专利名称：一种结合solid测序和单细胞rt-pcr的人抗体可变区获取方法
技术领域：
本发明涉及人类特异性抗体可变区序列获取技术领域，特别涉及一种结合SOLID测序和单细胞RT-PCR的人抗体可变区获取方法。
背景技术：
从2002年的SARS大规模爆发，到2008年EV71病毒引发的手足口病，再到2009年墨西哥甲型HlNl流感病毒引发的全球流感大流行，一旦爆发它们就很快在大范围内或全球蔓延。常规的抗病毒药物开发是一个漫长的过程，无法在短时间内满足需要。而且，这些感染病菌的变异之快，使得我们在短时间内找到行之有效的防控办法变得越来越困难。对于这类病原体引发的爆发性、流行性疾病，非常迫切需要在很短时间内找到有效的预防和治疗方法。抗体治疗已成为多种疾病特异性治疗的新型手段和发展方向。尤其是全人源化单克隆抗体与人体结合性最好，也是最安全和有效的单克隆抗体，必将代表未来抗体治疗的发展方向。目前获得全人源化抗体方法有抗体库筛选技术、基因工程小鼠制备全人抗体、转染色体牛。抗体库筛选技术主要包括噬菌体抗体库和核糖体展示技术。噬菌体抗体库技术从免疫或未被免疫的B细胞中分离抗体可变区基因；PCR扩增抗体全套基因片段(如VH、VL)，将体外扩增的VH、VL基因片段随机克隆入相应载体，形成组合文库；将基因组合文库插入噬菌体编码膜蛋白的基因III (g3)或基因VIII (g8)的先导系列下游，使外源基因表达的多肽以融合蛋白的形式展示在外壳蛋白gp III或gp VIII的N端。用固相化抗原经“亲和结合-洗脱-扩增”数个循环筛选出表达特异性好、亲和力强的抗体噬菌体库。核糖体展示技术将基因型和表型联系在一起，编码蛋白的DNA在体外进行转录与翻译，由于对DNA进行了特殊的加工与修饰，如去掉3'末端终止密码子，核糖体翻译到mRNA末端时，由于缺乏终止密码子，停留在mRNA的3 '末端不脱离，从而形成蛋白质-核糖-2mRNA三聚体，将目标蛋白特异性的配基固相化，如固定在ELISA微孔或磁珠表面，含有目标蛋白的核糖体三聚体就可在ELISA板孔中或磁珠上被筛选出，对筛选分离得到的复合物进行分解，释放出的mRNA进行逆转录酶链聚合反应(RT-PCR)，PCR产物进入下一轮循环，经过多次循环，使目标蛋白和其编码的基因序列得到富集和分离。上述全人源化抗体技术中，制备和生产流程复杂，需要时间和周期漫长，无法适用于某些突发、流行性疾病的抗体药物的研发和生产，且对某些病原体或抗原快速变异方面显得无能为力。人源化抗体最关键的技术在于特异抗体可变区基因序列的扩增。由于每个抗原有很多抗原决定簇，机体免疫系统会针对不同的抗原决定簇产生不同的抗体，而且根据抗原决定簇的不同，所产生抗体与抗原的结合能力和抗体的效价也不相同。因此，要从成千上万的抗体中将效价高，结合能力强的特异抗体的可变区基因挑选出来，传统方法的工作量可想而知。
发明内容
为了克服现有技术存在的不足，本发明提供一种结合SOLID测序和单细胞RT-PCR的人抗体可变区获取方法，旨在结合传统的RT-PCR技术和高效的SOLID测序技术快速获得人类抗体可变区序列。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种结合SOLID测序和单细胞RT-PCR的人抗体可变区获取方法，其具体步骤如下(I)从特异免疫力供体获取抗凝外周血；
(2)分离外周血单核细胞(PBMCs)；(3)以CDT和CD19+为gate对PBMCs进行初次分选；(4)以CD27high和CD38high为gate对初次分选的细胞再次分选；(5)获取具有抗体分泌功能的浆细胞，并稀释成单细胞；(6)裂解单细胞并进行反转录获得单细胞cDNA序列；(7) IgG/M特异引物PCR扩增；(8) Barcoded Primers 测序引物 PCR 扩增；(9) SOLID芯片测序，生物信息学分析，获得抗体可变区基因序列。本发明带来的有益效果是提供了一个良好的技术平台，可广泛用于获取多种传染性/感染性、肿瘤性疾病、自身免疫性疾病中特异性抗体的重链和轻链可变区序列。特别是针对某些突发、重大流行性疾病，如SARS、禽流感等疾病时，该技术更能体现出其快速，高效的优势。此外，本发明也为全人源化抗体药物的生产提供了一个有效手段。
图I为人类抗体可变区扩增图
具体实施例方式下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。本发明的具体实施例为从具有特异免疫力的供体中获取抗凝外周血，分离外周血单核细胞(PBMCs)，首先以⑶3_、⑶19+为gate用流式细胞仪分选活的PBMCs，然后以CD27high、CD38high为gate对初次分选的细胞进行再分选，最终获得具有抗体分泌功能的浆细胞。将获得的浆细胞稀释成单个细胞，然后，经细胞裂解液裂解，将单细胞mRNA进行一次反转录，获得cDNA序列，然后用我们设计的IgG/M特异引物群进行一次PCR扩增，以扩增的产物作为模板，再用SOLID测序引物(Barcoded Primers)进行一次PCR。该引物能同时携带96个不同标记，即一次可以做96个不同细胞。最后我们取这些带有标记的扩增产物作为模板，进行SOLID测序。这里的测序芯片可以分为单分区芯片，4分区芯片和8分区芯片，每个分区最多可以测序96个细胞，8分区芯片一次可以测序768个细胞。最后将测序的结果进行生物信息学分析，即可获得如图I所示的人类抗体可变区基因序列。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式
，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本领域的技术人员在本发明所揭露的技术范围内，可不经过创造性劳动想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求书所限 定的保护范围为准。
权利要求
1.一种结合SOLID测序和单细胞RT-PCR的人抗体可变区获取方法，其特征在于，所述方法步骤如下 (1)从特异免疫力供体获取抗凝外周血； (2)分离外周血单核细胞(PBMCs)； (3)以CD3_和CD19+为gate对PBMCs进行初次分选； (4)以⑶27high和⑶38high为gate对初次分选的细胞再次分选； (5)获取具有抗体分泌功能的浆细胞，并稀释成单细胞； (6)裂解单细胞并进行反转录获得单细胞cDNA序列； (7)IgG/M特异引物PCR扩增； (8)Barcode Primer 测序引物 PCR 扩增； (9)SOLID芯片测序，生物信息学分析，获得抗体可变区基因序列。
全文摘要
本发明提供一种结合SOLID测序和单细胞RT-PCR的人抗体可变区获取方法。通过细胞表面分子标记筛选表达特异抗体的单细胞，将单细胞mRNA进行一次反转录，获得cDNA序列，然后用我们设计的IgG/M特异引物群进行一次PCR扩增，以扩增的产物作为模板，再用SOLID测序引物(Barcoded Primers)进行一次PCR。最后取Barcoded Primers扩增产物作为模板，进行SOLID测序，测序的结果进行生物信息学分析，即可获得人类抗体可变区基因序列。本发明可广泛用于获取多种疾病中特异性抗体的重链和轻链可变区序列，其快速，高效的优势为全人源化抗体药物的生产提供了一个有效手段。
文档编号C12N15/10GK102787118SQ20111012429
公开日2012年11月21日 申请日期2011年5月16日 优先权日2011年5月16日
发明者史占平, 孙毅, 曾桥, 梁爱斌 申请人:史占平, 孙毅, 曾桥, 梁爱斌