一种绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌的方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物病理学领域，特别涉及一种绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌的方法。
【背景技术】
[0002] 甜瓜蔓枯病是由瓜类壳二孢菌（AscochytacitrullinaSmith,其无性世代为泄 根亚隔孢壳Didymellabryoniae)引起的真菌病害，在甜瓜的幼苗期至采收期均可发生。 该病害大多发生在植株茎基部和节间部，发病后致使整个植株失水枯萎而死亡。蔓枯病菌 寄主范围广泛，可危害萌芦科的甜瓜、黄瓜、西瓜、南瓜等多种经济作物。冬春日光温室及早 春、秋后大棚栽培均有发生，在生产上往往植株死亡率可达30 %?40 %，造成严重减产，目 前其危害程度远高于瓜类枯萎病和疫病，已成为制约甜瓜生产的主要障碍。要获得抗病品 种，首先要了解蔓枯病的分子遗传基础和致病机制，目前国内外对于甜瓜蔓枯病的病原菌 的鉴定，类群分析研宄已取得了一些进展，但缺乏对蔓枯病致病机理认识。
[0003] 稳定表达绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌株对于研宄蔓枯病菌致病相关基因、侵染过 程和致病机理，对于研宄蔓枯病菌侵染致病过程的组织学研宄和蔓枯病病原菌致病相关基 因、病原菌与寄主互作以及病原菌的功能基因组学研宄奠定基础，同时，为蔓枯病害控制和 甜瓜抗蔓枯病抗病育种材料获得提供理论基础。然而，目前，国内外已有利用不同遗传转化 方法转化绿色荧光蛋白标记（GFP)真菌的报道，但已报道的GFP标记真菌菌株方法或未涉 及具体标记相关细节，或标记转化步骤繁琐，效率低下，荧光强度不稳定。目前更没有可参 考的蔓枯病菌GFP标记菌株及方法报道，这已经成为蔓枯病菌侵染致病过程与机理研宄的 瓶颈。目前更没有可参考的GFP标记蔓枯病菌菌株及方法报道。因此，急需获得稳定表达 绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌株及方法。
【发明内容】
[0004] 为解决上述现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种绿色荧光蛋白标记 蔓枯病菌株的方法，以蔓枯病菌株（GSB20)为转化体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将 绿色荧光蛋白基因标记蔓枯病菌株（GSB20)基因组，获得标记绿色荧光蛋白的蔓枯病菌菌 株（GSB20-GFP)。
[0005] 为达到上述目的，本发明的技术方案为：
[0006] 一种绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌的方法，包括如下步骤：
[0007] (1)蔓枯病菌菌株分生孢子液的制备；
[0008] (2)制备含有GFP基因的农杆菌菌液；
[0009] (3)蔓枯病菌株的GFP基因转化标记；
[0010] (4)对标记有绿色荧光蛋白GFP的蔓枯病菌株进行鉴定；
[0011] (5)获得带有绿色荧光蛋白标记GFP的蔓枯病菌株。
[0012] 进一步的，所述蔓枯病菌菌株为蔓枯病菌菌株GSB20。
[0013] 进一步的，所述步骤（1)的具体操作步骤为：使用打孔器切取蔓枯病菌GSB20菌 块，在马铃薯固体培养基上培养4d后，在紫外光和普通光12小时交替培养10天，用培养 液A冲洗培养基表面，收集并稀释孢子液，调节孢子液浓度至lxlO6个/mL，得到蔓枯病菌株 GSB20孢子悬浮液，备用。
[0014] 进一步的，所述步骤（2)的具体操作步骤为：将携带表达绿色荧光蛋白载体pGFP 的农杆菌AGL-1在新鲜的平板B上划线，28°C培养48h后，挑取单克隆，接种到5mL培养液 B中，于25°C，220rpm振荡培养48h后用紫外分光光度计测0D6(J直，用培养液A稀释，使菌 液0D_= 0. 10,然后将菌液稀释液在28°C振荡培养4h，得到AGL-1农杆菌菌液，备用。
[0015] 进一步的，所述步骤（3)蔓枯病菌株的GFP基因转化标记方法如下：
[0016] 1)将步骤（2)中制备的AGL-1农杆菌菌液和步骤（1)中制备的蔓枯病菌株GSB20 孢子悬浮液等体积混合，取200yL混合液均匀涂布于不含抗生素的IM共培养平板上的硝 酸纤维素滤膜表面，24°C避光共培养24h;
[0017] 2)共培养24h后，将滤膜揭下，正铺到培养基C上，24°C培养168h，生长出转化子；
[0018] 3)用无菌接种环挑取单个转化子接种到PDA筛选平板上进行二次筛选，25°C培 养，保存转化子GSB20-GFP，用于阳性鉴定。
[0019] 进一步的，所述的步骤（1)、（2)中的培养液A为加入了 400ymol吨4乙酰丁香酮 的頂液体诱导培养基，頂液体诱导培养基；平板B是加入了 50mg吨―1卡那霉素和50mg吨―1 利福平的YEB平板；培养液B是加入了 50mg?L-1卡那霉素和50mg?L―1利福平的丽液体 基础培养基。
[0020] 进一步的，所述的步骤（3)中的培养基C是加入了 300mg吨―1特美汀和100mg吨-1 潮霉素的马铃薯固体培养基。
[0021] 进一步的，所述步骤（4)的具体操作步骤为：
[0022] 1)采用PCR方法，用真菌ITS通用引物、蔓枯病菌株特异性引物、绿色荧光蛋白基 因的特异性引物检测阳性转化子为被标记绿色荧光蛋白基因的蔓枯病菌株；
[0023] 2)采用OLYMPUSDP72荧光显微镜观察转化子是否携带绿色荧光蛋白基因。
[0024] 进一步的，所述的步骤（4)中的真菌ITS引物为：
【主权项】
1. 一种绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌的方法，其特征在于，包括如下步骤： (1) 蔓枯病菌菌株分生孢子液的制备； (2) 制备含有GFP基因的农杆菌菌液； (3) 蔓枯病菌株的GFP基因转化标记； (4) 对标记有绿色荧光蛋白GFP的蔓枯病菌株进行鉴定； (5) 获得带有绿色荧光蛋白标记GFP的蔓枯病菌株。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述蔓枯病菌菌株为蔓枯病菌菌株 GSB20。
3. 根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤（1)的具体操作步骤为：使用 打孔器切取蔓枯病菌GSB20菌块，在马铃薯固体培养基上培养4d后，在紫外光和普通光12 小时交替培养10天，用培养液A冲洗培养基表面，收集并稀释孢子液，调节孢子液浓度至 lxlO 6个/mL，得到蔓枯病菌株GSB20孢子悬浮液，备用。
4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述步骤（2)的具体操作步骤为：将携带 表达绿色荧光蛋白载体pGFP的农杆菌AGL-1在新鲜的平板B上划线，28°C培养48h后，挑 取单克隆，接种到5mL培养液B中，于25°C，220rpm振荡培养48h后用紫外分光光度计测 〇D_值，用培养液A稀释，使菌液0D _= 0. 10,然后将菌液稀释液在28°C振荡培养4h，得到 AGL-1农杆菌菌液，备用。
5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述步骤（3)蔓枯病菌株的GFP基因转化 标记方法如下： 1) 将步骤（2)中制备的AGL-1农杆菌菌液和步骤（1)中制备的蔓枯病菌株GSB20孢子 悬浮液等体积混合，取200 y L混合液均匀涂布于不含抗生素的IM共培养平板上的硝酸纤 维素滤膜表面，24°C避光共培养24h ; 2) 共培养24h后，将滤膜揭下，正铺到培养基C上，24°C培养168h，生长出转化子； 3) 用无菌接种环挑取单个转化子接种到PDA筛选平板上进行二次筛选，25°C培养，保 存转化子GSB20-GFP，用于阳性鉴定。
6. 根据权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于，所述的步骤（1)、（2)中的培养液A 为加入了 400 y mol ? I71乙酰丁香酮的頂液体诱导培养基，頂液体诱导培养基；平板B是 加入了 50mg .I71卡那霉素和50mg .L 4利福平的YEB平板；培养液B是加入了 50mg .Lh卡 那霉素和50mg ? I71利福平的MM液体基础培养基。
7. 根据权利要求3-5任一所述的方法，其特征在于，所述的步骤（3)中的培养基C是加 入了 300mg ? L-1特美汀和100mg ? L-1潮霉素的马铃薯固体培养基。
8. 根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤（4)的具体操作步骤为： 1) 采用PCR方法，用真菌ITS通用引物、蔓枯病菌株特异性引物、绿色荧光蛋白基因的 特异性引物检测阳性转化子为被标记绿色荧光蛋白基因的蔓枯病菌株； 2) 采用OLYMPUS DP72荧光显微镜观察转化子是否携带绿色荧光蛋白基因。
9. 根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤（4)的具体操作步骤为： 1) 采用PCR方法，用真菌ITS通用引物、蔓枯病菌株特异性引物、绿色荧光蛋白基因的 特异性引物检测阳性转化子为被标记绿色荧光蛋白基因的蔓枯病菌株； 2) 采用OLYMPUS DP72荧光显微镜观察转化子是否携带绿色荧光蛋白基因。
10.根据权利要求8或9所述的方法，其特征在于，所述的步骤（4)中的真菌ITS引物 为： ITS1 :5' -TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'， ITS4 :5' -TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'、 鉴定蔓枯病菌株特异性引物为： DB17F :5' -GCAGTCAATCCTTATCC-3'， DB17R:5 ' -CGAAAGATTGTGTGACC-3 '， 绿色荧光蛋白基因的特异性引物为： GFP-F :5' -ACGGCAAGCTGACCCTGAAG-3'， GFP-R :5' -CTCGTCCATGCCGAGAGTGA-3'。
【专利摘要】一种绿色荧光蛋白标记蔓枯病菌的方法，包括如下步骤：(1)蔓枯病菌菌株分生孢子液的制备；(2)制备含有GFP基因的农杆菌菌液；(3)蔓枯病菌株的GFP基因转化标记；(4)对标记有绿色荧光蛋白GFP的蔓枯病菌株进行鉴定；(5)获得带有绿色荧光蛋白标记GFP的蔓枯病菌株。本发明以蔓枯病菌株GSB20为转化体，利用农杆菌介导的遗传转化方法将绿色荧光蛋白基因标记蔓枯病菌株GSB20基因组，获得标记绿色荧光蛋白的蔓枯病菌菌株GSB20-GFP。
【IPC分类】C12N15-80, C12R1-645
【公开号】CN104531750
【申请号】CN201410817214
【发明人】姚协丰, 羊杏平, 李苹芳, 张曼, 徐锦华, 刘广
【申请人】江苏省农业科学院
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月24日