专利名称：基于绿色荧光蛋白sfGFP的荧光互补系统的制作方法
技术领域：
本发明涉及基于绿色荧光蛋白sfGFP的荧光互补系统。
背景技术：
研究蛋白质_蛋白质间的相互作用(PPI)是研究细胞中信号通道和传导的基础。 细胞的平衡态、内部变化和细胞生理功能都很大程度上依赖于蛋白质_蛋白质相互作用的 信号网络进行调节。检测他们之间的相互作用，揭示生物学功能是当代生物医药领域的热
点ο通过分子生物学的方法，调节特定的蛋白质与蛋白质相互作用为一些疑难杂症也 提供了一种新的治疗方法的可能性。因此，无论是学术科研机构还是制药公司对这一领域 都表现出浓厚的兴趣，希望将调节蛋白质与蛋白质相互作用作为一种新的治疗手段。
在生物体外有很多种研究蛋白质-蛋白质相互作用的方法。其中大多需要首先将 这些蛋白从其环境中纯化出来才可以使用。但因为只有将所研究的蛋白还原到自然细胞生 理状态下进行研究，我们才能得到准确空间信息，因此能够用于活细胞中PPI的分析技术 显得尤为重要。类似的技术包括荧光共振能量转移技术(FRET)、双分子荧光互补技术(BiFC)、 荧光互相关谱(FCCS)等。在这些方法中，双分子荧光互补技术(BiFC)被证明是较为普遍 的研究蛋白质相互作用的技术，并且广泛用于研究各类细胞和生物。另外，亚细胞定位、多 蛋白质分析同样也能够被双分子荧光互补技术(BiFC)检测出来。双分子荧光互补技术(BiFC)属于蛋白质互补分析的一种，包括GFP的拆分、内酰 胺酶的拆分、荧光素酶的拆分等。BiFC的原理是通过分子工程技术，在适当的位置将荧光 蛋白拆分为互补的两个片段。在细胞中，这两个片段本没有荧光，通常会先和各自的蛋白质 结合(速度较快)，然后随着这两个蛋白的相互作用，两个荧光蛋白片段自组装，发出荧光。 目前，青色、绿色、黄色、红色荧光蛋白都已经用于双分子荧光互补技术。双荧光互补系统(Bimolecular Fluorescence Complementation, BiFC)以其快速 便捷，细胞生理水平即时检测蛋白质相互作用和无需裂解细胞等诸多优势而受到分子标记 领域的广泛青睐。但是，BiFC主要的缺点是大部分被拆分的荧光蛋白片段本身仍具有很高 的亲和力和同源性，易于自组装，导致即使蛋白没有相互作用也能发出荧光的假阳性。这个 问题大大限制了 BiFC的灵敏度，时空分辨率和准确度。要使BiFC能够在更大的范围内应 用，一些更加可行的改进方法迫在眉睫。Superfolder GFP蛋白，简称sfGFP蛋白。Superfolder GFP是绿色荧光蛋白家族 的重要成员。和其他GFP相比，superfolder GFP具有更好的循环排列，更强的适应化学变 性和更强的折叠能力。但是，superfolder GFP最大的劣势是，以其构建BiFC容易自激活 从而产生严重的假阳性结果。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种用作荧光互补系统的蛋白片段及其编码基因。本发明所提供的蛋白片段，如1)、2)或3)所示1)氨基酸序列如SEQUENCE 一-
spGFPC (ml4) RDHMAAHAYVNAAGATID--
spGFPC (ml5) RDHMAAHEYVNAAGITGG [++I-相对平均荧光强度由软件ImageJ分析得到。(-)代表无可见荧光；(+/_)代表荧光几乎不可见；(+)，(++)，(+++)，(++++)分别 代表可见荧光。(+)代表sfGFP BiFC和BFP的荧光强度比值大于0小于等于0. 3 ；(++)代表sfGFP BiFC和BFP的荧光强度比值大于0. 3小于等于0. 6 ；(+++)代表sfGFP BiFC和BFP的荧光强度比值大于0. 6小于等于0. 9 ；
(++++)代表sfGFP BiFC和BFP的荧光强度比值大于0. 9小于等于1. 2。sfGFP BiFC表示转入本发明的荧光互补表达载体的处理组；BFP表示转入BFP质 粒的对照组。
"AF of Positive Control，，表示Bcl-xL与Bak(+)组；"AF of Negative Control" 表示 Bcl-xL 与 Bak(-)组。结果表明，通过突变改造的突变体sfGFPC (m6)、sfGFPC (ml2)、sfGFPC (ml5)区分 阳性和阴性的效果更佳显著，且假阳性明显降低，背景荧光也明显下降，sfGFPC(ml5)的效 果最好。除了 spGFPC-m6、SpGFPC-ml2、SpGFPC-ml5外，其它spGFPC突变片段均有假阳性高 的缺点。实验设3次重复，结果一致。三、WesternE 口迹为了确定SfGFPN和sfGFPC及其突变体的表达量，在实验一中所述的各重组表达 载体中sfGFPN的5'端插入Myc标签的编码基因，使表达的融合蛋白的的N端带有Myc标 签；在实验一中所述的各重组表达载体中sfGFPC的5'端插入His标签的编码基因，使表 达的融合蛋白的N端带有His标签。按照实验二中所述的各处理组，将加有His标签和Myc标签后的重组表达载体转 染细胞，24h后收集细胞。用细胞裂解液(购自碧云天公司，产品号P0013B)裂解细胞，得到的裂解产物做 western blot 检测。抗His按1 1000稀释；抗Myc—抗按1 1000稀释，内参对照b_actin按 1 1000稀释；二抗(山羊抗小鼠)按1 40000稀释。(抗体均购自碧云天公司)。同时以用重组表达载体pcDNA3. 1-His-sfGFP-Bcl-xL转染的细胞及用重组表达 载体pcDNA3. 1-Myc-sfGFP-Bcl-XL转染的细胞作为对照。重组表达载体pcDNA3. 1-His-sfGFP-Bcl-xL 的制备将 SEQUENCE ID 12 所 示的sfGFP编码基因插入载体pcDNA3. 1的NotI和ClaI酶切位点，同时将SEQUENCE ID 14所示的Bcl-xL编码基因插入载体pcDNA3. 1的BspEI和XbaI酶切位点，再同 时将His编码基因插入载体pcDNA3. 1的EcoRI+NotI酶切位点，得到重组表达载体 pcDNA3. 1-His-sfGFP-Bcl-xL。重组表达载体pcDNA3. l-Myc-sfGFP-Bcl-XL 的制备将 SEQUENCE ID 12 所 示的sfGFP编码基因插入载体pcDNA3. 1的NotI和ClaI酶切位点，同时将SEQUENCE ID 14所示的Bcl-xL编码基因插入载体pcDNA3. 1的BspEI和XbaI酶切位点，再同 时将Myc编码基因插入载体pcDNA3. 1的EcoRI+NotI酶切位点，得到重组表达载体 pcDNA3. 1-Myc-sfGFP-Bcl-xLo检测结果如图3所示。图 3A 中，1. Myc-sfGFPN-Bak (+)和 His-sfGFPC-Bcl-xL，2. Myc-sfGFPN-Bak(+)和 His-sfGFPC(mutant 6)-Bcl-xL,3. Myc-sfGFPN-Bak(+)和 His-sfGFPC(mutant 12)-Bcl-xL,4. Myc-sfGFPN-Bak(+)和 His-sfGFPC(mutant 15)-Bcl-xL.
5. His-sfGFP-Bcl-xLo图 3B 中，1. Myc-sfGFPN-Bak (-)和 His-sfGFPC-Bcl—xL，2. Myc-sfGFPN-Bak(-)和 Hi s-sfGFPC(mutant 6)，3. Myc-sfGFPN-Bak(_)和 His-sfGFPC(mutant 12)，4. Myc-sfGFPN-Bak(_)和 His-sfGFPC(mutant 15)，5. Myc-SfGFP-Bcl-XL0本实验旨在检测用本发明的荧光互补系统检测Bcl-XL和Bak(+)/Bak(_)蛋白对的相互作用时，是否是因为蛋白表达量不同而导致荧光数量和强度的不同。结果可以看到 用Mys和His标签的抗体检测后，条带粗细基本一致；表明，用本发明的荧光互补系统检测 Bcl-XL和Bak(+)/Bak(-)蛋白对的相互作用时，荧光强弱不同，并不是因为荧光蛋白片段 表达量不同而造成的，完全是因为待测蛋白片段的结合能力所致；本发明的突变体荧光互 补系统在正确检测出待测蛋白片段能否相互结合的基础上，还大大降低了背景荧光和假阳 性。
权利要求
一种蛋白片段，如1)、2)或3)所示1)氨基酸序列如SEQUENCE ID5所示的蛋白片段；2)氨基酸序列如SEQUENCE ID7所示的蛋白片段；3)氨基酸序列如SEQUENCE ID9所示的蛋白片段。
2.一组蛋白片段，由蛋白片段I和蛋白片段II组成，所述蛋白片段I的氨基酸序列如 SEQUENCE ID 1所示，所述蛋白片段II的氨基酸序列为SEQUENCE ID :5、SEQUENCEID 7或 SEQUENCE ID 9所示；所述蛋白片段I和蛋白片段II分别独立包装。
3.权利要求1或2所述蛋白片段的编码基因。
4.根据权利要求3所述的编码基因，其特征在于所述编码基因为如下1)、2)、3)、4) 或5)的基因1)SEQUENCE ID 5所示蛋白片段的编码基因为SEQUENCE ID 6所示的DNA分子；2)SEQUENCE ID 7所示蛋白片段的编码基因为SEQUENCE ID 8所示的DNA分子；3)SEQUENCE ID 9所示蛋白片段的编码基因为SEQUENCE ID 10所示的DNA分子；4)在严格条件下与1)、2)或3)限定的DNA序列杂交且编码所述蛋白的DNA分子；5)与1)、2)或3)限定的DNA序列具有90%以上的同源性且编码所述蛋白的DNA分子。
5.含有权利要求3或4所述编码基因的重组载体、重组菌、转基因细胞系或表达盒。
6.权利要求1或2中所述蛋白片段在检测待测蛋白质A与待测蛋白质B是否相互作用 中的应用；或权利要求3或4中所述编码基因在检测待测蛋白质A与待测蛋白质B是否相 互作用中的应用。
7.权利要求1或2中所述蛋白片段在构建荧光互补系统中的应用；或权利要求3或4 中所述编码基因在构建荧光互补系统中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于所述荧光互补系统是用于检测待测蛋白 质A与待测蛋白质B是否相互作用的荧光互补系统。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其特征在于所述荧光互补为双分子荧光互补。
全文摘要
本发明公开了基于绿色荧光蛋白sfGFP的荧光互补系统。该蛋白片段，如1)、2)或3)所示1)氨基酸序列如SEQUENCE ID5所示的蛋白片段；2)氨基酸序列如SEQUENCE ID7所示的蛋白片段；3)氨基酸序列如SEQUENCE ID9所示的蛋白片段。本发明基于superfolder GFP(sfGFP)荧光蛋白，从其第214和第215氨基酸残基分离得到两个荧光蛋白片段(sfGFPN and sfGFPC)；其中sfGFPC片段通过点突变的方法改进为假阳性更少的蛋白片段。实验证明，本发明突变得到的sfGFPC片段与sfGFPN用于构建检测蛋白质相互作用的荧光互补系统的效果很好，且假阳性率很低，远低于对照组。本发明构建的super fold GFP BiFC克服了super fold GFP本身自激活产生假阳性结果的缺陷。因此，本发明在检测蛋白质相互作用领域将有广阔的应用前景。
文档编号C12N15/63GK101830972SQ201010143618
公开日2010年9月15日 申请日期2010年4月7日 优先权日2010年4月7日
发明者周军, 夏斌, 林坚 申请人:北京大学