一种淡水珍珠蚌噬菌体型溶菌酶重组蛋白的制备方法
【专利说明】
[0001]
技术领域
[0002] 本发明涉及生物技术领域，具体为一种淡水珍珠蚌噬菌体型溶菌酶重组蛋白的制 备方法。
【背景技术】
[0003] 三角帆鮮（办俗称河鮮、珍珠鮮、淡水珍珠鮮等，为淡水双壳类 软体动物，是我国传统的养殖贝类，属于广温、广盐的一种贝类。和其他的无脊椎动物相同， 三角帆蚌不具有与脊椎动物相类似的"获得性免疫"机制，而是主要依靠非特异性免疫来抵 抗各种外界病原的入侵，以此来维持生物体正常的生命活动。溶菌酶为先天免疫中体液免 疫的重要参与因子，本发明从分子水平对三角帆蚌噬菌体型溶菌酶基因进行了的研宄，也 是首次报道在淡水贝类生物体内存在噬菌体型溶菌酶。通过对珍珠蚌的噬菌体型溶菌酶的 深入的研宄，可以为探索其抗病机制和研宄新型的抗菌药，对珍珠蚌养殖的可持续性发展 和生态健康都是很有意义的。
[0004] 溶菌酶具有独特的作用机制和广泛的抗菌作用，在临床上具有多种重要的应用价 值。溶菌酶等天然、安全的抗菌物质也越来越广泛的应用于畜禽及水产动物饲料中。随着 对水产动物免疫机制不断深入的研宄、生物技术日以迅猛的发展以及国内外市场对水产品 食用安全要求的步步提高，将重组溶菌酶作为绿色药物应用到水产养殖中并培育转溶菌酶 基因品种，或将成为实现水产动物健康养殖的一条新途径。
[0005] 金属螯合亲和层析是一种有效的生物分子分离纯化技术，它具有配基简单、吸附 量大、分离条件温和、通用强等特点。影响蛋白纯化效果有很多，但其中洗脱条件是主要因 素，包括洗脱液PH、组成及离子强度，这需要针对不同的蛋白进行实验分析。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种快速获得表达量较高的淡水珍珠蚌噬菌体型溶菌酶重 组蛋白的制备方法。
[0007] 淡水珍珠蚌噬菌体型溶菌酶重组蛋白的技术方案是利用设计的含有酶切位点 引物将噬菌体型溶菌酶基因进行PCR扩增，并通过酶切、转化、筛选构建原核表达载体 pET-30a(+)-LYZPh ;再将原核表达载体pET-30a(+)-LYZPh转化至大肠杆菌BL21 (DE3)并用 IPTG进行目的基因的诱导表达，获得含溶菌酶重组蛋白的菌液。
[0008] 本发明所述步骤如下： (1) 设计含有酶切位点引物； (2) 利用设计的含有酶切位点引物将噬菌体型溶菌酶基因进行PCR扩增，并通过酶切、 转化、筛选构建原核表达载体pET-30a (+) -LYZPh ; (3) 再将原核表达载体pET-30a(+)-LYZPh转化至大肠杆菌BL21(DE3)并用IPTG进行 目的基因的诱导表达，获得含溶菌酶重组蛋白的菌液； (4)通过镍离子亲和柱层析对上述菌液进行纯化，用聚乙二醇8000对重组蛋白进行浓 缩后用15%SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的纯化效果； 所述的酶切位点引物包括上游引物：GTGTGAATTCATGGCTGCATCTTCAAACTCA和下游引 CACACTCGAGTCAATCAGCCAAGTTTCTTATTCTCG，上游引物序列中 GAATTC 片段为 EcoRI 酶切位 点；下游引物序列中CTCGAG片段为XhoI酶切位点； 本发明的有益效果：获得的噬菌体型溶菌酶重组蛋白效价高，达到0. 9mg/ml以上，可 以满足噬菌体型溶菌酶蛋白的相关测定，弥补了淡水珍珠蚌类噬菌体型溶菌酶蛋白的研宄 空白，可为研宄噬菌体型溶菌酶蛋白和相关溶菌酶产品开发提供材料。
【附图说明】
[0009] 图1为三角帆蚌噬菌体型溶菌酶蛋白的扩增结果示意图，图中M:DL2000 marker, I: PCR 产物； 图2为SDS-PAGE鉴定三角帆蚌噬菌体型溶菌酶重组质粒在E. coli BL21中的 表达，图中 M:Premixed Protein marker(Low)，l :BL21/pET_30a(+)-LYZPh 诱导 Oh， 2:BL21/pET-30a(+)-LYZPh 诱导 2h，3:BL21/pET-30a(+)-LYZPh 诱导 4h，4:BL21/ pET-30a (+) -LYZPh 诱导 6h，5 :BL21/pET-30a (+) -LYZPh 诱导 8h，6 :pET-30a (+) -LYZPhl 诱 导后重组质粒的超声上清、7 :pET-30a(+)-LYZPhl诱导后重组质粒的超声沉淀； 图3为三角帆蚌噬菌体型溶菌酶蛋白纯化结果示意图，图中M :Premixed Protein marker(Low)，l :纯化后重组蛋白； 图4三角帆蚌噬菌体型溶菌酶氨基酸序列的多序列比对，图中三角形标记为保守的活 性位点； 图5为三角帆蚌噬菌体型溶菌酶重组蛋白浓度测定结果； 注：根据实验中记录的吸光值得到的BSA标准曲线方程y=0. 0166x-0. 0128，根据测定 得到的样品0D595值计算蛋白含量，按照公式：蛋白的浓度=蛋白含量/所加的样品体积计 算出重组蛋白浓度为〇· 917mg/ml。
【具体实施方式】
[0010] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发 明保护的范围。
[0011] 一种淡水珍珠蚌噬菌体型溶菌酶重组蛋白的实验制备如下： (DcDNA提取：选取健康的三角帆蚌，在水族箱中持续充氧暂养1周。从三角帆蚌血淋 巴中提取总RNA，反转录成cDNA。
[0012] (2)引物设计：根据本实验室之前获得的三角帆蚌噬菌体溶菌酶（以下 简称：CpLYZPh) cDNA的部分全长，通过Prime 5. 0软件设计表达引物：上游引物 GTGTGAATTCATGGCTGCATCTTCAAACTCA，下划线所标为 EcoRI 酶切位点；下游引物 CACACTCGA CTCAATCAGCCAAGTTTCTTATTCTCG，下划线所标为XhoI酶切位点，该引物的退火温度为58°C。
[0013] (3) CpLYZPh基因的克隆：按照反转录试剂盒操作程序进行反转录，CpLYZPh基 因的PCR扩增，以SMART cDNA为模板，扩增体系为（25 μ L) :dH2018. 4 μ 1，IOXE Taq Buffer2.5yl，dNTP Mixture(2.5mmol /L each)2yl，上游引物0·6μ1，下游引物 0·6μ1 ，cDNA模板0. 6 μ I，E TaqDNA聚合酶（5u/ μ I) 0. 3 μ 1。PCR扩增条件为：94°C预变性 5min，94°C 变性 30s，58°C 退火 30s，72°C延伸 lmin，35 循环，72°C延伸 lOmin。1% 琼脂糖 凝胶电泳回收CpLYZPh基因片段； (4)原核表达载体的构建：PCR产物经电泳检测后，按DNA凝胶回收试剂盒回收，用 EcoRI和XhoI分别对回收产物和pET-30载体进行双酶切，对酶切产物回收纯化，再用 T4-DNA连接酶4°C连接过夜。连接产物转化至DH5a感受态细胞中，均匀接种于卡那霉素的 LB琼脂糖平板中，37°C培养过夜后，挑取含有Kana+抗性的克隆，对重组质粒进行菌液PCR 鉴定、EcoRI/XhoI双酶切鉴定以及送上海生工测序分析；将测序验证正确的载体命名为： pET-30a(+)-LYZPh。将含有重组质粒的克隆扩大培养，用普通质粒小提试剂盒抽提重组质 粒。
[0014] (5)重组蛋白的诱导表达：将重组质粒转入到BL12(DE3)感受态细胞中，涂布于含 Kana+抗性的固体LB培养基中，37°C培养过夜，挑取单克隆菌落，PCR检测，将筛选到的含 阳性克隆的BL21 (DE3)菌株接种到含有Kana+抗性的LB液体培养基内，在37°C，200 rpm/ min条件下培养至006。。为0. 5~0. 6时，加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，以相同条件继 续振荡培养8h，最后离心收集菌体； (6)重组蛋白的纯化：将收集得到的菌体重悬于裂解缓冲液（20mmol/L磷酸盐， 0. 5mol/L氯化钠 ，pH 7. 4)缓冲液重悬，超声裂菌（功率70W，破2s停2 s，超声15 min， 冰浴）后收集上清。将上清流过已经平衡好的（His)镍离子亲和层析预装柱，第一步： 10 倍柱体积的 I XBinding buffer (300mmol/L Nad, 50mmol/L NaH2PO4, lOmmol/L 咪 挫）洗绦柱子；第二步：6 倍柱体积的 I X Washing buffer (300mmol/L Nad, 50mmol/L NaH2P04,50mmol/L咪唑）洗脱杂蛋白；第三步：6倍柱体积的I XElute buffer (300mmol/ L Nacl，50mmol/L NaH2PO4, 300mM咪唑）洗脱目的蛋白；第四步：按上述步骤先后顺序 收集目的蛋白，每1ml左右收集一管；第五步：用6倍柱体积的IXStrip buffeKO. 5mmol/ L Nacl, 100 mmol/LEDTA, 20mmol/L Tris-Hcl)最终洗涤。第六步：用 SDS-PAGE 电泳分 析各管收集液，将含有目的蛋白的收集液合并在一起置于透析袋，用聚乙二醇8000浓缩， 得到纯化的噬菌体型溶菌酶重组蛋白，检测重组蛋白浓度达到0. 9mg/ml。
[0015] (7)从多序列比对分析结果看出，该基因具有噬菌体溶菌酶基因家族的一些保守 功能位点，Glu61和Asp72(图4)，与已知的噬菌体溶菌酶基因序列同源性较高28~44%， 推断该序列属于噬菌体溶菌酶基因。
【主权项】
1. 一种淡水珍珠蚌噬菌体型溶菌酶重组蛋白的制备方法，包括以下步骤： 设计含有酶切位点引物； 利用设计的含有酶切位点引物将噬菌体型溶菌酶基因进行PCR扩增，并通过酶切、转 化、筛选构建原核表达载体pET-30a(+)-LYZPh; 再将原核表达载体pET-30a(+) -LYZPh转化至大肠杆菌BL21 (DE3)并用IPTG进行目的 基因的诱导表达，获得含溶菌酶重组蛋白的菌液； 通过镍离子亲和柱层析对上述菌液进行纯化，用聚乙二醇8000对重组蛋白进行浓缩 后用15%SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的纯化效果。2. 根据权利要求1所述的一种淡水珍珠蚌噬菌体型溶菌酶重组蛋白的制备方法，其特 征是，所述的酶切位点引物包括上游引物：GTGTGAATTCATGGCTGCATCTTCAAACTCA和下游引 物：CACACTCGAGTCAATCAGCCAAGITTCTTATTCTCG，上游引物序列中GAAITC片段为EcoRI酶切 位点；下游引物序列中CTCGAG片段为XhoI酶切位点。
【专利摘要】本发明公开了一种淡水珍珠蚌噬菌体型溶菌酶重组蛋白的制备方法，该方法通过设计的特异性引物，提取三角帆蚌的总RNA，用反转录及PCR技术对噬菌体型溶菌酶基因进行克隆测序，再进行原核表达载体pET-30a(+)-LYZPh的构建，转化大肠杆菌BL21（DE3），得到重组工程菌。将工程菌在LB培养基中高密度培养，用IPTG诱导后重组基因得到大量表达。产物经亲和层析柱，得到纯化的噬菌体型溶菌酶。本发明能够快速获得表达量较高的噬菌体型溶菌酶的重组蛋白，弥补了淡水珍珠蚌噬菌体型溶菌酶蛋白的研究空白，可为研究噬菌体型溶菌酶蛋白和相关溶菌酶产品开发提供材料。<b/>
【IPC分类】C12N9/36
【公开号】CN104894085
【申请号】CN201510281938
【发明人】文春根, 胡宝庆, 简少卿, 戴文娟
【申请人】南昌大学
【公开日】2015年9月9日
【申请日】2015年5月28日