蛋白cd38在制备类风湿性关节炎诊断标记物中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种新的类风湿性关节炎诊断标记物——蛋白CD38。本发明的 申请人:通过流式细胞实验证明，与正常人相比，RA患者外周血淋巴细胞中CD38+细胞高表达，且其表达水平与RF水平显著相关。此外，流式检测结果显示，CD38+CD56+细胞亚群的比例也明显升高，而CD56是自然杀伤细胞（NK细胞）的细胞表面标志物，这提示CD38在RA自身免疫紊乱中起到重要作用，可以作为类风湿性关节炎诊断标记物。一种用于检测类风湿性关节炎的试剂盒，由FITC标记的CD3、CD4单克隆抗体，PE标记的CD56单克隆抗体及Percp-Cy5.5标记的CD38单克隆抗体组成。
【专利说明】蛋白CD38在制备类风湿性关节炎诊断标记物中的应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及蛋白⑶38在作为/制备类风湿性关节炎诊断标记物中的应用。
【背景技术】
[0002]类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是一种自身免疫疾病,发病率为千分之三点五。目前，临床都是通过检测患者外周血中的类风湿因子(rheumatic factor,RF)和抗瓜氨酸化自我免疫抗(ant1-CCP)为RA提供临床诊断依据。由于检测RF和anti_CCP的手段均基于抗原抗体特异性结合的ELISA技术，因此，实验步骤多、耗时长、假阳性率高。另外，由于我国无上述两检测标志物的知识产权，该试剂盒市场价格4000余元，医院每人份的检测费用200?260余元。
[0003]RA主要病变部位为关节滑膜。本发明的 申请人:用蛋白质组学方法对RA滑膜蛋白质谱进行了检测。通过与骨关节炎(OA)和强直性脊柱炎(AS)滑膜相比较，发现蛋白CD38在RA滑膜中特异性高表达。⑶(Cluster of Differentiation)中文为白细胞分化抗原,可作为各类白细胞的细胞表面标记物。CD38分子分布于不成熟的造血细胞和活化的T、B淋巴细胞、NK细胞的细胞表面，在细胞活化、黏附活性、信号转导、细胞因子产生等过程中起着重要的作用。近来研究发现，CD38功能丧失与免疫应答损伤、代谢紊乱密切相关，可能参与自身免疫性疾病的发病过程。RA滑膜中含有大量T细胞和B细胞及其它淋巴细胞，因此 申请人:检测出特异表达的⑶与RA组织病理学相一致的。
[0004]根据以上发现，本发明的 申请人:采用流式细胞术继续对RA患者外周血的⑶38淋巴细胞亚群进行检测分析，希望能够深入了解⑶38在RA患者外周血及滑膜中的表达情况，进一步了解RA发病的免疫机理和潜在的临床用途。流式细胞仪(英文名称:flowcytometer ;FCM)技术是将流体喷射技术、激光技术、能谱术技术、电子计算机等技术与显微荧光光度计密切结合的一种先进的检测技术。流式细胞仪通过测量细胞及其他生物颗粒的散射光和标记荧光强度，可以高速分析成千上万个细胞，并能同时对一个细胞中多个细胞特征参数进行定性或定量分析。由于流式细胞仪具有速度快、精度高、准确性好、操作简便等特点，目前县区级及以上医院大都配备该设备用于对患者外周血进行检测。通过对各类细胞表面标记物尤其是各类CD的分析，流式细胞仪可以检测肿瘤细胞、白血病淋巴瘤细胞、活化血小板、造血干细胞的细胞数量、比例，还可以对这些细胞进行免疫分型。流式细胞仪是常见的、低成本和快速的检测方法。
【发明内容】
[0005]针对上述现有技术，本发明提供了一种新的类风湿性关节炎诊断标记物——蛋白CD38，本发明还提供了以蛋白CD38为细胞标记物制备的试剂盒及其在临床检测中的应用。
[0006]本发明的 申请人:通过流式细胞实验证明，与正常人相比，RA患者外周血淋巴细胞中⑶38+细胞高表达，且其表达水平与RF水平显著相关。此外，流式检测结果显示，⑶38+⑶56+细胞亚群的比例也明显升高，而⑶56是自然杀伤细胞(NK细胞)的细胞表面标志物，这提示⑶38在RA自身免疫紊乱中起到重要作用，有助于我们更清楚地了解RA发病的免疫机制和疾病活动状况。更重要的是， 申请人:发现CD38是很好的潜在的RA标志物，可用于该病的临床检测。鉴于上述理由，本发明的 申请人:发明了以CD38作为RA标记物的流式细胞临床诊断试剂盒。该试剂盒一改依托ELISA技术为基础的常用的RF和ant1-CCP检测试剂，利用流式细胞术方便、快捷、灵敏和低成本的优势。由于只需要一个CD38抗体和各医院均配备的流式细胞仪，检验价格可降至25?50元/每人份，检测时间也降至40分钟。
[0007]一种用于检测类风湿性关节炎的试剂盒，由FITC标记的⑶3、⑶4单克隆抗体，PE标记的⑶56单克隆抗体及Percp-Cy5.5标记的⑶38单克隆抗体组成。
[0008]进一步地，所述试剂盒中，各抗体的用量均为20 μ I。
[0009]所述试剂盒，在应用时，使用方法为:取待检测者的200μ I外周血以及相应流式抗体各20 μ I置流式上样管中，4°C避光孵育30min,利用Q-Prep WorkstationCBeckman公司，美国)进行血液标本制备后置FACSAria?II流式细胞仪(BD Biosciences)上机检测。本发明进行了相关的实验研究，结果显示，RA患者外周血淋巴细胞中的CD38+细胞的比例为17.29±5.93%，健康人外周血淋巴细胞中的⑶38+细胞的比例为10.15±3.3%，RA患者外周血淋巴细胞中⑶38+细胞的比例明显高于健康人(p=l.92E-09)。在其他指标中，RA组患者外周血中⑶38+⑶56+细胞的比例为8.04± 5.26%，健康人者周血中的⑶38+⑶56+细胞的比例为0.0556±0.0264%，RA患者外周血淋巴细胞中的⑶38+⑶56+细胞的比例明显高于健康人(p=0.007)。因此，通过本发明的实验的结果，可以确信蛋白⑶38可作为类风湿性关节炎诊断标记物进行应用，检测诊断标准为:若患者外周血淋巴细胞中的CD38+细胞的比例高于15%，则被检测患者应诊断为患有类风湿性关节炎。
[0010]本发明基于发现通过流式细胞术可检测出⑶38在RA外周血中高表达，提供了一种新的类风湿性关节炎诊断标记物一一蛋白⑶38，还提供了一种以蛋白⑶38为细胞标记物的试剂盒，具有简便、快速、成本低等优点。
【具体实施方式】
[0011]下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0012]实施例1通过流式细胞术检测⑶38在RA外周血中的表达
[0013]本发明的 申请人:对103位20?74岁的RA患者进行静脉穿刺采集血液标本，其中75人为女性。外周血被采集至EDTA-K2抗凝的真空采血管。所有患者的选取符合美国风湿病学会(American College of Rheumatology, ACA)对RA的诊断标准:患者关节均存在三年以上的慢性炎症，其红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate, ESR)、C反应蛋白(C-reactive protein, CRP)及类风湿因子(rheumatoid factor, RF)检测值均明显高于正常范围，分别为19?22mm/H，8?196U/ml及10.5?2，090U/ml。研究以包括80名女性在内的120位24?58岁的健康人为对照。
[0014]本发明的 申请人:取200 μ I外周血与相应流式抗体各20 μ I置流式上样管中，4°C避光孵育30min,利用Q-Prep Workstation (Beckman公司，美国)进行血液标本制备后置FACSAria?II流式细胞仪(BD Biosciences)上机检测。该实验中使用的流式抗体包括:FITC标记的CD3、CD4、CD22单克隆抗体(Beckman)，PE标记的CD56、CD25、CD19单克隆抗体(Beckman)及 Percp_Cy5.5 标记的 CD38 单克隆抗体(Biolegend)。[0015]本发明的 申请人:研究利用流式细胞法对RA患者及健康人外周血中的CD38及其他免疫标记物进行检测。结果发现，70%患者外周血淋巴细胞都高表达⑶38，RA患者外周血淋巴细胞中的⑶38+细胞的比例为17.29±5.93%，健康人外周血淋巴细胞中的⑶38+细胞的比例为10.15±3.3%，RA患者外周血淋巴细胞中⑶38+细胞的比例明显高于健康人(p=l.92E-09)。在其他指标中，RA组患者外周血中CD38+CD56+细胞的比例为8.04±5.26%，健康人者周血中的⑶38+⑶56+细胞的比例为0.0556±0.0264%，RA患者外周血淋巴细胞中的⑶38+⑶56+细胞的比例明显高于健康人(p=0.007)，表达上调较为明显。而在健康人中，几乎所有人淋巴细胞低表达CD38。流式检测结果详见表1。本发明的 申请人:也检测了 38例AS患者外周血中⑶38的表达，几乎所有AS患者淋巴细胞低表达⑶38，只有各两例AS患者外周血淋巴细胞中度表达⑶38。
[0016]本发明的 申请人:对RA患者外周血中⑶38表达水平与ESR，CRP和RF的关系也进行了研究，发现⑶38阳性细胞的表水平与RF水平成显著相关(p=0.026)，而与ESR(ρ=0.102)、CRP (ρ=0.112)的相关性不大。
[0017]表1.流式细胞术淋巴亚群分析结果
[0018]
【权利要求】
1.蛋白CD38在作为或制备类风湿性关节炎诊断标记物中的应用。
2.蛋白CD38在制备检测类风湿性关节炎的试剂盒中的应用。
3.一种用于检测类风湿性关节炎的试剂盒，其特征在于:由FITC标记的⑶3和⑶4单克隆抗体，PE标记的⑶56单克隆抗体，以及Percp-Cy5.5标记的⑶38单克隆抗体组成。
【文档编号】G01N33/68GK103513040SQ201310483384
【公开日】2014年1月15日 申请日期:2013年10月16日 优先权日:2013年10月16日
【发明者】常晓天 申请人:常晓天