一种诊断类风湿关节炎的microRNA分子标志物及其检测试剂盒的制作方法
【专利摘要】本发明提供用于诊断类风湿关节炎的9种microRNA(miRNA)分子标记物组合及其在检测试剂盒中的应用，利用这类miRNA分子标记物在类风湿关节炎患者血液中呈现异常表达来诊断类风湿关节炎，该miRNA标志物组合灵敏度和特异性高，取材方便，安全无创，为疾病早期诊断和监测病程提供重要依据。本发明还提供了用于诊断类风湿关节炎的试剂盒以及miRNA标志物在诊断试剂盒中的用途，其特征在于所述试剂盒包含用于检测血浆中9种miRNA组合以及检测这9种miRNA的试剂。
【专利说明】—种诊断类风湿关节炎的microRNA分子标志物及其检测试剂盒
【技术领域】
[0001]本发明属于生物技术诊断领域，涉及用于诊断类风湿关节炎的9种microRNA分子标记物组合及其应用。
【背景技术】
[0002]类风湿关节炎(Rheumatoid arthritis ；RA)是一类慢性,系统性的自身免疫性疾病，其主要病理改变为关节滑膜明显增厚并有大量炎症细胞浸润，血管翳形成以及软骨组织的侵蚀与破坏。一直以来，类风湿因子和抗环瓜氨酸蛋白抗体是美国风湿病协会诊断标准中的血清学指标，但敏感性和特异性均不高。目前仍不能阐明RA的发病机制及对疾病进行预测，因此找出疾病早期诊断和监测病程的生物标志物显得十分重要。
[0003]miRNA是一类长度约为22个核苷酸，参与基因转录后水平调控的非编码小分子RNA,具有高度保守性、时序性和组织特异性。由于miRNA参与机体的各种重要的生理和病理过程，近年来倍受关注。miRNA的出现让人们在对哺乳动物基因组的表达和功能的认识上发生巨大的改变。目前通过不同的实验方法和计算机检测已经证实了在193个物种中存在25141 个成熟 miRNA (miRBase database, versionl9.0, August, 2012)，到目前为止,在数据库中已经有1223个人类miRN。据估计，一个miRNA可能调控几百到几千个靶基因，因此大约30% -90%的人类基因受到miRNA的调节。miRNA的表达和功能对于不同生理系统的发育和细胞稳态以及机体功能的维持具有重要的作用，寻找疾病诊断的标志物对其准确诊断一直是医学研究领域的重点。miRNA可被分泌释放到细胞外，参与多种炎性和自身免疫性疾病的发病过程。组织细胞内外的miRNA表达图谱的差异使miRNA作为疾病诊断的潜在性生物标志。
【发明内容】
`
[0004]本发明的目的在于介绍一种用于检测RA的miRNA标志物组合，通过在miRNA的3’端加上一特异性的茎环引物，通过逆转录和荧光定量PCR的方法检测被检样本血浆中这些miRNA的含量，并与正常人血浆中相应miRNA的水平比较来诊断RA。
[0005]为实现上述目的，本发明的技术方案是:一组用于检测RA的miRNA标志物组合，为:miR-9-5p (Sj -ucuuugguuaucuagcuguauga-3>, SEQ ID N0.1)、miR-122_3p (5’ -aacgccauuaucacacuaaaua-3>,SEQ ID N0.2)、miR-219-2_3p(5’ -agaauuguggcuggacaucugu-3>,SEQID N0.3)、miR_4634(5’ -cggcgcgaccggcccgggg-3’，SEQ ID N0.4)、miR_181d(5’ -aacauucauuguugucggugggu-S’，SEQ ID N0.5)、miR-342_3p (5’ -ucucacacagaaaucgcacccgu-3>, SEQID N0.6)、miR-4764_5p (5’-uggauguggaaggaguuaucu-3’，SEQ ID N0.7)、miR_3926 (5’_uggccaaaaagcaggcagaga-3’，SEQ ID N0.8) > miR-3925-3p(Sj -acuccaguuuuaguucucuug-3>,SEQ ID N0.9)。
[0006]本发明的优点是:筛查出的miRNA的标志物组合用于诊断RA的特异性和灵敏度闻ο
[0007]miRNA标志物组合通过以下步骤得到:
[0008]第一步:芯片筛选:选取临床确诊的初发活动期的RA患者5例，健康体检者5例各采集血浆Iml以上使用miRCURY? LNAArray (versionl8.0)进行表达谱芯片筛选，得出在RA患者血浆中差异性表达的33种miRNA，其中22种miRNA升高，11种miRNA降低。
[0009]第二步:定量PCR初筛:选取临床确诊的RA患者18例，健康体检者14例，通过逆转录和荧光定量PCR的方法检测芯片筛选得出的33种差异性表达的miRNA，经过第一次PCR剔除Ct值高于35的miRNA,初筛得出22种miRNA。
[0010]第三步:定量PCR验证:选取临床确诊RA患者57例，健康体检者56例，使用上述相同的检测方法，通过差异性分析找出9种在RA患者血浆中差异性表达的miRNA。这九种miRNA的组合在诊断RA的特异性和灵敏度高。
[0011]本发明的再一目的是提供基于上述miRNA集合的检测试剂盒
[0012]技术方案是:一种类风湿关节炎的诊断试剂盒，包括以下成分:
[0013](l)miRNA标志物组合:9种用于诊断类风湿关节炎的miRNA标志物，其序列见SEQID N0.1-9 ；
[0014](2)提取 RNA 试剂:mirVanaTM PARIS kit(Ambion, AM1556);另外还包括cel-miR-39 和 cel-miR-238 的控制外参，序列分别为:5’-ucaccggguguaaaucagcuug_3’ (SEQ ID N0.10)和 5，-uuuguacuccgaugccauucaga-3，(SEQ ID N0.11);。
[0015](3)逆转录试剂:5 X Buffer、dNTP Mixture2.5mM> M-MLV ReverseTranscriptase200U/ μ 1、RNas`e Inhibitor40U/ μ 1、DEPC H2CKmiRNA 特异性逆转录莖环引物。
[0016](4)荧光定量PCR试剂:SYBR Green Mix、miRNA特异性前向引物、miRNA后向通用引物、DEPC H2O。
[0017]本发明的另一目的是基于上述miRNA标志物组合诊断试剂盒的检测方法。
[0018]技术方案是:茎环结构的逆转录引物约42-50个核苷酸，其5’端的36_40个核苷酸序列固定，形成一个茎环结构，其3’端的6-8个核苷酸与miRNA互补。荧光定量PCR的特异性前向引物长约25-32个核苷酸，在3’端有11-18核苷酸与对应的miRNA互补，后向通用引物约23nt，其中15-18个核苷酸对应特异的茎环结构。在miRNA的3’尾端加上茎环结构，通过逆转录及荧光定量PCR的方法来检测被检测者血浆中miRNA的含量并与正常人血浆中miRNA含量比较来诊断类风湿关节炎。
【专利附图】
【附图说明】
[0019]图1芯片筛选RA患者血浆中差异性表达的miRNA。
[0020]图2:miRNA标志物组合的诊断价值。
[0021]Logit(P)=0.964+0.045*miR-9_5p-0.367*miR-122_3p-0.191*miR-219-2_3p+0.083*miR-4634+l.146*miR-181d_3.572*342_3p+0.033*miR-4764_5p-0.313*miR-3926_0.6-16*miR-3925-3p
【具体实施方式】[0022]下面结合附图对上述技术方案做【具体实施方式】的说明。
[0023]总体实验方案如下:
[0024]收集就诊于江苏大学附属医院并经临床确诊的80例RA患者和75例正常健康体检者外周血2ml于EDTA-K2抗凝管，室温3000r/min离心IOmin,将上层血浆转移洁净1.5ml离心管，再以40C 16000Xg离心lOmin，吸取上层血浆于洁净1.5ml离心管，_80°C冻存备用。
[0025]1.芯片筛选组:选取临床确诊的5例初发活动期的RA患者，5例健康体检者各采集血浆Iml以上送往上海康成生物使用Exiqon公司使用miRCURY? LNAArray(versionl8.0)进行表达谱芯片筛选，经过聚类分析按照Fold Change > 1.5且P-value ( 0.05 筛选出 33 种候选 miRNA (22 种 miRNA 上升，11 种 miRNA 下降)。
[0026]2.定量PCR初筛组:选取临床确诊的RA患者18例，健康体检者14例，使用mirVana? PARIS kit (美国Ambion公司)提取RNA ;通过逆转录使用反转录试剂(美国Promega公司)进行逆转录；再使用SYBR Green (日本TaKaRa公司)进行突光定量PCR的方法检测33种候选miRNA。所有的miRNAs引物组合(miRNA特异性逆转录茎环引物、miRNA特异性前向引物和miRNA后向通用引物)购于中国广州RiboBio公司；剔除Ct≤35的miRNA,经过定量PCR初筛得出22种候选miRNA。
[0027]3.定量PCR验证组:选取临床确诊RA患57例，健康体检者56例，用相同的检测方法，通过差异性分析进一步筛选出9种在RA患者血浆中差异性表达的miRNA。
[0028]具体的实验方法和结果如下:
[0029]一:芯片筛选组
[0030]1.Exiqon microRNA 芯片筛选
[0031]1.1 样本 RNA 提取:使用 TRI reagent BD (MRCgene, TB-126), PolyacrylCarrier(MRCgene cat.n0.PC152), Acetic acid, Chloroform, Isopropanol, Ethanol,Nuclease-free water, Microcentrifuge (Termo)提取 RNA (RNA 质量报告见表 I)
[0032]表1.芯片筛选标本提取RNA质量(使用NanoDrop ND-1000检测)
[0033]
【权利要求】
1.一组用于诊断类风湿关节炎的miRNA标志物，其特征在于其序列如SEQ ID N0.1-9所示。
2.miRNA标志物组合的检测试剂盒,包括以下成分: (1)miRNA标志物组合:9种用于诊断类风湿关节炎的miRNA标志物，其序列见SEQ IDN0.1-9 ； (2)提取RNA试剂:包括cel-miR-39和cel-miR-238的控制外参，序列分别如SEQIDN0.10 和 SEQ ID N0.11 所示； (3)逆转录试剂:5X Buffer、dNTP Mixture2.5mM> M-MLV ReverseTranscriptase200U/ μ 1、RNase Inhibitor40U/ μ 1、DEPC H2CKmiRNA 特异性逆转录莖环引物； (4)荧光定量PCR试剂:SYBRGreen Mix、miRNA特异性前向引物、miRNA后向通用引物、DEPC H2O。
【文档编号】C12N15/113GK103805696SQ201310686940
【公开日】2014年5月21日 申请日期:2013年12月12日 优先权日:2013年12月12日
【发明者】焦志军, 王文红, 张莹莹, 朱波 申请人:焦志军, 王文红, 张莹莹