专利名称：制备溶菌酶的方法
技术领域：
本发明提供了一种简便而有效的制备溶菌酶的方法。
背景技术：
溶菌酶在食品与医疗上有相当广泛的用途。它普遍应用在食品的保存及加工，如牡蛎、虾等水产品，豆腐、蔬菜、鱼肉、水果等生鲜品的保鲜。此外，溶菌酶也广泛应用在乳酪的制作上，溶菌酶具有如同凝乳酶的角色，能使牛乳中的酪蛋白不稳定而产生凝乳作用。经过反复结晶精制、脱盐、干燥而得到纯化的溶菌酶，可制成锭状、颗粒状、舌片等形状而加以利用。例如溶菌酶可用于慢性副鼻腔炎伤口的治疗剂，以及作为眼药水等医药用品的保存剂。鸡蛋白中约含3.5％的溶菌酶(按干重计)，是制备溶菌酶的主要原料。目前工业上生产溶菌酶的方法主要是采用直接结晶法[Alderton，G.and Fevold，H.L.Direct crystallization of lysozyme from egg white and somecrystalline salts of lysozyme.J.Biol.Chem.1041(1946)]，此方法是在鸡蛋白液中添加5％氯化钠，调整pH为9.5后，加入少量晶种，然后置于4℃结晶化，其溶菌酶回收率约60～80％。然而，此方法的回收率可能受原料数量的影响变化非常大。张等人的研究[张珍田等，利用超过滤法纯化鸡蛋白溶菌酶的研究。中国农药化学会，24(1)86(1986)，台北]使用700mL的鸡蛋白液以同样方法进行实验的结果显示第1次结晶的回收率为43.0％，纯化倍数为4.9倍；两次结晶时的回收率降为12.4％，纯化倍数为7.9倍；酶次结晶时的回收率为11.8％，纯化倍数为9.1倍。此结果显示较大量的操作可能显著降低其回收率，纯化倍数也不甚理想。此外，其最大缺点是分离溶菌酶后，大量的蛋白液中含有高浓度的氯化钠，因而无法再次有效的利用。为解决上述高含盐的问题，许多研究尝试以超滤法进行溶菌酶的制备。张等人的研究(同上)显示，一次超滤配合结晶的回收率为47％，纯化倍数为3.0；Chiang等人的研究[Chiang，B.H.，etal，EggWhite lysozyme purification by ultrafiltration and affinitychromatography.J.FoodSci.58(2)303(1993)]指出，以分离分子量30,000的超滤膜处理后的溶菌酶回收率为96％，但纯化倍数仅6倍，显示纯化效果并不理想。此外，超滤法的最大缺点是滤膜容易阻塞，不利于大量生产。
此外，也有利用吸附剂纯化溶菌酶的研究，Alderton等[Alderton，etal.Isolationo flysozyme from egg white.J.Biol.Chem.15743(1945)]发现皂土(bentonite)具有吸附溶菌酶的性质，但不易洗出，必须以5％醋酸的酶啶溶液溶洗，不适合产业上的生产。
发明内容
为克服现有技术的不足之处，本发明的目的在于使用硅藻土、高岭土及沸石等对溶菌酶具有优异的选择性吸附现象，吸附的溶菌酶很容易以离子溶液洗出。此外，经吸附处理后的蛋白液具有与原蛋白液相同的加工特性，且无任何添加剂的污染，能完全保持其利用性。本发明即基于上述发现而完成。
换言之，本发明涉及一种制备溶菌酶的方法，其特征在于，使用硅藻土、高岭土、沸石或其混合物选择性地吸附蛋白中的溶菌酶，及随后以离子溶液进行洗提。该离子溶液是盐类的溶液，优选为氯化钠的溶液。
本发明的方法还可以进一步包括以结晶方法进行纯化，和/或者进一步以阴离子交换树脂进行纯化。
图1表示吸附剂用量对溶菌酶回收率的影响。
图2表示蛋白原液及经过三种吸附剂处理后的产物的SDS-PAGE图谱。
图3表示溶菌酶标准品(1)、蛋白原液(2)、经高岭土处理的产品(3)、以及再经结晶处理(4)或再经阴离子交换树脂处理的产品的SDS-PAGE图谱。
分析方法1.蛋白质相对量的测定将蛋白液经适当稀释后，以Hitachi公司制造的U-1100Spectrophotometer测定280nm的吸光度(A280)，并以此A280的相对值计算蛋白质的吸附百分比。
2.蛋白质浓度的测定采用Lowry法测定A液Na2CO310g与NaHCO32g溶成500mL。
B液1.6g CuSO4·5H2O与2.3g柠檬酸钠溶成200mL水溶液。
C液取50mL的A液与1mL的B液，在使用前混合。Folin-Ciocalteu’s酚试剂使用前加入2倍体积的蒸馏水稀释之。取经适当稀释的样品液0.2mL，加入C液1mL，混合均匀后在室温下反应30分钟，再加入Folin’s溶液0.1mL，在室温下反应60分钟，测650nm的吸光值，与标准曲线对比，求出样品中的蛋白质含量。标准曲线是以50～400μg/mL的牛血清白蛋白为标准溶液做出。
3.溶菌酶活性的测定将Micrococcus lysodeikticus菌体悬浮在0.067M的磷酸缓冲液中(20mg/100mL，pH6.3)，取此菌液2.97mL置于石英管中，加入30μL酵素液，混合均匀后，在室温下测定450nm波长的吸光变化值，每30秒记录一次，持续2分钟。
*一单位溶菌酶活性是指在上述条件下，每分钟能水解菌体使吸光值下降0.001单位的酵素量。
U/mL=ΔOD/min0.001OD/min×0.03mL]]>4.SDS-PAGE电泳分析分离胶体采用胶体浓度为15％的胶体，而焦集胶体的胶体浓度为4％。取10μl样品溶液(浓度约4mg/mL)，加10μl样品缓冲液(注1)及4μl的追踪染料溶液(注2)，在100℃下加热5分钟后，冷却至室温，进行电泳分析。胶体中蛋白质带以Coomassie Brilliant Blue R染色，并以醋酸-甲醇-水(10∶20∶70)脱色至呈背景透明，然后进行干片并予以保存。
注1SDS-PAGE样品缓冲溶液(2×)Tris(Trizma Base，125mM×2)3.0mgEDTA-2Na(2mM×2) 14.8mgSDS(2％×2)4.0mg2-巯基乙醇(5％×2) 10.0ml加水80ml溶解，pH调到6.8，加水至100ml稀释2倍后使用。
注2追踪染料溶液溴酚蓝大约1mg(称量不需十分准确)溶于5ml水，加5ml甘油混合均匀。
5.吸附后废蛋白功能性测定(A)蛋白质发泡力及泡沫安定性测定
取50毫升吸附后的蛋白液，置入100毫升容量的量筒内，用石蜡纸封紧后，以手摇方式垂直来回振荡1分钟(2次/秒)，测定所得到的泡沫体积(mL)，即为发泡力(膨胀)(foam expansion)。静置30分钟后再测定残留泡沫体积，以残留体积与原来体积的百分率比值表示其泡沫的安定性。
(B)蛋白乳化安定性的测定取25毫升吸附后的蛋白液，置入50mL容量的量筒，加入25毫升大豆油，在12,000rpm均质1分钟，立即测定水层高度(Mo)，然后在室温下放置30分钟，再测定其水层高度(Mt)，然后用以下公式计算其乳化安定性。
具体实施方式
通过以下实施例及试验例对本发明内容作进一步的具体说明，但本发明并非限制于这些实施例。只要是利用本发明的实质内容，均应属于本发明的范围。
实施例1将鸡蛋白液以蒸馏水稀释5倍，搅拌混合后以纱布过滤去除粘性团块物质，必要时可加以离心处理。取蛋白稀释液100mL，分别添加5g不同的吸附剂(皂土、硅藻土、高岭土及沸石)，在室温下处理30分钟，其间，偶尔加以摇动混合。离心(1,000g×5min)分离上清液。测定上清液及原蛋白液的溶菌酶活性及280nm的吸光度。根据测定值推算蛋白质的吸附率、溶菌酶活性吸附率及被吸附蛋白质的溶菌酶比活性及理论上的纯化倍数。结果如表1所示。
表1
由表1结果可知，皂土对溶菌酶的吸附性虽然很强，但是，对于溶菌酶以外的蛋白质的吸附性也很强，因此选择性不佳，由计算求得被吸附的蛋白质的溶菌酶比活性仅提高至1.89倍。相对地，硅藻土、高岭土及沸石吸附的蛋白质则大部分为溶菌酶，其比活性依序分别提高至26.88倍、16.72倍及12.20倍，显示此三种吸附剂对溶菌酶的吸附具有优异的选择性，也就是说上述三种吸附剂可有效地应用于溶菌酶的制备。
实施例2各取100mL稀释5倍的蛋白液，分别以5g的皂土、硅藻土、高岭土及沸石，依实施例1的同样方法进行吸附处理，并测定上清液的溶菌酶活性，借此计算被吸附的溶菌酶百分率。另外，将离心沉淀的各吸附剂分别以100mL的1MNaCl洗提溶菌酶(室温，75rpm振荡30分钟)。离心收集洗提液，测定其溶菌酶活性。然后计算以各吸附剂处理后的溶菌酶回收率及自吸附剂的洗提率。结果如表2所示。
表2初步纯化溶菌酶的吸附剂筛选试验
上述表2的结果显示，皂土对溶菌酶的吸附力极强，无法以1M的NaCl洗出。本发明所使用的硅藻土、高岭土及沸石等吸附剂所吸附的溶菌酶则很容易洗出，其洗提率依序分别为82.23％、90.70％及96.40％。
实施例3取100mL稀释5倍的蛋白液，分别添加1～5g的硅藻土或高岭土，或2～12g的沸石，然后依实施例1的相同方法进行吸附处理。经离心分离上清液后，各吸附剂分别以100mL的1M的NaCl洗提被吸附的溶菌酶(75rpm，30min，25℃)。离心收集洗提液，测定其溶菌酶活性的回收率，结果如图1所示。图1结果显示，对每100mL的5倍稀释的蛋白液而言，硅藻土及高岭土只要使用4g即可回收几乎100％的溶菌酶(也就是蛋白原液对吸附剂的比例为5∶1)，沸石则需使用8g(也就是蛋白原液对吸附剂的比例为10∶1)才可达到最高溶菌酶回收率，约为50％。
实施例4取100mL稀释5倍的蛋白液，分别添加4g的硅藻土或高岭土，或8g的沸石，然后依实施例3的相同方法进行吸附及洗提处理，但使用的洗提液分别改为不同浓度的NaCl溶液。然后测定洗提液中溶菌酶的回收率，结果如表3所示。表3的结果显示，使用1M的NaCl洗提可回收部分被吸附的溶菌酶，使用硅藻土、高岭土及沸石的溶菌酶活性回收率依序分别为86.01％、90.12％及51.69％。
表3氯化钠浓度对溶洗效果的影响
实施例5取200mL经5倍稀释的鸡蛋白均质液，分别加入8克硅藻土、8克高岭土或16克沸石，置于水浴振荡器上，均匀反应(75rpm×30min，25℃)，离心(1,000g×5min)，水洗沉淀，离心，再以150毫升1M的NaCl分三次反复洗出蛋白质，测定总蛋白质浓度与溶菌酶活性，并作电泳分析。结果如表4所示，以硅藻土、高岭土及沸石为吸附剂的溶菌酶回收率依序分别为82％、98％及54％；纯化倍数则分别为17.05倍、19.91倍及20.85倍。显示此三种吸附剂均具有优异的纯化效果。
表4以三种吸附剂分别自五倍稀释鸡蛋液中分离溶菌的比较
使用上述三种吸着剂进行纯化所得溶菌酶的SDS-PAGE分析图谱如图2所示。第2中1号为蛋白原液的图谱，呈色带以43Kd附近的色带为主成分，在14.4Kd附近的溶菌酶则几乎不呈现可见的色带，表示蛋白原液中溶菌酶含量相对地很少。2、3及4号样品是分别经由硅藻土、高岭土及沸石处理精制的产品的SDS-PAGE图谱，三者均显示以14.4Kd附近的溶菌酶色带为主成分，而原先为主要成分的43Kd附近的色带则变为微量成分。此结果显示上述三种吸附剂对溶菌酶具有优异的选择性吸附作用。
实施例6使用高岭土为吸附剂，依照实施例5的相同方法制备溶菌酶。然后依下列方法分别进一步进行阴离子交换树脂处理或溶菌酶的结晶处理。
(1)以阴离子交换树脂的纯化处理取1克阴离子交换树脂(AmberlystA-27，OH-型，日本Organo公司)，以蒸馏水洗至pH8～9左右，加入已经吸附纯化且透析过的酵素液10毫升，在室温下处理1小时。取上清液测总蛋白质量和溶菌酶活性，并作电泳分析。
(2)溶菌酶的结晶化取经吸附纯化、并经超过滤浓缩6倍的酵素液，调整pH值至9.5，加入少许结晶性溶菌酶，放置于4℃下，待结晶生成后，离心收集溶菌酶的结晶，并测定蛋白质含量及溶菌酶活性。测定处理前、后样品的蛋白质含量及溶菌酶活性，然后计算其比活性、纯化倍数及溶菌酶的回收率。结果如表5所示。此结果显示上述两种处理均能进一步纯化溶菌酶，其纯化倍数可提高至27～28倍。将上述纯化的溶菌酶进行SDS-PAGE分析，结果如图3，此结果显示上述经过阴离子交换树脂处理或结晶化处理的溶菌酶均呈单一色带，与市售的纯化溶菌酶(Sigma公司产品)相同。此结果表示上述纯化的两种产品均是纯化溶菌酶。
表5溶菌酶纯化表
试验例1将经过本发明使用的三种吸附剂处理后的三种蛋白液依前述记载的方法测定其加工机能力，也就是发泡力、泡沫安定性及乳化安定性，并与原蛋白液比较。结果如表6所示。表6结果显示，上述经吸附处理后的蛋白液均仍然具有相当良好的加工功能性。又本发明使用的吸附剂均是食品加工上合法的添加剂，经此类吸附剂处理后的蛋白液仍然可安全使用。由于未添加盐或其它任何添加剂，因此仍可广泛作为食品成分使用。
表6鸡蛋白液在吸附前后功能性质的比较
综上所述，本发明使用的三种吸附剂对溶菌酶具有良好的选择性吸附能力，可简便而有效地用于制备溶菌酶。以鸡蛋白为原料，使用上述三种吸附剂进行溶菌酶的制备时，可显著地提高比活性至17倍以上，而且溶菌酶的回收率高，分别约为80％以上(使用硅藻土时)，90％以上(使用高岭土时)及50％以上(使用沸石时)。进一步配合结晶化处理或阴离子交换树脂处理，则可制得在SDS-PAGE分析图谱中呈单一色带的纯化溶菌酶。
权利要求
1.一种制备溶菌酶的方法，其特征在于，使用硅藻土、高岭土、沸石或其混合物选择性地吸附蛋白中的溶菌酶，及随后以离子溶液进行洗提。
2.如权利要求1项所述的制备溶菌酶的方法，其特征在于，该离子溶液是盐类的溶液。
3.如权利要求2项所述的制备溶菌酶的方法，其特征在于，该盐类的溶液是氯化钠的溶液。
4.如权利要求1至3项的任一项所述的制备溶菌酶的方法，其特征在于，是进一步以结晶方法纯化。
5.如权利要求1至3项的任一项所述的方法，其特征在于，是进一步以阴离子交换树脂纯化。
全文摘要
本发明提供一种制备溶菌酶的有效方法，其特征为使用硅藻土、高岭土、沸石或其混合物选择性地吸附蛋白中的溶菌酶，及随后以离子溶液进行洗提。上述硅藻土、高岭土及沸石对溶菌酶具有优异的选择性吸附能力，可提高溶菌酶的纯化倍数。
文档编号C07K1/00GK1490405SQ0213148
公开日2004年4月21日 申请日期2002年10月17日 优先权日2002年10月17日
发明者李敏雄 申请人:李敏雄