一种稳定荧光标记口腔鳞癌活细胞的方法
【专利摘要】本发明公开了一种稳定荧光标记口腔鳞癌活细胞的方法，该方法用荧光偶联的尼妥珠单克隆抗体对口腔鳞癌活细胞进行标记。本发明的方法可对口腔鳞癌活细胞进行稳定标记，从而可以进行口腔鳞癌活细胞的观察研究，丰富了研究人员的实验手段，拓展了相应的研究领域。
【专利说明】一种稳定荧光标记口腔鳞癌活细胞的方法
【技术领域】
[0001]本发明属于肿瘤分子影像【技术领域】，具体涉及一种稳定荧光标记口腔鳞癌活细胞的方法。
【背景技术】
[0002]口腔鳞状细胞癌(Oral squmaous cell carcinoma, OSCC)简称口腔鳞癌，为主要发生于口腔粘膜上皮等部位的恶性肿瘤，是头颈部常见的恶性肿瘤，约占口腔颌面部恶性肿瘤的90%-95%，常引起严重的口腔颌面畸形及咀嚼、吞咽和语言等功能障碍并威胁患者生命。口腔鳞癌的发病部位以舌部最多，其次以牙龈为多，此外，在颊粘膜、腭、口底等其它的口腔粘膜、以及颌骨、唾液腺上也有发生。
[0003]现有技术中对口腔鳞癌细胞的荧光标记主要是采用固定后的死细胞，虽然经固定的细胞形态完整，成像效果良好，但没有办法对口腔鳞癌细胞活细胞进行稳定的标记，从而无法进行口腔鳞癌活细胞的观察研究。
【发明内容】
[0004]本发明的目的在于克服现有技术缺陷，提供一种稳定荧光标记口腔鳞癌活细胞的方法。
[0005]本发明的技术方案如下:
[0006]一种稳定荧光标记口腔鳞癌活细胞的方法，用荧光偶联的尼妥珠单克隆抗体对口腔鳞癌活细胞进行标记。
[0007]在本发明的一个优选实施方案中，所述荧光偶联的尼妥珠单克隆抗体所用的荧光材料为近红外荧光材料Alexa680。
[0008]进一步优选的，包括如下步骤:
[0009](I)将近红外荧光材料Alexa680与尼妥珠单克隆抗体偶联；
[0010](2)将Alexa680偶联的尼妥珠单克隆抗体与的口腔鳞癌活细胞进行避光孵育后洗漆;
[0011](3)进行流式细胞仪检测和共聚焦显微镜检测。
[0012]进一步优选的，所述流式细胞仪检测的激发波长为633nm，发射滤片670LP。
[0013]进一步优选的，所述共聚焦显微镜检测的激发波长为633nm，发射滤片650LP。
[0014]在本发明的一个优选实施方案中，所述荧光偶联的尼妥珠单克隆抗体所用的荧光材料为量子点Qdot800。
[0015]进一步优选的，包括如下步骤:
[0016](I)将量子点Qdot800与尼妥珠单克隆抗体偶联；
[0017](2)将QdotSOO偶联的尼妥珠单克隆抗体与口腔鳞癌活细胞进行避光孵育后洗涤；
[0018](3)进行流式细胞仪检测和共聚焦显微镜检测。[0019]进一步优选的，所述流式细胞仪检测的激发波长为407nm，发射滤片780/60nm。
[0020]进一步优选的，所述共聚焦显微镜检测的激发波长为488nm，发射滤片650LP。
[0021]本发明的有益效果是:
[0022]1、本发明的方法用荧光偶联的尼妥珠单克隆抗体对口腔鳞癌活细胞进行稳定标记，从而可以进行口腔鳞癌活细胞的观察研究，丰富了研究人员的实验手段，拓展了相应的研究领域；
[0023]2、本发明的采用近红外荧光材料Alexa680和量子点Qdot800作为荧光标记材料与口腔鳞癌特异性单克隆抗体尼妥珠进行偶联，荧光强度高、标记特异性强，成像稳定且保存时间长；
[0024]3、本发明的方法操作简便快速，且成本低廉。
[0025]4、尼妥珠单克隆抗体(Nimotuzumab,h-R3,商品名泰欣生)是一种新的已临床应用的人源化抗EGFR单克隆抗体分子靶向药物，本方法可用于标记其它过表达EGFR的细胞。
【专利附图】
【附图说明】
[0026]图1为本发明实施例2的共聚焦显微镜照片之一(400 X )；
[0027]图2为本发明实施例2的共聚焦显微镜照片之二(1000 X )；
[0028]图3为本发明实施例4的共聚焦显微镜照片(1000X )。
【具体实施方式】
`[0029]以下通过【具体实施方式】结合附`图对本发明的技术方案进行进一步的说明和描述。
[0030]实施例1
[0031](I)按产品说明书操作,将近红外突光材料Alexa680 (invitrogen公司)与尼妥珠单克隆抗体(百泰公司)偶联，制备荧光标记的尼妥珠单克隆抗体探针(Alexa680 -Nim)；
[0032](2)取对数生长期的口腔鳞癌CAL27细胞消化后，倒置相差显微镜下计数，离心弃上清，加入PBS调整细胞密度至2 X IOVmL,然后将细胞悬液分至流式专用管中，100 μ L/管。
[0033](3)加入Alexa680 -Nim，使其在PBS中的终浓度为25 μ g/mL，4°C避光孵育半小时。
[0034](3)标记实验:分实验组和对照组
[0035]实验组:加入4161&680 -附111，使其在？85中的终浓度为25 4 8/1^，41:避光孵育半小时；
[0036]对照组:包括以下四组，其余处理及孵育条件与实验组相同
[0037]①PBS空白对照
[0038]②用Alexa68O 代替 Alexa68O - Nim,浓度 25 μ g/mL
[0039]③先将细胞用含尼妥珠单抗IuL的PBS100 μ L在4°C孵育半小时，PBS洗涤I次，再加入含 Alexa680 - Nim 的 PBS100 μ L,浓度 25 μ g/mL
[0040]④小鼠骨骼肌成肌细胞系C2C12加入Alexa680 - Nim,浓度25 μ g/mL ；
[0041](4)将上述各组分别用PBS洗涤细胞2次，1300rpm离心5分钟，重悬于500 μ L PBS中。[0042](5) Beckman流式细胞仪检测，激发波长633nm，发射滤片670LP，配套软件进行结果分析，结果显示在25 μ g/mL的低浓度下，Alexa680-Nim即可对CAL27细胞达到很高的的标记率(> 98%)，对照组均未检测到明显的荧光。表明Alexa680-Nim对口腔鳞癌细胞CAL27细胞的标记特异性很强，标记率很高。
[0043]实施例2
[0044](I)按产品说明书操作，将近红外荧光材料Alexa680与尼妥珠单克隆抗体偶联，制备突光标记的尼妥珠单克隆抗体探针(Alexa680 - Nim)；
[0045](2)生长良好的CAL27细胞消化后传代于直径35mm、中央玻底孔径IOmm的玻底培养皿中，2 — 3天后细胞生长至70 - 80%。
[0046](3)标记前12小时，将待用细胞培养液换为无血清培养液，标记前轻轻吸去培养基，PBS洗涤2次。
[0047](4)于中央的玻底孔加入含Alexa680_Nim的无血清培养基50uL，浓度100 μ g/mL，4°C避光孵育半小时。
[0048](5)取出细胞，吸去液体，PBS洗涤3次，加入少量PBS，共聚焦显微镜下观察。
[0049](6)共聚焦显微镜观测条件:激发波长633nm，发射滤片650LP。结果如图1和图2所示，可检测到荧光定位主要定位在胞膜上，胞浆内有极少量荧光，胞核里没有，与EGFR表达部位一致。而对照组同样操作则均未检测到明显的荧光(对照组设计同实施例1)。表明Alexa680-Nim标记的尼妥珠单抗荧光探针可以特异性的标记CAL27细胞表达的EGFR，特异性很强，标记率很高。
[0050]实施例3
[0051](I)按产品说明书操作，将量子点Qdot800 (invitrogen公司)与尼妥珠单克隆抗体(百泰公司)偶联，制备荧光量子点尼妥珠单克隆抗体探针(QdotSOO -Nim)；
[0052](2)取对数生长期的口腔鳞癌CAL27细胞消化后，倒置相差显微镜下计数，离心弃上清，加入PBS调整细胞密度至2 X IOVmL,然后将细胞悬液分至流式专用管中，100 μ I/管，按以下设计分别加入不同量的实验试剂至流式管中；
[0053](3)标记实验:分实验组和对照组
[0054]实验组:加入Qdot800 - Nim，使其在PBS中的终浓度为20nmol/L，4°C避光孵育半小时；
[0055]对照组:包括以下四组，其余处理及孵育条件与实验组相同。
[0056]①PBS空白对照
[0057]②用Qdot800 代替 Qdot800 - Nim,浓度 20nmol/L
[0058]③先将细胞用含尼妥珠单抗IuL的PBS100 μ L在4°C孵育半小时，PBS洗涤I次，再加入含 Qdot800 - Nim 的 PBS100 μ L,浓度 20nmol/L
[0059]④小鼠骨骼肌成肌细胞系C2C12加入Qdot800 - Nim,浓度20nmol/L ；
[0060](4)将上述各组分别用PBS洗涤细胞2次，1300rpm离心5分钟，重悬于500 μ L PBS中；
[0061](5) BD流式细胞仪上机检测，激发波长407nm，发射滤片780/60nm，配套软件进行结果分析。结果显示:在20nmol/L的低浓度下，Qdot800 - Nim即可对CAL27细胞达到很高的的标记率(> 99%)，荧光强，对照组则不能检测到荧光，表明Qdot800 -Nim对口腔鳞癌细胞CAL27细胞的标记特异性很强，标记率很高。
[0062]实施例4
[0063](I)按产品说明书操作,将量子点Qdot800 (invitrogen公司)与尼妥珠单克隆抗体(百泰公司)偶联，制备荧光量子点尼妥珠单克隆抗体探针(QdotSOO -Nim)；
[0064](2)生长良好的CAL27细胞消化后传代于直径35mm、中央玻底孔径IOmm的玻底培养皿中，2 — 3天后细胞生长至70 - 80%。
[0065](3)标记前12小时，将待用细胞培养液换为无血清培养液，标记前轻轻吸去培养基，PBS洗涤2次。
[0066](4)于中央的玻底孔内加入含Qdot800 -Nim的无血清培养基50uL，浓度IOOnmol/L，4°C避光孵育半小时。
[0067](5)取出细胞，吸去液体，PBS洗涤3次，加入少量PBS，共聚焦显微镜下观察。
[0068](6)共聚焦显微镜观测条件:激发波长488nm，发射滤片650LP。结果如图3所示，CAL27细胞胞膜、胞浆中表达的EGFR被明亮的荧光所标记呈现。量子点的非特异性吸附非常低，对照组几乎观察不到荧光(对照组设计同实施例3)。实验结果证明，QdotSOO标记的尼妥珠单抗荧光探针可以特异性的标记CAL27细胞表达的EGFR，标记效果好。
[0069]以上所述，仅为本发明的较佳实施例而已，故不能依此限定本发明实施的范围，SP依本发明专利范围及说明书内容所作的等效变化与修饰，皆应仍属本发明涵盖的范围内。
【权利要求】
1.一种稳定荧光标记口腔鳞癌活细胞的方法，其特征在于:用荧光偶联的尼妥珠单克隆抗体对口腔鳞癌活细胞进行标记。
2.如权利要求1所述的一种稳定荧光标记口腔鳞癌活细胞的方法，其特征在于:所述荧光偶联的尼妥珠单克隆抗体所用的荧光材料为近红外荧光材料Alexa680。
3.如权利要求2所述的一种稳定荧光标记口腔鳞癌活细胞的方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)将近红外荧光材料Alexa680与尼妥珠单克隆抗体偶联； (2)将Alexa680偶联的尼妥珠单克隆抗体与口腔鳞癌活细胞进行避光孵育后洗涤； (3)进行流式细胞仪检测和共聚焦显微镜检测。
4.如权利要求3所述的一种稳定荧光标记口腔鳞癌活细胞的方法，其特征在于:所述流式细胞仪检测的激发波长为633nm，发射滤片670LP。
5.如权利要求3所述的一种稳定荧光标记口腔鳞癌活细胞的方法，其特征在于:所述共聚焦显微镜检测的激发波长为633nm，发射滤片650LP。
6.如权利要求1所述的一种稳定荧光标记口腔鳞癌活细胞的方法，其特征在于:所述荧光偶联的尼妥珠单克隆抗体所用的荧光材料为量子点QdotSOO。
7.如权利要求6所述的一种稳定荧光标记口腔鳞癌活细胞的方法，其特征在于:包括如下步骤: (1)将量子点Qdot800与尼妥珠单克隆抗体偶联； (2)将QdotSOO偶联的尼妥珠单克隆抗体与口腔鳞癌活细胞进行避光孵育后洗涤； (3)进行流式细胞仪检测和共聚焦显微镜检测。
8.如权利要求7所述的一种稳定荧光标记口腔鳞癌活细胞的方法，其特征在于:所述流式细胞仪检测的激发波长为407nm，发射滤片780/60nm。
9.如权利要求7所述的一种稳定荧光标记口腔鳞癌活细胞的方法，其特征在于:所述共聚焦显微镜检测的激发波长为488nm，发射滤片650LP。
【文档编号】G01N33/533GK103675262SQ201310741811
【公开日】2014年3月26日 申请日期:2013年12月27日 优先权日:2013年12月27日
【发明者】步荣发, 黄雪蕾 申请人:步荣发, 黄雪蕾