专利名称：荧光标记大麻性别基因特异片段检验系统及方法
技术领域：
本发明涉及基因特异片段检验系统及方法，具体涉及大麻性别基因特异片 段检验系统及方法。
背景技术：
大麻是一种古老的栽培植物，是世界上许多国家重要的经济作物，但因其 含有毒性成分——四氢大麻酚(THC)和大麻二醇(CBD)，已被联合国禁毒公 约列为毒品。大麻为雌雄异株植物，雄性植株中不含THC和CBD或含量很少， 雌性植株二者含量则相对较高，因此认为雌性植株具有药用价值和作为毒品的 滥用潜力。然而大麻雌雄植株在幼苗时期难以区分，只有当植株开花后才能辨 认，从而错过了铲除毒品原植物的最佳时期。因此大麻性别的鉴别、特别是早 期鉴别对于打击毒品犯罪具有重大意义。
随着科学技术的发展，大麻性别检验技术也在飞速发展，早期是通过大麻 外部形态及生理生化特征的差异鉴别大麻性别，相继发展到由细胞水平的差异 和目前在DNA分子水平上研究大麻性别。从上世纪90年代至本世纪初国内外 学者用扩增片段长度多态性(AFLP)或随机扩增多态性DNA (RAPD)技术 对大麻性别进行鉴定，找到了相应的大麻性别的AFLP标记和RAPD标记并进 行了序列测定或转化为可靠性稳定性更好的SCAR(sequence characterized amplified regions)标记。这些DNA分子标记技术应用于雌雄异株植物的性别鉴 别，相对于形态及生理生化特征的鉴别提高了鉴别结果的准确性和可靠性。
RAPD标记技术是Williams等(19卯)提出的，其原理是用含有10个碱基随 机序列组成的寡核苷酸做引物，通过PCR扩增获得长度不同的多态性DNA片 段。它具有设计引物无须知道序列信息，不需要DNA探针，合成一套引物，可 用于不同生物，技术简便，成本较低等优点。由于这些优点，使该技术在动植 物及人类基因定位和作图研究中都得到了广泛的应用。如在大麻性别研究中 Sakamoto等(1995)用15个随机引物扩增得到一条700 bp的雄性特异带；Hong Shao等(2003)用15个随机引物对大麻雌雄株进行了 RAPD分子标记，其中有一个引物扩增出雌株特异条带，找到了与雌性相关的特异标记。但RAPD标记 技术的实验重复性差，每个标记提供的信息量少，不能鉴别杂合子和纯合子， 检测受反应条件的影响较大，结果可靠性低。
AFLP标记技术是由Zabeau和Vos于1993年创立的，该技术结合了 RFLP 技术和RAPD技术的特点，使用人工接头(adaptor)与基因组DNA限制性内切酶 酶切片段连接并以此为DNA模板，合成系列3， 一末端，随机变化三个碱基且 与人工接头系列互补PCR引物进行特异条件扩增，通过变性PAGE电泳检测后 可获得多态性图谱，AFLP技术革新是继RFLP、 SSR和RAPD之后近几年来， 发展最快的DNA分子标记技术，在农业、林业、畜牧业、渔业、医学等生命科 学领域中正得到广泛应用。如在大麻性别研究中Giuseppe等(2002)对雄和雌 的BSA(bulked segregant analysis)进行AFLP分析，表明大麻雄性染色体的存在。 V.M.Cristiana Molitemil (2004)利用意大利的雌雄异株栽培种大麻品种 Fibranova，对大麻的性别差异进行了形态学及分子生物学研究。但AFLP技术 需进行酶切位点和构建人工接头等，前期技术建立较复杂。
SCAR分子标记是1993年由Paran和Michelmore提出的基于PCR技术的单 基因位点多态性遗传标记，SCAR分子标记是在序列未知的DNA标记(RAPD， AFLP等)基础上，对其特异产物进行回收、克隆和测序，根据扩增产物的碱基 序列重新设计特异引物，并以此引物对基因组DNA进行PCR扩增获得。新的 SCAR引物一般是在原来标记引物的基础上延长了 IO个左右碱基，不仅加强了 与模板的特异性结合，而且提高了退火温度，提高了转化后新标记检测的专一 性。SCAR具有已知序列，标记共显性且简单易用、重复性好等优点。如Otto T6rjek等(2002)利用20条RAPD引物对雌雄异株和雌雄同株大麻栽培种进 行分子标记，其中有2个引物产生了与雄性植株的特异带。将这两条带进行了 分离、克隆和测序，并转换为了SCAR标记，通过F2检测这两个标记与雄性表 现型紧密连锁，通过F2的遗传分析确定它们在Y染色体上。
从检测的角度来看，AFLP标记、RAPD标记和SCAR标记在国内主要采用 聚丙烯酰胺凝胶电泳银染技术或琼脂糖电泳EB染色技术分析，相对于可应用荧 光毛细管电泳技术检测的荧光标记大麻性别特异片段检验系统具有操作步骤多、耗时、灵敏度低，丙烯酰胺、EB染料试剂等对实验人员健康和环境等危害
较大，对实验操作人员技术水平要求较高等缺点。特别是AFLP标记和RAPD 标记的电泳图谱的谱带较多，结果不简单易判，给检验人员在分析识别时造成 了一定的难度，可能造成误判或漏判，这是法庭科学鉴定中的最严重的错误。
发明内容
有鉴于此，为了克服现有AFLP标记、RAPD标记和SCAR标记的上述缺 点，本发明提供一种操作简单、检验时间短、结果可靠直观、扩增片段长度短 的大麻性别基因检验系统及方法。
本发明提供一种荧光标记大麻性别基因特异片段检验系统，其中，所述检 验系统是以荧光标记的DM016为雄性引物、以荧光标记的DM029为雌性引物、 并以待测大麻DNA为模板的PCR反应系统，其中所述引物序列如下
DM016: (F) 5'FAM画GCCCAAGTTGCTGCTGAG3， (R) 5，CCCACCGTTTAGGGAGCA3'
DM029: (K) 5,FAM-AGCCTGTCTAAGAGTGGG3， (R) 5'ACGTTGTTGCTCGTAAAT3，
本发明通过以待测大麻DNA为模板、以荧光标记的DM016为雄性引物、以 荧光标记的DM029为雌性引物的PCR反应系统，成功的扩增出可用于大麻性别 鉴定的长度较短的基因片段，此方法操作简单、检验时间短、结果可靠直观。
本发明还提供上述检验系统的检验方法，其中
PCR反应体系的初始变性条件92-98'C， 2-11分钟；
变性条件91-97°C， 30秒钟-2分钟
退火54-66 °C, 30秒钟-2分钟，30循环；
延伸条件69-75匸，l分钟；
终延伸72"C,2分钟;
保温4'C维持
PCR扩增产物经电泳测得各产物的片段长度，得到待测植物性别检测结果。
其中优选条件为
PCR反应体系的初始变性条件95°C， 11分钟；变性条件94。C，30秒钟； 退火6(TC，30秒钟，30循环； 延伸条件72'C，1分钟； 终延伸72"C，2分钟； 保温4'C维持。
所述电泳采用荧光毛细管电泳技术检测。
大麻是雌雄异株植物，其为二倍体，染色体数20条，18条为常染色体，2 条为性染色体，大麻的性别主要由遗传物质决定，含有一个X和一个Y染色体 的植株一般为雄株，含有两个X染色体的植株一般为雌株，但受环境等因素的 影响，大麻的性别又表现出具有一定的可变性。
本发明检测毒品植物大麻基因组中性染色体上的特异片段，是用聚合酶链 反应在一个反应中使用荧光标记引物同时扩增两个特异DNA片段来进行大麻的 性别和初步的种属鉴定。
本发明以GENEBANK中的大麻X、 Y染色体上的DNA序列为基础设计多 对引物，经过大量试验挑选出具有对大麻性别特异型、扩增效率和特异性高的 雄雌性引物各一对。实验表明该对引物具有组织同一性，在区分大麻雄性和雌 性植株方面具有良好的表现特征，并且在对大麻近亲植物和大麻类毒品中经常 参杂的植物桑、谷子、烟草、苜蓿、水稻、罂粟的种属检验中表现出种属特 异性。
本发明提供的同时鉴别雌、雄性大麻的荧光标记大麻X、 Y染色体引物的复 合扩增体系，将用于复合扩增分析的大麻雄、雌性寡核苷酸引物混合在同一个 试管内。复合扩增体系中的大麻性别片段被位于该基因两侧的一对引物扩增， 其中每对引物中有一条引物的5'端进行FAM荧光标记。扩增产物为129个碱基 和238个碱基，控制在300个碱基以内，实现对高度降解、腐败检材(如大麻 烟、大麻脂)的检测。大麻雄、雌性植株检测结果见图3。
本发明首先在国内研制出大麻性别片段、并在单一反应中复合扩增的荧光 标记复合扩增体系。为毒品原植物大麻的早期性别鉴别、为禁毒铲毒、维护社 会稳定提供了 一个有力的工具。经过研究筛选出的DM016和DM029两对性别鉴定引物组合，其中DM016 的扩增片段是238bp， DM029的扩增片段是129bp，目的片段相差lOObp左右， 适合用同一种荧光标记，并且扩增产物片段较小实现了高灵敏度和检测抗腐败 样品的目的。两者在实验中的最佳退火温度均是60°C，引物间无稳定的二聚体 或发夹结构，其复合扩增效率高，灵敏度强，能够满足大麻性别鉴别的需要。 大麻雄、雌性植株检测结果见图3。
本发明在国内首先研制出大麻雄、雌性特异片段的荧光复合扩增检测体系， 其所使用的毛细管电泳检测设备在全国大多数法医DNA实验室都已装备，较易 推广和应用于全国毒品原植物大麻的早期性别鉴别和禁毒铲毒的实际案件中。
用DM016、 DM029两对引物分别对内蒙、山西、甘肃、新疆、云南、贵 州、安徽等八个不同产地的大麻雄、雌性样本进行扩增并测序，八个产地雄、 雌性大麻的扩增片段大小一致。测序结果表明雄性扩增片段序列与GENEBANK 中提供的序列比对一致，说明扩增片段在大麻植物中具有很好的稳定性。雌性 扩增产物在扩增片段的第30个碱基与GENEBANK中的碱基不同，存在突变， 但不影响结果判定。
在对大麻近亲植物和大麻类毒品中经常参杂的植物桑、谷子、烟草、苜 蓿、水稻、罂粟的种属检验中本复合扩增体系结果表现出种属特异性。
本发明的检验系统适合中国范围内种植的大麻。
图1大麻性别种属特异性检测结果(琼脂糖电泳) 从左至右依次为Kb为空白对照；
l一7:桑、谷子、烟草、苜蓿、水稻、罂粟、大麻雄性样本； 图2大麻性别种属特异性检测结果(荧光电泳)
从上至下依次为l雌性大麻；2雄性大麻；3小麦；4桑叶;5烟叶;6核 桃叶；7月季叶；8柿子叶； 图3使用荧光标记大麻性别特异片段检验系统对大麻雄、雌性植株检测结 果(3100基因分析仪电泳)； 从上至下依次为大麻雌性样本、大麻雄性样本-,图4使用荧光标记大麻性别特异片段检验系统对大麻烟检测结果(横坐标 为碱基数、纵坐标为相对荧光强度)； 本发明的有益效果如下
1、 灵敏度好，利于检验涉毒案件中常遇到的腐败干枯检材。
2、 准确率高
采自不同产地的336份大麻样本，经过检测和数据统计并分析基因型和表 型一致率达到95%以上。
3、 具有种属特异性
在对大麻近亲植物和大麻类毒品中经常参杂的植物桑、谷子、烟草、苜
蓿、水稻、罂粟的种属检验中表现出种属特异性(图l、图2)。
具体实施例方式
在下面的实施例中进一步说明了本发明，这并不限制本发明的范围。
实施例
使用荧光标记大麻性别特异片段检验系统对宁夏回族自治区固原市禁毒支 队缴获的大麻烟进行检验。
一、以硅珠法提取大麻烟样品中的DNA，使用试剂和具体操作如下
1、试剂配制
Tris/NaCl (TES)消化缓冲液100mM Tris-HCL， 500mMNaCl， 2%SDS， 50mMDTT， 0.25mg/mL Proteinase K, lOmMEDTA， PH 8.0
吸附液12g GuSCN溶于10mL 0.1M Tris-HC1(PH6.4)，加入0.8mL 0.5M EDTA(PH 8.0)和0.5mLTriton-X100
漂洗液1: 12g GuSCN溶于10mL O.IM Tris-HC1(PH6.4)
漂洗液2: 50mM Tris-HCL， 10mMEDTA， 0.15mM NaCl(PH6.5)。用时取 30mL加入无水乙醇70rnL。
硅珠悬浮液lmL去离子水加入0.06g硅珠。
2、 DNA提取步骤
1 )取大麻烟约50mg研磨成粉末转移至1.5mL离心管中加入400^L Tris/NaCl (TES)消化缓冲液，56'C消化2小时，期间每半小时震荡混匀一次。2) 消化完毕后13000rpm离心2分钟，取上清液300pL置于新1.5mL离心 管中，加入三倍体积的吸附液，震荡混匀，56。C保温15分钟。
3) 取出离心管5000rpm离心15分钟，将上清液转移到另一新1.5mL离心 管中，加入硅珠悬液40uL,混匀后吸附1小时，期间每10分钟混匀一次。
4) 将离心管5000rpm离心10分钟，弃去上清液。加入500uL漂洗液1连 同硅珠转移到新1.5mL离心管中，5000rpm离心IO分钟，弃去上清液。
5) 加入500uL漂洗液2，震荡洗涤，5000rpm离心IO分钟，弃上清废液。 重复此步骤两次。
6) 打开离心管盖，室温下挥发干燥硅珠10 15分钟。
7) 加入TE缓冲液50uL， 56°。孵育15分钟，其间振荡1次。
8) 12000rpm离心2分钟，取上清进行后续PCR反应或4。C保存备用。 二、使用荧光标记大麻性别特异片段检验系统进行PCR反应。
1、 PCR反应体系
总体系 25
去离子水 13.6pL
10xPCR GOLD Buffer 2.5|iL
dNTP(2.5醒ol/L;) 2.0(xL
Mg2+(25mmol/L) 2单
雄性Primer(5^imol/L) 各LO(xL
雌性Primer(5拜ol/L) 各0.85^L
Taq Gold DNA聚合酶5U^iL 0.2pL
模板DNA l.OpL
2、 PCR反应循环程序
1) 将PCR扩增管置于热循环仪上。
2) 使用下面推荐的程序进行热循环。
AB公司9600和9700热循环仪的扩增程序: 初始变性条件为95°C， ll分钟;
变性条件为94°C， 30秒钟；退火条件为6CTC， 30秒钟，30循环； 延伸条件72°C， l分钟； 终延伸72°C， 2分钟； 保温4t:维持；
3)扩增后的样品应尽快检测，否则应密封避光保存在-2(TC。
三、 扩增产物用ABI PRISM 3100遗传分析仪检测
1、 按1: 100比例混合内标(LIZ-500, AB公司)和去离子甲酰胺配制成 上样混合物，振荡混合均匀。
2、 向96孔板的每孔中加入15pL上样混合物和lpL扩增产物，快速离心， 避免产生气泡。
3、 95。C变性3分钟，立即放在冰上冷却3分钟，之后将96孔板置于ABI PRISM 3100遗传分析仪中尽快电泳。
四、 检验结果
使用3100型遗传分析仪对PCR扩增产物电泳检测后，采用GeneMapper ID3.2 (AB公司)软件分析后得到各产物的片段长度(图4)。
获得结果证明所缴获的大麻烟均是由雌性大麻植株制备而来，说明此大麻 烟是有组织的种植、与办案单位侦查结果相一致。
权利要求
1.一种荧光标记大麻性别基因特异片段检验系统，其特征在于所述检验系统是以荧光标记的DM016为雄性引物、以荧光标记的DM029为雌性引物并以待测大麻DNA为模板的PCR反应系统，其中所述引物序列如下DM016(F)5’FAM-GCCCAAGTTGCTGCTGAG3’ (R)5’CCCACCGTTTAGGGAGCA3’DM029(F)5’FAM-AGCCTGTCTAAGAGTGGG3’ (R)5’ACGTTGTTGCTCGTAAAT3’。
2. 根据权利要求1所述的检验系统的检验方法，其特征在于 PCR反应体系的初始变性条件92-98°C， 2-11分钟； 变性条件91-97。C,30秒钟-2分钟；退火54-66°C, 30秒钟-2分钟，30循环; 延伸条件:69-75。C， 1分钟； 终延伸72。C，2分钟； 保温4'C维持；PCR扩增产物经电泳测得各产物的片段长度，得到待测植物性别检测结果。
3. 根据权利要求2所述的检验系统的检验方法，其特征在于 PCR反应体系的初始变性条件95i:，ll分钟； 变性条件94。C,30秒钟;退火6CTC， 30秒钟，30循环; 延伸条件72"C,1分钟； 终延伸72i:，2分钟； 保温4'C维持；PCR扩增产物经电泳测得各产物的片段长度，得到待测植物性别检测结果。
4. 根据权利要求2、 3所述的检验系统的检验方法，其特征在于 所述电泳采用荧光毛细管电泳技术。
全文摘要
本发明提供一种荧光标记大麻性别基因特异片段检验系统，其中，所述检验系统是以荧光标记的DM016为雄性引物、以荧光标记的DM029为雌性引物并以待测大麻DNA为模板的PCR反应系统。本发明同时提供该检验系统的检验方法。
文档编号G01N21/64GK101525666SQ200910081869
公开日2009年9月9日 申请日期2009年4月14日 优先权日2009年4月14日
发明者涛 冯, 政 凃, 季安全, 颖 张, 张贵芹, 彭建雄, 徐小玉, 董林芳, 黎 裴, 佳 郭 申请人:公安部物证鉴定中心