高了甲基化区域的测序深度。
【专利说明】一种应用于甲基结合蛋白测序中的甲基化DNA富集方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及甲基结合蛋白测序【技术领域】，特别涉及一种在甲基结合蛋白测序过程 中所使用的甲基化DNA富集方法。
【背景技术】
[0002] DNA甲基化是重要的表观遗传学标记信息，获得全基因组范围内所有C位点的甲 基化水平数据，对于表观遗传学的研究具有重要意义。甲基化测序属于表观遗传学研究。甲 基结合蛋白测序是将甲基化DNA富集和高通量测序相结合的一种测序方法。
[0003] 甲基化测序的方法有很多种，如全基因组甲基化测序，简化甲基化测序，甲基化 DNA免疫共沉淀测序，甲基结合蛋白测序等。全基因组甲基化测序是将亚硫酸氢盐处理与高 通量测序技术相结合，从而绘制单碱基分辨率的DNA甲基化图谱。简化甲基化测序是利用 限制性内切酶对基因组进行酶切，可以极大幅度地提高CpG区域的测序深度，与全基因组 甲基化测序相比减少了大量的测序量。甲基化DNA免疫共沉淀测序是基于抗体富集原理进 行测序的全基因组甲基化检测技术，采用甲基化DNA免疫共沉淀技术，通过5' -甲基胞嘧啶 抗体特异性富集基因组上发生甲基化的DNA片段，然后通过高通量测序可以在全基因组水 平上进行高精度的CpG密集的高甲基化区域研究。
[0004] 甲基结合蛋白测序的原理是：由于在哺乳动物中甲基化一般发生在CpG的胞嘧啶 5位碳原子上，所以可通过特异性结合甲基化DNA的蛋白MBD富集高甲基化的DNA片段，并 结合第二代高通量测序，对富集到的DNA片段进行测序，从而检测全基因组范围内的甲基 化位点。
[0005] 在甲基结合蛋白测序的过程中，利用MBD蛋白与甲基化DNA的特异性结合，除去 非甲基化DNA，将甲基化DNA特异性地富集下来，再用甲基化DNA这一部分去构建文库并测 序。文库的插入片段中非甲基化DNA所占的比例越小，测序得到的最终数据中甲基化DNA 部分所占的数据量越大，相应地甲基化区域的覆盖率和覆盖深度也越大，测序深度也越大。 若实验中在非甲基化DNA洗脱后，残留的非甲基化DNA较多，就会导致文库中非甲基化DNA 增多，最终数据中甲基化DNA的部分数据量变小。所以在得到相同数据量的情况下，非甲基 化DNA去除的越干净，甲基化区域的数据量越大，测序深度越深，相应地成本也会降低。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的在于提供一种甲基化DNA的富集方法，将该方法应用于甲基结合蛋 白测序中，可提高富集DNA中甲基化DNA的比例、降低非甲基化DNA的比例，从而提高甲基 化区域的测序深度。
[0007] 为解决上述技术问题，本发明提供了一种应用于甲基结合蛋白测序中的甲基化 DNA富集方法，包含以下步骤：
[0008] (1)磁珠的活化与甲基结合蛋白交联反应
[0009] 将磁珠进行活化，然后使生物素标记的甲基结合蛋白与活化后的磁珠发生交联反 应，得到甲基结合蛋白-磁珠复合物；
[0010] (2)甲基结合蛋白-磁珠复合物与片段化DNA的孵化
[0011] 将片段化DNA加入步骤（1)得到的甲基结合蛋白-磁珠复合物中，进行孵化，使甲 基化DNA与复合物进行特异性地结合；
[0012] (3)去除非甲基化DNA
[0013] 对步骤⑵中经孵化的片段化DNA与甲基结合蛋白-磁珠复合物的混合物，用 160mM NaCl将磁珠洗脱4遍，再用200mM NaCl洗脱3遍，除去非甲基化DNA ;
[0014] (4)甲基化DNA洗脱
[0015] 对步骤⑶中得到的去除了非甲基化DNA的混合物，使用2000mM NaCl对磁珠进 行洗脱，得到甲基化DNA组份；
[0016] (5)乙醇沉淀
[0017] 采用乙醇沉淀法对步骤（4)中洗脱得到的甲基化DNA组份进行沉淀，干燥后以TE 缓冲液溶解，即得到富集的甲基化DNA。
[0018] 本发明所提供的甲基化DNA富集方法，分五步骤进行，首先使活化后的磁珠与生 物素标记的甲基结合蛋白发生交联，获得甲基结合蛋白-磁珠复合物；其次使该复合物与 片段化DNA发生孵化；然后依次以160mM NaCl和200mM NaCl进行洗脱，以去除非甲基化 DNA ;去除非甲基化DNA之后，又以2000mM NaCl进行甲基化DNA的洗脱；最后采用乙醇沉淀 法获得富集的甲基化DNA，进一步用于后续的甲基化结合蛋白测序。
[0019] 在利用不同浓度的NaCl进行梯度洗脱时，随着NaCl浓度的增高，洗脱下来的DNA 甲基化程度越高。本发明在对非甲基化DNA洗脱这一步骤中，结合使用了 160mM NaCl和 200mM NaCl两种洗脱液；先用160mM NaCl对经孵化后的片段化DNA与甲基结合蛋白-磁 珠复合物的混合物洗脱了 4遍，以达到去除非甲基化DNA的目的；然后再用200mM NaCl洗 脱了 3遍，更进一步地将非甲基化DNA尽可能地去除干净。通过上述两种洗脱液依次完成 的洗脱步骤，更完全地除去了非甲基化DNA，保留甲基化DNA，提高了最后富集到的DNA中 甲基化DNA的比例，再用富集得到的DNA去构建文库并测序。文库的插入片段中非甲基化 DNA所占的比例越小，测序得到的最终数据中甲基化DNA部分所占的数据量越大，相应地甲 基化区域的覆盖率和覆盖深度也越大，测序深度也越大。若实验中在非甲基化DNA洗脱后， 残留的非甲基化DNA较多，就会导致文库中非甲基化DNA增多，最终数据中甲基化DNA的部 分数据量变小。所以在得到相同数据量的情况下，非甲基化DNA去除的越干净，甲基化区域 的数据量越大，测序深度越深，相应地成本也会降低。
[0020] 优选地，本发明所提供的甲基化DNA富集方法中，步骤（1)中进行磁珠的活化时， 在DNA样本中加入磁珠的量为1 μ g DNA/10 μ 1磁珠。
[0021] 优选地，本发明所提供的甲基化DNA富集方法中，步骤（1)中使生物素标记的甲 基结合蛋白与活化后的磁珠发生交联反应时，所使用的生物素标记的甲基结合蛋白的量为 1 μ gDNA/7 μ 1生物素标记的甲基结合蛋白。
[0022] 优选地，本发明所提供的甲基化DNA富集方法中，步骤（2)中使片段化DNA与甲基 结合蛋白-磁珠复合物进行孵化时，在室温下进行孵化，孵化时间为1小时。
[0023] 优选地，本发明所提供的甲基化DNA富集方法中，步骤⑶中以200mMNaCl洗脱 时，每次加入200mM NaCl的量为200微升。
[0024] 优选地，本发明所提供的甲基化DNA富集方法中，步骤（4)中以用2000mM的NaCl 洗脱3次。
[0025] 优选地，本发明所提供的甲基化DNA富集方法中，步骤（5)中，乙醇沉淀法中所使 用的乙醇的体积浓度为70%，干燥在室温下进行，干燥时间小于5分钟。
【专利附图】
【附图说明】
[0026] 图1是用非甲基化引物扩增非甲基化DNA得到的电泳图，其中，泳道上标的数字是 洗脱液中NaCl的浓度，单位是mM ;
[0027] 图2是用甲基化引物扩增甲基化DNA得到的电泳图，其中，泳道上标的数字是洗脱 液中NaCl的浓度，单位是mM。
【具体实施方式】
[0028] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明的各实 施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中， 为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基 于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请各权利要求所要求保护的技术方 案。
[0029] 实施例1甲基化DNA富集实验例 [0030] 1.磁珠（Dynabeads# )的准备
[0031] 注意：磁珠 Dynabeads?不能剧烈震荡，用枪以轻柔的上下吸打的方法将其混匀， 以备使用。
[0032] 1. IBeads 活化
[0033] 1)用无酶的水将 5X Bind/Wash Buffer ( S卩 800mM NaCl，以下使用的 5XBind/Wash Buffer 都为 800mM NaCl))稀释成 IX Bind/Wash Buffer (即 160mM NaCl，以下使用的 IX Bind/Wash Buffer 都为 160mM NaCl)。
[0034] 2)用枪以轻柔的上下吸打的方法混匀Dynabeads
[0035] 3)按 1 μ gDNA/10 μ 1 Beads 的比例加混匀后DyiiabeadsiR:到 1. 5ml 离心管中。
[0036] 4)在第三步中加入IX Bind/Wash Buffer使其总体积达到100 μ 1，上下吸打混 匀。
[0037] 5)将离心管放在磁力架上lmin，当所有Beads吸附在管壁上时，弃上清。
[0038] 6)将离心管从磁力架上拿下来，加入100 μ 11X Bind/Wash Buffer,上下吸打混 匀。
[0039] 7)重复5-6步至少一次，此混合液将用于下一步骤中生物素标记的甲基结合蛋白 (MBD-Bi〇tin 蛋白）与Dynabeads'-κ++交联。
[0040] ι· 2MBD-Bi〇tin 蛋白与Dynabeads?交联作用
[0041] 1)按1μ g DNA/7y 1(3. 5μ g)MBD-Biotin蛋白的比例，将MBD-Biotin蛋白力口入新 的1. 5ml离心管。
[0042] 2)在1. 5ml离心管加入IX Bind/Wash Buffer使其总体积达到200 μ 1，上下吸打 混匀。
[0043] 3)将稀释的MBD-Biotin蛋白加入前面第七步活化好的Dynabcads '中，上下吸 打混匀。
[0044] 4)室温条件下，混合物在血液混匀器上轻柔转动lh。
[0045] 1. 3MBD_Beads 的洗脱
[0046] 1)室温混合lh后，将离心管放置于磁力架Imin，当所有Dynabeads?吸附在管壁 上时，弃上清。
[0047] 2)将离心管取出磁力架，加100 μ 11X Bind/Wash Buffer,用枪吸打混勻。
[0048] 3)室温条件下，在血液混匀器上轻柔转动5min。
[0049] 4)重复1-3步至少两次。
[0050] 5)将离心管放置于磁力架lmin，然后弃上清。
[0051] 6)将离心管取出磁力架，加100 μ llXBind/Wash Buffer,上下吸打混勻，用于下面 的实验。
[0052] 2. MBD-Beads与片段化DNA的孵化
[0053] 1)在新的 1. 5ml 离心管加入 100 μ 15X Bind/Wash Buffer。
[0054] 2)将片段化DNAOl-ΙΟμ g，浓度=25ng/y 1)到上步的离心管中（总体积可能会 有 40-400 μ 1)。
[0055] 3)加无酶的水，使其总体积达到500 μ 1。
[0056] 4)将DNA和Buffer的混合物转移到前面第6步中包含有MBD-Beads离心管中，上 下吸打混匀。
[0057] 5)室温条件下，混合物在血液混匀器上轻柔转动lh。
[0058] 3.去除非甲基化 DNA (Non-Captured DNA)
[0059] 准备 2〇OmM 的 Elution Buffer，用 High-Salt Elution Buffer (即 2〇OOmM NaCl): Low-Salt Elution Buffer (不含 NaCl) = 1 :9 混合。
[0060] 1)将装有孵化好的MBD-Beads与片段化DNA混合物离心管放置在磁力架上lmin， 当所有Dynabeads 1"吸附在管壁上时，弃上清。
[0061] 2)将离心管从磁力架上取下，加入200μ 1的160mM NaCl，上下吸打混匀。
[0062] 3)室温条件下，离心管在血液混匀器上轻柔转动3min。
[0063] 4)将离心管放置在磁力架上lmin，当所有Beads吸附在管壁上时，弃上清。
[0064] 5)重复3-5步三次。
[0065] 6)将离心管从磁力架上取下，加入200 μ 1200mM NaCl，上下吸打混匀。
[0066] 7)室温条件下，离心管在血液混匀器上轻柔转动3min。
[0067] 8)将离心管放置在磁力架上lmin，当所有Beads吸附在管壁上时弃上清。
[0068] 9)重复7-9步两次。
[0069] 注意：洗脱时MBD-Beads不能干燥
[0070] 4.甲基化 DNA (Captured DNA)洗脱
[0071] 1)洗脱 Non-Captured DNA 后，加入 400 μ 1 HighSalt Elution Buffer (2000mMNaCl)，上下吸打混匀。
[0072] 2)室温条件下，将离心管放在血液混匀器上轻柔转动3min。
[0073] 3)将离心管放置在磁力架上lmin，当所有Beads吸附在管壁上时，将上清转入一 个干净的1. 5ml的离心管中。
[0074] 4)重复步1-3步两次。
[0075] 这样能确保95%的DNA能被洗脱下来。
[0076] 5.乙醇沉淀
[0077] 1)将收集到的1. 2ml的洗脱液，分装到两个新的1. 5ml干净的离心管中，每管。
[0078] 2)在每管中加入 1 μ 1 糖原（Glycogen) (20 μ g/ μ 1), 1/10 体积 of3M NaAc，2 倍体 积 100% 乙醇 ethanol。
[0079] 3)混匀后放置于_80°C，2h。
[0080] 4)4°C或者室温条件下，彡12, OOOXg离心15min
[0081] 5)弃上清。
[0082] 6)加入500 μ 1冷的70 %的乙醇
[0083] 7)4°C或者室温条件下，彡12, 000Xg离心5min
[0084] 8)弃上清
[0085] 9)重复 6-8 步
[0086] 10)在室温下干燥?5min，（注意：不要太干燥）
[0087] 11)加入25 μ 1 TE buffer洗脱。将两管溶液合并成一管。
[0088] 洗脱液可储存在_20°C。
[0089] 实施例2甲基化DNA富集效果验证实验：
[0090] 采用下述PCR的方法定性洗脱部分中甲基化DNA和非甲基化DNA所占比例：
[0091] 首先将1 μ g已片段化的K-562DNA与试剂盒提供的长度为80bp的甲基化与非甲 基化双链DNA (各10pg)混合，用实施例1所述的方法对其进行甲基化DNA富集，收集分别 用浓度为 160mM，200mM，350mM，450mM，600mM，lOOOmM，1500mM 和 2000mM 的 NaCl 洗脱下来的 DNA部分。
[0092] 然后分别以富集到的几个DNA部分为模板，用试剂盒提供的与甲基化双链DNA 相应的引物（Forward Primer for Methylated DNA Control 和 Reverse Primer for Methylated DNA Control)以及与非甲基化 DNA 相应的引物（Forward Primer for Non-Methylated Control 和 Reverse Primer for Non-Methylated Control)进行扩增。
[0093] PCR体系如下：
[0094]
[0095]
【权利要求】
1. 一种应用于甲基结合蛋白测序中的甲基化DNA富集方法，采用甲基化DNA富集试剂 盒进行，其特征在于，包含下述步骤： (1) 磁珠的活化与甲基结合蛋白交联反应 将磁珠进行活化，然后使生物素标记的甲基结合蛋白与活化后的磁珠发生交联反应， 得到甲基结合蛋白-磁珠复合物； (2) 甲基结合蛋白-磁珠复合物与片段化DNA的孵化 将片段化DNA加入上述步骤（1)得到的甲基结合蛋白-磁珠复合物中，进行孵化，使甲 基化DNA与复合物进行特异性地结合； (3) 去除非甲基化DNA 对上述步骤（2)中经孵化的片段化DNA与甲基结合蛋白-磁珠复合物的混合物，用 160mM NaCl将磁珠洗脱4遍，再用200mM NaCl洗脱3遍，除去非甲基化DNA ; (4) 甲基化DNA洗脱 对上述步骤（3)中得到的去除了非甲基化DNA的混合物，使用2000mMNaCl对磁珠进行 洗脱，得到甲基化DNA组份； (5) 乙醇沉淀 采用乙醇沉淀法对上述步骤（4)中洗脱得到的甲基化DNA组份进行沉淀，干燥后以TE 缓冲液溶解，即得到富集的甲基化DNA。
2. 根据权利要求1所述的甲基化DNA富集方法，其特征在于，所述步骤（1)中进行磁珠 的活化时，在DNA样本中加入磁珠的量为1 μ g DNA/10 μ 1磁珠。
3. 根据权利要求1所述的甲基化DNA富集方法，其特征在于，所述步骤（1)中使生物素 标记的甲基结合蛋白与活化后的磁珠发生交联反应时，所使用的生物素标记的甲基结合蛋 白的量为1 μ gDNA/7 μ 1生物素标记的甲基结合蛋白。
4. 根据权利要求1所述的甲基化DNA富集方法，其特征在于，所述步骤（2)中使片段化 DNA与甲基结合蛋白-磁珠复合物进行孵化时，在室温下进行孵化。
5. 根据权利要求1所述的甲基化DNA富集方法，其特征在于，所述步骤（2)中使片段化 DNA与甲基结合蛋白-磁珠复合物进行孵化时，孵化时间为1小时。
6. 根据权利要求1所述的甲基化DNA富集方法，其特征在于，所述步骤（3)中以200mM NaCl洗脱时，每次加入200mM NaCl的量为200微升。
7. 根据权利要求1所述的甲基化DNA富集方法，其特征在于，所述步骤⑷中以用 2000mM的NaCl洗脱3遍。
8. 根据权利要求1所述的甲基化DNA富集方法，其特征在于，所述步骤（5)中，乙醇沉 淀法中所使用的乙醇的体积浓度为70 %。
9. 根据权利要求1所述的甲基化DNA富集方法，其特征在于，所述步骤（5)中的干燥在 室温下进行。
10. 根据权利要求1所述的甲基化DNA富集方法，其特征在于，所述步骤（5)中的干燥 时间小于5分钟。
【文档编号】C12N15/10GK104152437SQ201410394587
【公开日】2014年11月19日 申请日期:2014年8月12日 优先权日:2014年8月12日
【发明者】孙子奎, 高文学, 丁方美, 王 锋, 唐嘉婕 申请人:上海派森诺生物科技有限公司