专利名称：家蚕中部丝腺细胞合成分泌溶菌酶的方法
技术领域：
本发明涉及利用转基因技术构建一种家蚕中部丝腺细胞合成分泌溶菌酶的方法。
背景技术：
溶菌酶(Lysozyme)又称为胞壁质酶，分子由1 个氨基酸组成，分子量约1 5 KDa，等电点约10.8。溶菌酶广泛存在于家禽和鸟类的蛋清中，存在于哺乳动物的眼泪、唾液、心、肺、肝、肾等液体及器官中，存在于大麦、芜青、无花果等植物中。其中以蛋清中的含量最高，约含0. 3%，而人乳、眼泪、唾液中的活性最高，高于蛋清中的酶活性3倍。溶菌酶是一种专门作用于微生物细胞壁的水解酶，它破坏微生物细胞壁，引起细菌裂解，具有防腐和杀菌作用。而人和动物细胞无细胞壁结构，故溶菌酶对人和动物细胞无毒性作用，被广泛用于医疗、食品、畜牧和生物工程等领域。如医学上利用溶菌酶抗炎、 消肿，增强免疫力。食品上利用溶菌酶作为保健食品添加剂，用于水产类熟制品、肉类制品的防腐和保鲜。在畜牧上用作饲料防腐剂和杀菌剂，用于家畜防治胃肠炎、消化不良等疾病。科学研究中，利用溶菌酶分解细胞壁后制备原生质体，用于微生物育种，用于细胞融合操作。溶菌酶价格很高，平均每公斤约2万元。目前溶菌酶的生产主要是从生物组织中提取，提取的方法主要有直接结晶法、离子交换层析法、亲和层析法、超滤法、膜色谱技术 (亲和膜色谱，离子交换膜色谱)法、反胶团苹取法、扩张床吸附法等。生产工艺复杂，成本高，效益低。随着生物技术的发展，利用基因工程技术生产溶菌酶是高效率、低成本的生产方法。转基因家蚕中部丝腺生物反应器是在家蚕中部丝腺中表达外源基因的转基因动物表达系统。家蚕生长周期短，50天左右可完成一个世代，每个雌蛾可产卵约400粒；家蚕经过长达四千多年的人工驯养、选育，性情温顺，已完成丧失飞翔逃逸能力，而在丝蛋白合成、分泌方面具有非常强的能力；合成的蛋白可以随蚕丝蛋白一起分泌到体外，蚕丝蛋白主要由3种丝素蛋白和3种丝胶蛋白构成，成分简单。所以，转基因家蚕丝腺生物反应器构建容易，运行安全，表达外源蛋白效率高，外源蛋白多具有生物活性，蛋白纯化方便，只需要通过饲养转基因家蚕，就可以非常方便地维持表达系统的延续，是一种非常有价值的表达系统，具有广阔的实用前景。
发明内容
本发明的目的在于提供一种家蚕中部丝腺细胞合成分泌溶菌酶的方法，利用转基因家蚕技术将溶菌酶基因导入家蚕基因组内，并在家蚕中部丝腺细胞中特异表达，开发出合成分泌溶菌酶的家蚕。为了达到上述目的，本发明采用的技术方案的步骤如下
(1)采用分子生物学技术构建家蚕合成分泌溶菌酶的载体pBSerlhLYZ-A3EGFP质粒。(2)采用显微注射转基因家蚕方法将pBSerlhLYZ_A3EGFP质粒及能够提供转座酶trans的辅助质粒导入家蚕受精卵内，蚕卵孵化后饲养至成虫，自交续代为Gl代，在Gl代转基因家蚕的小蚕期，通过荧光体视显微镜观察选择表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫与丝胶蚕杂交续代为G2代，G2代以后再与丝胶蚕回交3-5代，以表达EGFP标志基因及丝胶蚕性状为每代的留种筛选标志。(3)与丝胶蚕多次回交后的蚕，再采用自交的方法使溶菌酶基因纯合，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法选择溶菌酶基因纯合的转基因家蚕，育成中部丝腺细胞能够合成分泌溶菌酶、基因纯合的转基因家蚕新品种。所述的pBSerlhLYZ-A3EGFP质粒是以piggyBac转座质粒为基础，质粒带有Amp抗性基因以用于质粒的扩增和筛选，包含piggyBac转座子的2个转座臂PBL 和PBR，包含2个功能表达框，一个是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框A3 Promoter+EGFP+SV40,以用作转基因阳性家蚕的筛选标志，另一个是家蚕丝胶蛋白1 启动子、带有便于提纯外源蛋白的His接头以及溶菌酶基因的表达框％1~1 Promoter +His+hLYZ+SV40,以表达溶菌酶，辅助质粒包含Amp抗性基因、piggyBac转座子的1个转座臂PBR、A3启动子启动的转座酶trans基因表达框A3 Promoter+ trans,以提供转座酶。所述的以丝胶蚕性状为每代的留种筛选标志，其筛选的时期是蚕茧时期。本发明具有的有益效果是
本发明借助荧光标志基因筛选转基因家蚕，这种转基因家蚕能够在家蚕中部丝腺细胞特异地合成分泌溶菌酶，为提高溶菌酶的生产效率，降低生产成本奠定基础。培育成功的生产溶菌酶的家蚕新品种，可以提高蚕农养蚕经济效益，改善溶菌酶生产工艺，简化提纯方法，提高生产溶菌酶企业的经济效益。溶菌酶产量的提高和成本的降低，有利于溶菌酶的大量使用，进一步提高医疗、食品、畜牧和生物工程等领域的经济效益。
图1是家蚕中部丝腺细胞合成分泌溶菌酶的pBSerlhLYZ_A3EGFP载体结构图。图2是能够提供转座酶的辅助质粒结构图。
具体实施例方式下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明。实施例1
将pBSerlhLYZ-A3EGFP质粒(图1)及能够提供转座酶的辅助质粒(图2)按5:1比率混合，2种质粒的总浓度为0. 3μβ/μ1，质粒溶解在0. ImM含有4mM氯化钠的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后8小时以内的受精卵内，导入总体积为30nl。将显微注射的蚕卵在23°C，75%湿度，他光照条件下饲养至成虫，自交续代(Gl代)。在转基因实验的Gl代小蚕期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获取表达EGFP标志基因的转基因家蚕1蛾，荧光显微镜的激发波长为460nm 490nm，发射波长为510 nm 550 nm。将蚕饲养至成虫与丝胶蚕杂交产卵续代(G2)。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在小蚕期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，选择蚕茧特性为丝胶的个体与丝胶蚕回交续代，经回交5代选择留种，在每代的小蚕期，通过荧光体视显微镜观察选留表达EGFP标志基因的转基因家蚕，在蚕茧时期选留蚕茧特性为丝胶的个体。与丝胶蚕回交5代后的蚕，再采用自交的方法使溶菌酶基因纯合，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法选择溶菌酶基因纯合的转基因家蚕，育成中部丝腺细胞能够合成分泌溶菌酶、且溶菌酶含量占丝蛋白含量较高比例的基因纯合的转基因家蚕新品种。采用温水对蚕茧进行溶解，获得家蚕中部丝腺细胞特异性合成分泌溶菌酶的转基因家蚕新品种的丝胶蛋白溶液，以同样方法获得的非转基因家蚕品种的丝胶为对照，比较对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，抑菌率提高17. 05%。实施例2:
将pBkrlhLYZ-A3EGFP质粒(图1)及能够提供转座酶的辅助质粒(图2)按1:1比率混合，2种质粒的总浓度为 μβ/μ1，质粒溶解在2mM含有ImM氯化钠的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后6小时以内的受精卵内，导入总体积为5nl。将显微注射的蚕卵在^°C，90%湿度，1 光照条件下饲养至成虫，转基因家蚕自交续代(Gl代)。在转基因实验的Gl代小蚕期，通过荧光显微镜(Olympus，SZX12，日本)观察获得表达EGFP标志基因的转基因家蚕1蛾，荧光显微镜的激发波长为460歷 490匪，发射波长为510 nm 550 nm。将蚕饲养至成虫与丝胶蚕杂交产卵续代(G2)。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在小蚕期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，选择蚕茧特性为丝胶的个体与丝胶蚕回交续代，经回交3代选择留种，在每代的小蚕期，通过荧光体视显微镜观察选留表达EGFP标志基因的转基因家蚕，在蚕茧时期选留蚕茧特性为丝胶的个体。与丝胶蚕回交3代后的蚕，再采用自交的方法使溶菌酶基因纯合，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法选择溶菌酶基因纯合的转基因家蚕，育成中部丝腺细胞能够合成分泌溶菌酶、且溶菌酶含量占丝蛋白含量较高比例的基因纯合的转基因家蚕新品种。采用温水对蚕茧进行溶解，获得家蚕中部丝腺细胞特异性合成分泌溶菌酶的转基因家蚕新品种的丝胶蛋白溶液，以同样方法获得的非转基因家蚕品种的丝胶为对照，比较对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，抑菌率提高16. 46%。实施例3
将pBkrlhLYZ-A3EGFP质粒(图1)及能够提供转座酶的辅助质粒(图2)按2 1比率混合，2种质粒的总浓度为0. 5μβ/μ1，质粒溶解在ImM含有2mM氯化钠的磷酸缓冲液中，然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后4小时以内的受精卵内，导入总体积为15nl。将显微注射的蚕卵在25°C，80%湿度，1 光照条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕交配续代(Gl 代)。在转基因实验的Gl代小蚕期，通过荧光显微镜(Olympus JZX12，日本)观察获得表达 EGFP标志基因的转基因家蚕1蛾，荧光显微镜的激发波长为460nm 490nm，发射波长为 510 nm 550 nm。将蚕饲养至成虫与丝胶蚕杂交产卵续代(G2)。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在小蚕期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，选择蚕茧特性为丝胶的个体与丝胶蚕回交续代，经回交4代选择留种， 在每代的小蚕期，通过荧光体视显微镜观察选留表达EGFP标志基因的转基因家蚕，在蚕茧时期选留蚕茧特性为丝胶的个体。与丝胶蚕回交4代后的蚕，再采用自交的方法使溶菌酶基因纯合，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法选择溶菌酶基因纯合的转基因家蚕，育成中部丝腺细胞能够合成分泌溶菌酶、且溶菌酶含量占丝蛋白含量较高比例
5的基因纯合的转基因家蚕新品种。采用温水对蚕茧进行溶解，获得家蚕中部丝腺细胞特异性合成分泌溶菌酶的转基因家蚕新品种的丝胶蛋白溶液，以同样方法获得的非转基因家蚕品种的丝胶为对照，比较对金黄色葡萄球菌的抑菌效果，抑菌率提高15. 92%。实施例4
将pBSerlhLYZ-A3EGFP质粒(图1)及能够提供转座酶的辅助质粒(图2)按3:1比率混合，2种质粒的总浓度为0. 6μβ/μ1，质粒溶解在1. 5mM含有2. 5mM氯化钠的磷酸缓冲液中， 然后采用显微注射方法导入家蚕产卵后5小时以内的受精卵内，导入总体积为20nl。将显微注射的蚕卵在，75%湿度，12h光照条件下饲养至成虫，与非转基因家蚕交配续代(Gl 代)。在转基因实验的Gl代小蚕期，通过荧光显微镜(Olympus JZX12，日本)观察获得表达 EGFP标志基因的转基因家蚕2蛾，荧光显微镜的激发波长为460nm 490nm，发射波长为 510 nm 550 nm。将蚕饲养至成虫与丝胶蚕杂交产卵续代(G2)。自第G2代以后的转基因家蚕均采用单蛾育，在小蚕期通过荧光体视显微镜观察，挑选表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫，选择蚕茧特性为丝胶的个体与丝胶蚕回交续代，经回交4代选择留种， 在每代的小蚕期，通过荧光体视显微镜观察选留表达EGFP标志基因的转基因家蚕，在蚕茧时期选留蚕茧特性为丝胶的个体。与丝胶蚕回交4代后的蚕，再采用自交的方法使溶菌酶基因纯合，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法选择溶菌酶基因纯合的转基因家蚕，育成中部丝腺细胞能够合成分泌溶菌酶、且溶菌酶含量占丝蛋白含量较高比例的基因纯合的转基因家蚕新品种。采用温水对蚕茧进行溶解，获得家蚕中部丝腺细胞特异性合成分泌溶菌酶的转基因家蚕新品种的丝胶蛋白溶液，以同样方法获得的非转基因家蚕品种的丝胶为对照，比较对大肠杆菌的抑菌效果，2个品种中部丝腺腺腔内溶物抑菌率分别提高9. 35%和8. 41%，丝胶抑菌率分别提高11. 68 %和10. 79%。
权利要求
1.一种家蚕中部丝腺细胞合成分泌溶菌酶的方法，其特征在于该方法的步骤如下(1)采用分子生物学技术构建家蚕合成分泌溶菌酶的载体pBkrlhLYZ-A3EGFP质粒；(2)采用显微注射转基因家蚕方法将pBkrlhLYZ-A3EGFP质粒及能够提供转座酶 trans的辅助质粒导入家蚕受精卵内，蚕卵孵化后饲养至成虫，自交续代为Gl代，在Gl代转基因家蚕的小蚕期，通过荧光体视显微镜观察选择表达EGFP标志基因的转基因家蚕，饲养至成虫与丝胶蚕杂交续代为G2代，G2代以后再与丝胶蚕回交3-5代，以表达EGFP标志基因及丝胶蚕性状为每代的留种筛选标志；(3)与丝胶蚕多次回交后的蚕，再采用自交的方法使溶菌酶基因纯合，采用转基因昆虫荧光基因表达相对量无损伤测定方法选择溶菌酶基因纯合的转基因家蚕，育成中部丝腺细胞能够合成分泌溶菌酶、基因纯合的转基因家蚕新品种。
2.根据权利要求1所述的一种家蚕中部丝腺细胞合成分泌溶菌酶的方法，其特征在于所述的pBSerlhLYZ-A3EGFP质粒是以piggyBac转座质粒为基础，质粒带有Amp抗性基因以用于质粒的扩增和筛选，包含PiggyBac转座子的2个转座臂PBL和PBR，包含2个功能表达框，一个是A3启动子启动的绿色荧光蛋白基因表达框A3 Promoter+EGFP+SV40,以用作转基因阳性家蚕的筛选标志，另一个是家蚕丝胶蛋白1启动子、带有便于提纯外源蛋白的His接头以及溶菌酶基因的表达框^51~1 Promoter +His吒LYZ+SV40，以表达溶菌酶， 辅助质粒包含Amp抗性基因、piggyBac转座子的1个转座臂PBR、A3启动子启动的转座酶 trans基因表达框A3 Promoter+ trans，以提供转座酶。
3.根据权利要求1所述的一种家蚕中部丝腺细胞合成分泌溶菌酶的方法，其特征在于所述的以丝胶蚕性状为每代的留种筛选标志，其筛选的时期是蚕茧时期。
全文摘要
本发明公开了一种家蚕中部丝腺细胞合成分泌溶菌酶的方法。是先构建家蚕合成分泌溶菌酶的载体pBSer1hLYZ-A3EGFP质粒，再利用显微注射转基因家蚕技术将这种质粒与能够提供转座酶的辅助质粒一起导入到家蚕受精卵内，依靠piggyBac转座子的转座特性，使绿色荧光蛋白基因和溶菌酶基因导入到家蚕基因组内，并得到稳定遗传和表达，从而创制成一种能够在家蚕中部丝腺细胞特异性合成分泌溶菌酶的转基因家蚕，并进一步将这种转基因家蚕与丝胶蚕杂交，将杂交后代再与丝胶蚕回交3-5代，最后再自交使溶菌酶基因纯合，育成分泌溶菌酶的转基因家蚕新品种，为提高溶菌酶的生产效率、降低生产成本奠定基础。
文档编号C12N15/85GK102226202SQ20111012358
公开日2011年10月26日 申请日期2011年5月13日 优先权日2011年5月13日
发明者危浩, 庄兰芳, 钟伯雄 申请人:浙江大学