专利名称：溶菌酶活力的测定方法
技术领域：
本发明涉及的是一种测定溶菌酶活力的方法，具体涉及用MBTH法测定溶菌酶活力的方法尤其涉及测定过程中关键参数的选择。
背景技术：
溶菌酶(Lysozyme)主要来源于人、动物、植物、微生物以及蛋清中，是一种专门作 用于微生物细胞壁的水解酶，又称细胞壁溶解酶，因其具有溶菌作用，故命名为溶菌酶，全 称为1，4-β-Ν-溶菌酶，又称粘肽N-乙酰基胞壁酰水解酶。它是一种有效的抗菌剂，它能 切断肽聚糖中N-乙酰氨基葡萄糖和N-乙酰胞壁酸之间的β -1，4糖苷键之间的联结，破坏 肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起细菌裂解。目前国内外报道检测溶菌 酶的方法有多种，如琼脂板扩散法，比浊法，比色法，高效液相色谱法、琼脂糖火箭电泳法、 共振散射光谱法等，其中比浊法是最常用的方法。比浊法以溶壁微球菌为底物，通过酶作用 前后吸光度的变化来体现酶活力的大小。该方法繁琐，使用的溶壁微球菌悬液体系是由菌 体颗粒和缓冲液组成的固_液相分布的不均勻的不稳定体系，在自然条件下该菌悬液也会 发生自身解体。菌悬液在反应前预热时间长短，终止反应时间的控制等都会对结果产生影 响。在比浊法中，细胞壁中的肽聚糖被溶菌酶水解成可溶性的碎片，虽然可以使溶液对光的 吸收度减少，但仍有大量菌体悬浮在溶液中，由于菌体本身多方面的差异，故悬浮在溶液中 的持续时间不同，导致溶液对光的吸收度变化较大，给测定结果带来一定的误差，从而限制 了它的使用。也有采用DNS法、铁青化钾法，以高脱乙酰度的壳聚糖为底物进行溶菌酶的酶 活力测定，但是，这些方法灵敏度均不够高，很难测到初速度，从而限制了其应用。本发明选用化学结构与肽聚糖结构非常近似的半脱乙酰壳聚糖(脱乙酰度在 45% -55% )为溶菌酶的水解底物，以3-甲基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)为显色剂来测定溶 菌酶的活力。该法不受低浓度醋酸盐和琥珀酸盐缓冲液的干扰，对于不同聚合度的同类还 原糖，其还原端的显色吸光系数基本相同。
发明内容
针对已有技术的不足，本发明提供一种溶菌酶活力的测定方法，该方法采用3-甲 基-2-苯并噻唑酮腙(MBTH)法来测定溶菌酶的活力。以下详细介绍本发明一种溶菌酶活力的测定方法，Α，制作用MBTH法测得的N-乙 酰氨基葡萄糖吸光度值与其相应浓度的标准对应关系曲线；B，用MBTH法检测待测溶菌酶 水解半脱乙酰壳聚糖后产生的相当于N-乙酰氨基葡萄糖的吸光度值；根据上一步骤制作 的N-乙酰氨基葡萄糖浓度与测得的相应吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待测溶菌 酶的酶解产物中在单位时间内所产生的相当于N-乙酰氨基葡萄糖的还原糖的含量，以此 来推算溶菌酶的活力。优化地；上述步骤A的具体步骤是；作用MBTH法测得的N-乙酰氨基葡萄糖吸光度 值与其相应浓度标准对应关系曲线；分别取6-15组不同浓度(0-20 μ g/mL)的N-乙酰氨基葡萄糖标准溶液0. 6mL,加入0. 6mL 0. 5当量的NaOH溶液，混勻，再加入MBTH试剂0. 6mL于 75-85°C水浴加热15-30min后趁热加入硫酸铁铵试剂1. 2mL，室温冷却后于波长620-680nm 处测定N乙酰氨基葡萄糖的吸光度值；每个浓度做三个平行样；根据每组N-乙酰氨基葡萄 糖浓度与测得的相应吸光度值之间的关系绘制标准对应关系曲线；优化地；上述步骤B的具体步骤是；用MBTH法检测溶菌酶的活力；将半脱乙酰壳 聚糖溶液其浓度为4-10mg/mL，加入到锥形瓶中于25-40°C的水浴摇床中预热8-12min，加 入预热至相应温度的溶菌酶溶液进行水解反应，水解时间为60min以内， 取水解液2mL (可 在反应过程中分时间段取样检测)，迅速与2mL 0.5当量的NaOH溶液充分混勻以终止反 应，取1. 2mL加入到试管中(做三个平行样)，再加入MBTH试剂0. 6mL于75_85°C水浴加热 15-30min后趁热加入硫酸铁铵试剂1. 2mL,室温冷却后于波长620-680nm处测定吸光度值， 根据上一步骤制作的N-乙酰氨基葡萄糖的浓度与测得的相应吸光度值之间的标准对应关 系曲线确定待测溶菌酶的活力；溶菌酶的活力单位可被定义为在上述条件下，每毫升反应 体系，每分钟产生Inmol相当于N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。其中 MBTH试剂的制法是3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫苏糖醇溶液 等量混合即得，现用现配，一天内有效。优化地；上述硫酸铁铵试剂的制法是0. 5% (FeNH4 (S04) 2) · 12H20,0. 5%氨基磺
酸，0.5当量盐酸。优化地；上述壳聚糖的脱乙酰度为50%。优化地；上述半脱乙酰壳聚糖以50mM的丁二酸缓冲溶液或醋酸缓冲溶液为溶剂。优化地；上述测定吸光度值的最佳波长为655nm。本发明的优点是本发明用MBTH法对溶菌酶水解半脱乙酰壳聚糖后所产生的N-乙 酰氨基葡萄糖端基的数量进行检测以此来确定溶菌酶的活力；N-乙酰氨基葡萄糖以及低 聚半脱乙酰壳聚糖是溶菌酶水解的最终产物，因此对N-乙酰氨基葡萄糖端基含量检测的 灵敏度直接决定着对溶菌酶活力检测的灵敏度。该方法比比浊法简便、快速、准确、价廉。检 测限和工作浓度范围都明显低于DNS法和铁氰化钾法，所以本方法的灵敏度明显高于DNS 法和铁氰化钾法。
具体实施例方式实施例1 主要仪器水浴恒温振荡器，SHZ-82型，国华电器有限公司；电热恒温水浴锅， HH-4型，国华电器有限公司；数字酸度计，上海大普仪器有限公司；721可见光分光光度计 或，上海菁华科技仪器有限公司；溶菌酶，来源于蛋清，sigma;半脱乙酰壳聚糖，实验室自 制；移液器，Finnpipette。溶液配置MBTH显色液3mg/mL的3_甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫苏糖醇溶 液等量混合即得，现用现配，一天内有效。N乙酰氨基葡萄糖标准溶液(20 μ g/mL)精确称取干燥至恒质量的N-乙酰氨基葡 萄糖0. 2000g,用50mM pH4. 0的醋酸缓冲溶液溶解、转移并定容至IOOmL,配成2. 00mg/mL 的N-乙酰氨基葡萄糖标准溶液；从中取ImL N-乙酰氨基葡萄糖溶液，如前法操作并定容至IOOmL,即得20 μ g/mL的N-乙酰氨基葡萄糖标准溶液。硫酸铁铵试剂的制法是0. 5% (FeNH4(S04)2) ·12Η20，0. 5%氨基磺酸，0. 5当量盐酸。步骤Α，制作用MBTH法测得的N-乙酰氨基葡萄糖吸光度值与其相应浓度的标准对应关系曲线；分别加入8组不同浓度的N-乙酰氨基葡萄糖标准溶液0. 6mL,加入0. 6mL 0. 5当 量的NaOH溶液，混勻，再加入MBTH试剂0. 6mL于80°C水浴加热15-20min后趁热加入硫酸 铁铵试剂1. 2mL，室温冷却后于波长655nm处测定N-乙酰氨基葡萄糖的吸光度值；每个浓 度做三个平行样；根据每组N-乙酰氨基葡萄糖溶液浓度与测得的相应吸光度值之间的关 系绘制标准对应关系曲线；B,用MBTH法检测溶菌酶的活力；将9. 9mL半脱乙酰壳聚糖溶液其浓度为4mg/mL，pH值为4. 0，加入到锥形瓶中 于40°C的水浴摇床中预热lOmin，加入待测的溶菌酶溶液0. ImL进行水解反应，为确定合 适的待测溶菌酶浓度可以将待测的溶菌酶溶液稀释成不同浓度梯度逐个检测，水解时间为 60min以内，取水解液2mL(可在反应过程中分时间段取样检测)，迅速加入2mL 0. 5当量的 NaOH溶液中(做三个平行样)，混勻，取1. 2mL加入到试管中，再加入MBTH试剂0. 6mL于 75-85°C水浴加热20-25min后趁热加入硫酸铁铵试剂1. 2mL,室温冷却后于波长655nm处测 定吸光度值，根据上一步骤制作的N-乙酰氨基葡萄糖浓度与测得的相应吸光度值之间的 标准对应关系曲线确定待测的溶菌酶的酶解产物中所含有的相当于N-乙酰氨基葡萄糖的 还原糖的量。溶菌酶的活力单位可被定义为在上述条件下，每毫升反应体系中每分钟产生 Inmol相当于N-乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个酶活力单位，从而根据酶活力定义来推算木 溶菌酶的活力。实施例2 主要仪器电热恒温水浴锅，HH-4型，国华电器有限公司；数字酸度计，上海大普 仪器有限公司；UV2100紫外-可见分光光度计，尤尼柯(上海)仪器有限公司；溶菌酶，来 源于蛋清，sigma ；半脱乙酰壳聚糖，实验室自制；移液器，Finnpipette0溶液配置MBTH显色液3mg/mL的3_甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫苏糖醇溶 液等量混合即得，现用现配，一天内有效。N-乙酰氨基葡萄糖标准溶液(20 μ g/mL)精确称取干燥至恒质量的N-乙酰氨基 葡萄糖0. 2000g,用50mM pH4. O的醋酸缓冲溶液溶解、转移并定容至IOOmL,配成2. 00mg/mL 的N-乙酰氨基葡萄糖标准溶液；从中取ImL N-乙酰氨基葡萄糖溶液，如前法操作并定容至 IOOmL,即得20 μ g/mL的N-乙酰氨基葡萄糖标准溶液。硫酸铁铵试剂的制法是0. 5% (FeNH4(S04)2) ·12Η20，0. 5%氨基磺酸，0. 5当量盐酸。步骤Α，制作用MBTH法测得的N-乙酰氨基葡萄糖吸光度值与其相应浓度的标准对 应关系曲线；分别加入8组不同浓度的N-乙酰氨基葡萄糖标准溶液0. 6mL,加入0. 6mL 0. 5当 量的NaOH溶液，混勻，再加入MBTH试剂0. 6mL于80°C水浴加热15-20min后趁热加入硫酸铁铵试剂1. 2mL,室温冷却后于波长655nm处测定N-乙酰氨基葡萄糖的吸光度值；每个浓 度做三个平行样；根据每组N-乙酰氨基葡萄糖溶液浓度与测得的相应吸光度值之间的关 系绘制标准对应关系曲线；B,用MBTH法检测溶菌酶的活力；将ImL半脱乙酰壳聚糖溶液其浓度为8mg/mL，pH值为4. 0，加入试管中于40°C的 水浴摇床中预热lOmin，加入待测的已预热至40°C的溶菌酶溶液ImL进行水解反应，为确定 合适的待测溶菌酶浓度可以将待测的溶菌酶溶液稀释成不同浓度梯度逐个检测，水解时间 为60min以内，迅速加入2mL 0. 5当量的NaOH溶液充分混勻以终止反应，从中取1. 2mL加 入到已有0. 6mL MBTH试剂的另一试管中，充分混勻，于75-85 °C水浴加热20-25min后趁热 加入硫酸铁铵试剂1. 2mL,室温冷却后于波长655nm处测定吸光度值，如法做三个平行样， 根据上一步骤制作的N-乙酰氨基葡萄糖浓度与测得的相应吸光度值之间的标准对应关系 曲线确定待测的溶菌酶的酶解产物中所含有的相当于N-乙酰氨基葡萄糖的还原糖的量。 溶菌酶的活力单位可被定义为在上述条件下，每毫升反应体系中每分钟产生Inmol相当于 N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位，从而根据酶活力定义来推算木溶菌酶的 活力。当然，上述说明并非是对本发明的限制，本发明也并不限于上述操作，所有在本发明的实质范围内作出的变化、改型、添加或替换，都应属于本发明的保护范围。
权利要求
一种溶菌酶活力的测定方法，其特征是；A，制作用MBTH法测得的N-乙酰氨基葡萄糖吸光度值与其相应浓度的标准对应关系曲线；B，用MBTH法检测待测溶菌酶水解半脱乙酰壳聚糖后产生的相当于N-乙酰氨基葡萄糖的吸光度值；根据上一步骤制作的N-乙酰氨基葡萄糖浓度与测得的相应的吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待测溶菌酶的酶解产物中在单位时间内所产生的相当于N-乙酰氨基葡萄糖的还原糖的含量，以此来推算溶菌酶的活力。
2.根据权利要求1所述的溶菌酶活力的测定方法，其特征是；上述步骤A的具体步骤 是；分别取6-15组具有不同浓度的N-乙酰氨基葡萄糖标准溶液0. 6mL,浓度范围在0_20微 克/毫升之间，加入0. 6mL 0. 5当量的NaOH溶液，混勻，再加入MBTH试剂0. 6mL于75_85°C 水浴加热15-25min后趁热加入硫酸铁铵试剂1. 2mL,室温冷却后于波长620-680nm处测定 吸光度值；每个浓度做三个平行样；根据每组N-乙酰氨基葡萄糖浓度与测得的吸光度值之 间的关系绘制标准对应关系曲线。
3.根据权利要求1或2所述的溶菌酶活力的测定方法，其特征是；上述步骤B的具体 步骤是；将壳聚糖_脱乙酰度在45% -55%的溶液其浓度为4-10mg/mL，加入到锥形瓶中于 40-500C的水浴摇床中预热8-12min，加入预热至相应温度的溶菌酶溶液开始水解反应，水 解时间为60min以内，取水解液2mL，可在反应过程中分阶段取样，与2mL 0. 5当量的NaOH 溶液迅速混合以终止反应，从中取1. 2mL加入到试管中，做三个平行样，再加入MBTH试剂 0. 6mL于75-85°C水浴加热20-30min后趁热加入硫酸铁铵试剂1. 2mL,室温冷却后于波长 620-680nm处测定吸光度值，根据步骤A制作的N-乙酰氨基葡萄糖浓度与测得的相应吸光 度值之间的标准对应关系曲线确定酶解产物中所含有的相当于N-乙酰氨基葡萄糖的还原 糖浓度，以此来推算溶菌酶的活力；溶菌酶的活力单位可被定义为在上述条件下，每毫升反 应体系每分钟产生Inmol相当于N-乙酰氨基葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位；其中 MBTH试剂的制法是3mg/mL的3-甲基-2-苯并噻唑酮腙溶液和lmg/mL的二硫苏糖醇溶液 等量混合即得，现用现配，一天内有效。
4.根据权利要求3所述的溶菌酶活力的测定方法，其特征是；上述硫酸铁铵试剂的制 法是 0. 5% (FeNH4(SO4)2) · 12H20，0. 5%氨基磺酸，0. 5 当量盐酸。
5.根据权利要求3所述的溶菌酶活力的测定方法，其特征是；上述壳聚糖的脱乙酰度 为 50%。
6.根据权利要求3所述的溶菌酶活力的测定方法，其特征是；上述壳聚糖溶液以50mM 的丁二酸或醋酸溶液为溶剂。
7.根据权利要求3所述的溶菌酶活力的测定方法，其特征是；上述测定吸光度值的最 佳波长为655nm。
全文摘要
本发明公开了一种溶菌酶活力的测定方法，其特征是；A，制作用MBTH法测得的N-乙酰氨基葡萄糖吸光度值与其相应浓度的标准对应关系曲线；B，用MBTH法检测待测溶菌酶水解半脱乙酰壳聚糖后产生的相当于N-乙酰氨基葡萄糖的吸光度值；根据上一步骤制作的N-乙酰氨基葡萄糖浓度与测得的相应吸光度值之间的标准对应关系曲线确定待测溶菌酶的酶解产物中在单位时间内所产生的相当于N-乙酰氨基葡萄糖的还原糖的含量，以此来推算溶菌酶的活力。该方法测定N-乙酰氨基葡萄糖的检测限和工作浓度范围都明显低于DNS法和铁氰化钾法，所以本方法的灵敏度明显高于DNS法和铁氰化钾法。
文档编号C12Q1/34GK101839850SQ201010144058
公开日2010年9月22日 申请日期2010年4月12日 优先权日2010年4月12日
发明者张永勤, 武强, 王哲平 申请人:青岛科技大学