专利名称：酶功能化纳米免疫标记物的制备方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种酶功能化纳米免疫标记物的制备技术，特别涉及了由辣根过氧 化物酶(HRP )和第二抗体(Ab2 )共修饰的二氧化硅樣i球免疫标记物的制备方法， 以及利用该酶功能化纳米免疫标记物进行低浓度生物分子检测的电化学方法。
二背景技术：
现有技术随着生物技术的发展以及生物信息学领域的进步，使得目前的临 床早期诊断、疗效观察及预后监测方法越来越完善，发现了许多具有特定靶向的 分子标志物。然而，在疾病的发生发展初期，这些肿瘤相关抗原或肿瘤标志物的 表达水平很低，或者产生一些其他特定的细胞因子，但由于检测方法与灵敏度和 检测限的限制而难以实现疾病的早期诊断。因此发展新的检测方法和技术，实现 血清中肿瘤相关性抗原的灵敏、准确4全测，对于研究疾病的发生、发展和疾病的 早期预警和诊断，对于疾病临床诊断、治疗和预后等具有重要的意义。
过氧化物酶，比活性高，稳定，分子量小，且纯酶容易制备，因此在临床4全 验中得到广泛使用，以HRP标记的抗体已经用于酶联免疫和化学发光免疫检测， 但是当生物分子浓度非常低时，其检测的灵敏度就受到了限制。因此，需要在此 基础上寻找将酶的催化信号放大的方法。已有多种生物和纳米技术被用于生物分 子检测的信号放大，如聚合酶链反应(PCR)、酶催化作用、金属纳米颗粒和量子纳 米颗粒的信号放大等，这些方法需要特别仪器或技术来辅助检测，酶的放大作用 也易被环境污染和繁瑣的实验步骤所影响。因此，发现新的信号放大方法，并用 于分子识别与诊断新方法研究具有重要意义。本发明利用二氧化硅、球表面功能 化增加了酶的载荷量，制得了一种酶功能化纳米免疫标记物，实现了低浓度生物 分子的灵H准确4企测。
三
发明内容
技术问题本发明的目的是针对生物分子检测信号放大的关键问题，通过对
二氧化硅小球酶功能化，制得由HRP和生物分子共修饰，可用于低浓度生物分子
4检测且具有信号放大作用的复合纳米粒子标记物，并将其用于生物分子的灵敏检测。
技术方案-
一种酶功能化纳米免疫标记物制备方法，制备方法为利用二氧化硅纳米微 球表面羟基与GPMS发生硅烷化反应，在二氧化硅纳米微球表面嫁接环氧基团， 再利用该环氧基团与辣根过氧化物酶和anti-AFP分子中的活性氨基反应，将辣根 过氧化物酶和anti-AFP分子共固定在二氧化硅小球表面，用1% BSA封闭后得到 酶和抗体共i务饰的功能化纳米免疫标记物。
酶功能化纳米免疫标记物制备方法，制备步骤为称取0.2 g粒径为100±2 nm 的二氧化硅纳米微球，加入到5 mL 5wt% GPMS的曱苯溶液中，在室温下搅拌反 应24h,反应结束后，将二氧化硅微球离心分离，转速为12000 r/min,分别用曱 苯和无水乙醇清洗表面吸附的GPMS，然后在氮气保护下，加热至100。C烘干，得 到表面修饰有环氧基官能团的二氧化硅微球；取15 mg环氧基官能化的二氧化硅 微球，加入到450 1 mg/mL HRP和50 |aL 12.7 |ag/mL anti-AFP抗体的混合溶液 中，在4。C下搅拌反应24 h,离心分离后用含磷酸盐緩沖溶液清洗三次以除去吸附 态的HRP和anti-AFP抗体，然后，用500 nL质量分数为1% BSA处理上述修饰 后的二氧化硅微球3小时后得酶功能化纳米免疫标记物。
一种利用酶功能化纳米免疫标记物进行低浓度生物分子检测的夹心免疫检测 方法，夹心免疫检测过程为anti-AFP第一抗体修饰金电极的制备在洁净的金电 极表面修饰MUA/MU杂合单层，然后在EDC和NHS活化下与anti-AFP第一抗体 分子中的氨基反应，将anti-AFP第一抗体固定在金电极表面；基于酶功能化二氧 化硅纳米免疫标志物的夹心免疫方法将上步得到的anti-AFP第一抗体修饰金电 极在含有AFP抗原的磷酸盐緩冲溶液中浸泡捕捉溶液中游离的AFP抗原，然后将 其置于酶功能化二氧化硅纳米免疫标志物悬浮液中温育，将该免疫标志物嫁接到 金电极表面，并利用电化学和化学发光方法检测金电极表面捕捉到的标志物上 HRP的量，实现低浓度生物分子的灵敏检测。
酶功能化纳米免疫标记物进行低浓度生物分子检测的夹心免疫检测方法，夹 心免疫检测过程为anti-AFP第一抗体修饰金电极的制备:将洁净金片置于100 10mM摩尔数比为1:1的MUA/MU乙醇溶液中浸泡15小时，用蒸馏水清洗干净 后在10 mM EDC和10 mM NHS的混合溶液中活化30分钟，然后浸入含12.7微 克每毫升的anti-AFP第一抗体溶液中温育1小时，得到anti-AFP第一抗体修饰金 电极；基于酶功能化二氧化硅纳米免疫标志物的夹心免疫方法将上述anti-AFP 第一抗体修饰金电极浸泡在含AFP抗原的溶液中温育30分钟，通过免疫反应捕获
5AFP抗原，然后将该金片置于15 mg/mL酶功能化纳米免疫标记物悬浮液中温育 30分钟，利用标记物表面修饰的anti-AFP第二抗体与金电极表面捕捉到的AFP抗 原之间的免疫反应，将酶功能化纳米免疫标记物捕捉到金电极表面，完成一个完 整的夹心免疫过程。
二氧化硅纳米粒子的比表面大，表面富含幾基，利用其与环氧丙基醚基三曱 氧基硅烷(GPMS )反应，室温下就可在其表面嫁接上环氧基团。环氧基功能化的 二氧化硅粒子进一步与HRP和第二抗体(如anti-AFP抗体)分子中的赖氨酸残基 上的氨基发生竟争反应，得到表面共修饰有HRP和anti-AFP 二抗的二氧化硅孩i球 酶功能化纳米免疫标记物。该酶功能化二氧化硅微球标记物，由于表面荷载大量 HRP和anti-AFP 二抗分子，可用作血清抗原夹心免疫检测过程中的信号标记物， 并增加单次免疫反应中识别的酶的量，极大的提高检测的灵敏度。
有益效果
(1) 本发明涉及的酶功能化纳米免疫标记物制备技术，通过在二氧化硅纳米
微球表面嫁接环氧基团，并与HRP及anti-AFP第二抗体分子中的活性氨基反应， 使酶和二抗能在较温和的条件下被固定在二氧化硅微球表面，得到大量酶和 anti-AFP第二抗体荷载的二氧化硅纳米免疫标志物。
(2) 选用单分散性的二氧化硅微球作为HRP和anti-AFP第二抗体的载体， 由于二氧化硅微球粒径和表面的均一性，使单个二氧化硅小球上荷载的酶和生物 分子的量几乎相同，从而极大的提高了检测的灵敏度和可重复性。
(3 )固定在二氧化硅小球表面上的HRP和anti-AFP抗体能保持他们的生物 活性和免疫活性，并能被金电极表面捕捉到的AFP抗原进行免疫识别反应，从而 将将该酶功能化纳米免疫标记物嫁接到金电极表面。由于该标记物表面富含HRP, 使其对过氧化氢还原的电催化活性以及鲁米诺系统的化学发光性能得到增强，提 高了对低浓度生物分子检测的灵敏度。
四
图1为酶功能化纳米免疫标记物的合成示意图2为夹心免疫过程将酶功能化纳米免疫标记物修饰到金片电极表面电镜图， 其中(a)为未经免疫过程的金片表面，(b)为经过免疫过程后酶功能化纳米免 疫标记物修饰到金片电极表面，图中白色圓点为二氧化硅小球；
图3为anti-AFP第一抗体修饰金电极制备及夹心免疫过程原理图； 图4为酶功能化纳米免疫标记物对AFP抗原检测信号的放大作用。图中曲线 (a)为anti-AFP第一抗体修饰金电极在含有3 ng/mL AFP抗原溶液中温育30分钟，(b )和(c)分别为(a)在12.7 ng/mL HRP-anti-AFP抗体中(b )或在15 mg/mL 酶功能化纳米免疫标记物悬浮液中(c)温育30分钟的循环伏安图。电解液为含 有24 |_iM硫堇和4 mM H202, pH为7.0的磷酸盐溶液，扫速为50 mV s"。
图5为anti-AFP第一抗体修饰金电极在含有不同浓度AFP抗原溶液中温育30 分钟后再在15 mg/mL酶功能化纳米免疫标记物悬浮液中温育30分钟得到的化学 发光响应，发光体系为0.5 mM鲁米诺、0.5 mM对碘苯酚和4mMH202的0.1 M pH 8.5 Tris-HCl緩冲溶液。
图6为发光强度与温育液中AFP抗原浓度的线性关系，检测条件同图5。
五具体实施方式
实施例1:
酶功能化纳米免疫标记物的制备
称取0.2 g粒径为100±2 nm的二氧化硅纳米微球，加入到5 mL 5% GPMS的 曱苯溶液中，在室温下搅拌反应24h。反应结束后，将二氧化硅微球离心分离(转 速为12000r/min),分别用曱苯和无水乙醇清洗表面吸附的GPMS,然后在氮气 保护下，加热至100。C烘干，得到表面修饰有环氧基官能团的二氧化珪微球。
取15 mg环氧基官能化的二氧化硅微球,加入到450 1 mg/mL HRP和50 12.7吗/mL anti-AFP抗体的混合溶液中，在4'C下搅拌反应24 h,离心分离后用含 磷酸盐緩冲溶液清洗三次以除去吸附态的HRP和anti-AFP抗体，然后，用500 |xL 质量分数为1% BSA处理上述修饰后的二氧化硅微球3小时，封闭微球表面残留 的活性环氧基团和非特异性的结合位置，洗涤离心后置于4。C冰箱中备用。使用时 将其分散于1 mL pH 7.0的磷酸盐緩沖溶液中。
实施例2: 夹心免疫过程
将洁净金片置于100 )aL 10 mM 1:1 MUA/MU的乙醇溶液中浸泡15小时，用 蒸馏水清洗干净后在10 mM EDC和10 mMNHS的混合溶液中活化30分钟，然后 浸入含12.7微克每毫升的anti-AFP第一抗体溶液中温育1小时，得到anti-AFP第 一抗体修饰金电极。
将上述anti-AFP第一抗体修饰金电极浸泡在含有不同浓度AFP抗原的溶液中 温育30分钟，通过免疫反应捕获AFP抗原，然后将该金片置于15 mg/mL酶功能 化纳米免疫标记物(实施例1制得)悬浮液中温育30分钟，利用标志物表面纟务饰
7的anti-AFP第二抗体与金电极表面捕捉到的AFP抗原之间的免疫反应，将酶功能 化纳米免疫标记物捕捉到金电极表面，完成一个完整的夹心免疫过程。
实施例3: 免疫检测
(1) 电化学检测方法以上述实施例2中所得经夹心免疫过程修饰后的金电 极作为工作电极，柏丝为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，在含有24)^M硫 堇和4 mM H202， pH为7.0的磷酸盐溶液中，以50 mV s-1的扫速进行循环扫描， 由于电极上修饰的HRP催化H202的还原反应，且还原电流响应随电极上HRP量 的增加而增大，而电极上HRP的量与溶液中AFP抗原的浓度大小有直接关系，因 此检测电极上HRP的量的变化即可反应溶液中抗原浓度，同时由于本发明使用二 氧化硅小球作为酶的载体，使单个免疫过程荷载的酶量大大增加，从而使检测的 灵壽l度大大提高。
通过对不同浓度AFP抗原溶液的检测，以电流响应绘制标准曲线，在0.05到 10 ng mL/1浓度范围内呈线性，并且实验表明该检测方法具有良好的重现性，对同 一浓度抗原;险测的标准偏差为6.8%，同时AFP的最j氐4全出限可达到0.01 ng mL人
(2) 化学发光检测方法将上述经夹心免疫过程修饰后的金电极置于化学发 光4全测池内，加入含0.5 mM鲁米诺、0.5 mM对碘苯酚和4 mM H202的0.1 M pH 8.5 Tris-HCl緩冲溶液，测定其发光强度。由于电极上修饰的HRP能催化鲁米诺、 对碘苯酚和&02体系的发光强度，且该发光强度随电^l上HRP量的增加而增大， 而电极上HRP的量与溶液中AFP抗原的浓度大小有直接关系，因此检测电极上 HRP的量的变化即可反应溶液中抗原浓度，同时由于本发明使用二氧化硅小球作 为酶的载体，使单个免疫过程荷载的酶量大大增加，从而使检测的灵敏度大大提 高(图5)。
通过对0.01-3 ng ml/1浓度AFP抗原溶液的检测，绘制得到呈线性的标准曲线 (图6)。另外，将检测使用后的金电极用pH 3.5酪氨酸洗脱抗原和酶功能化纳 米免疫标记物，进行再生实验，化学发光强度有很好的重现性，在20次再生实验 之后其发光强度仍能达到初次测试时的96.2% 。
实施例4:
酶功能化纳米免疫标记物的制备方法为
将单分散二氧化硅纳米微球与过量GPMS在室温下反应24小时，离心分离并 用曱苯洗涤小球三次，以除去过量的GPMS,再加入体积比为9:1的1 mg/mLHRP和12.7 ng/mL的anti-AFP抗体，在4。C下反应24小时，离心分离并用pH 7.0的磷酸盐緩冲溶液洗涤三次后，用lwt。/。BSA处理，以封闭微球表面残留的活性环氧基团和非特异性的结合位置，离心清洗后即得到大量酶和anti-AFP第二抗体荷载的二氧化硅纳米免疫标志物，保存在4'C冰箱中备用。制备过程见示意图1。夹心免疫过程为
(1) anti-AFP第一抗体修饰金电极的制备在洁净的金电极表面在十一巯基酸(MUA)和十一疏基醇(MU)的混合溶液中浸泡15小时，利用Au-SG键将MUA和MU共组装在金电极表面，在金电极表面形成MUA/MU杂合单层，使其表面带有-COOH。再将该电极在含l-(3-二曱氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)以及anti-AFP第一抗体的混合溶液中温育2小时，利用金电极表面的活性羧基与anti-AFP分子中赖氨酸残基上的活性氨基反应形成的Schiff碱，将anti-AFP第 一抗体固定在金电极表面。
(2)基于酶功能化二氧化硅纳米免疫标志物的夹心免疫方法将上述anti-AFP第一抗体修饰金电极在含有AFP抗原的磷酸盐緩沖溶液中温育30分钟，利用金电极上固定的anti-AFP第一抗体与溶液中AFP抗原的免疫反应将溶液中游离的AFP抗原捕捉到金电极表面。将已进行第一次免疫反应后的金电极用磷酸盐緩冲溶液清洗后，置于酶功能化二氧化硅纳米免疫标志物悬浮液中温育30分钟，由于标志物表面含有AFP第二抗体，因此，可通过该anti-AFP 二抗与金电极表面捕捉到的AFP抗原的免疫识别反应，将该标志物嫁接到金电极表面(见图2),完成一个完整的夹心免疫过程，将得到的金电极经充分。清洗后用于下一步检测。Anti-AFP第一抗体修饰金电极制备及其夹心免疫过程原理(见示意图3)。检测方法为
(1 )电化学检测方法以上述经夹心免疫过程修饰后的金电极作为工作电极，4白丝为辅助电极，饱和甘汞电极为参比电极，在含有24 pM硫堇和4 mM H202,pH为7.0的磷酸盐溶液中，以50mVs"的扫速进行循环扫描，由于电极上修饰的HRP催化H202的还原反应，且还原电流响应随电极上HRP量的增加而增大，而电极上HRP的量与溶液中AFP抗原的浓度大小有直接关系，因此检测电极上HRP的量的变化即可反应溶液中抗原浓度，同时由于本发明使用二氧化硅、球作为酶的栽体，使单个免疫过程荷载的酶量大大增加，从而使检测的灵敏度大大提高(图4)。
(2)化学发光检测方法将上述经夹心免疫过程修饰后的金电极置于化学发光检测池内，加入含0.5 mM鲁米诺、0.5 mM对碘苯酚和4 mM H202的0.1 M pH 8.5Tris-HCl緩沖溶液，测定其发光强度。由于电极上修饰的HRP能催化鲁米诺、对
9碘苯酚和11202体系的发光强度，且该发光强度随电极上HRP量的增加而增大，而电极上HRP的量与溶液中AFP抗原的浓度大小有直接关系，因此检测电极上HRP的量的变化即可反应溶液中抗原浓度，同时由于本发明使用二氧化硅小球作为酶的载体，使单个免疫过程荷载的酶量大大增加，从而使检测的灵敏度大大提高(图5)。
权利要求
1. 一种酶功能化纳米免疫标记物制备方法，其特征在于制备方法为利用二氧化硅纳米微球表面羟基与GPMS发生硅烷化反应，在二氧化硅纳米微球表面嫁接环氧基团，再利用该环氧基团与辣根过氧化物酶和anti-AFP分子中的活性氨基反应，将辣根过氧化物酶和anti-AFP分子共固定在二氧化硅小球表面，用1wt％BSA封闭后得到酶和抗体共修饰的功能化纳米免疫标记物。
2. 根据权利要求1所述的酶功能化纳米免疫标记物制备方法，其特征在于制 备步骤为称取0.2 g粒径为100±2 nm的二氧化硅纳米微球，加入到5 mL 5wt% GPMS的曱苯溶液中，在室温下搅拌反应24h,反应结束后，将二 氧化硅孩i球离心分离，转速为12000 r / min,分别用曱苯和无水乙醇清洗 表面吸附的GPMS,然后在氮气保护下，加热至IO(TC烘干，得到表面修 饰有环氧基官能团的二氧化硅微球；取15 mg环氧基官能化的二氧化硅微 球，加入到450 pL 1 mg/mL HRP和50 12.7 pg/mL anti-AFP抗体的混合 溶液中，在4。C下搅拌反应24 h，离心分离后用含磷酸盐緩冲溶液清洗三 次以除去吸附态的HRP和anti-AFP抗体，然后，用500 nL质量分数为 1% BSA处理上述修饰后的二氧化硅微球3小时后得酶功能化纳米免疫标 记物。
3. —种利用如权利要求1或2所述的酶功能化纳米免疫标记物进行低浓度生 物分子检测的夹心免疫检测方法，其特征在于夹心免疫检测过程为a. anti-AFP第 一抗体修饰金电极的制备在洁净的金电极表面修饰 MUA/MU杂合单层，然后在EDC和NHS活化下与anti-AFP第一抗 体分子中的氨基反应，将anti-AFP第 一抗体固定在金电极表面；b. 基于酶功能化二氧化硅纳米免疫标志物的夹心免疫方法将上步得到 的anti-AFP第 一抗体修饰金电极在含有AFP抗原的磷酸盐緩冲溶液中 浸泡捕捉溶液中游离的AFP抗原，然后将其置于酶功能化二氧化硅纳 米免疫标志物悬浮液中温育，将该免疫标志物嫁接到金电极表面，并 利用电化学和化学发光方法检测金电极表面捕捉到的标志物上HRP 的量，实现低浓度生物分子的灵敏检测。
4.根据权利要求3所述的酶功能化纳米免疫标记物进行低浓度生物分子检测 的夹心免疫检测方法，其特征在于夹心免疫检测过程为a. anti-AFP第一抗体修饰金电极的制备:将洁净金片置于100 )LtL 10 mM 摩尔数比为1:1的MUA/MU乙醇溶液中浸泡15小时，用蒸馏水清洗 干净后在10 mM EDC和10 mM NHS的混合溶液中活化30分钟，然 后浸入含12.7微克每毫升的anti-AFP第一抗体溶液中温育1小时， 得到anti-AFP第一抗体修饰金电极；b. 基于酶功能化二氧化硅纳米免疫标志物的夹心免疫方法将上述 anti-AFP第一抗体修饰金电极浸泡在含AFP抗原的溶液中温育30分 钟，通过免疫反应捕获AFP抗原，然后将该金片置于15 mg/mL酶功 能化纳米免疫标记物悬浮液中温育30分钟，利用标记物表面修饰的 anti-AFP第二抗体与金电极表面捕捉到的AFP抗原之间的免疫反应， 将酶功能化纳米免疫标记物捕捉到金电极表面，完成一个完整的夹心 免疫过程。
全文摘要
本发明涉及一种酶功能化纳米免疫标记物的制备技术。利用二氧化硅纳米微球表面羟基与GPMS的硅烷化反应，使二氧化硅纳米微球表面环氧基化，再利用该环氧基团与辣根过氧化物酶和anti-AFP分子中的活性氨基反应，得到辣根过氧化物酶和anti-AFP第二抗体共修饰的二氧化硅微球免疫标记物。由于微球表面富含酶，使得单个免疫过程的检测信号得到发大，提高了低浓度生物分子检测的灵敏度。同时由于使用的二氧化硅小球的粒径和表面的高度均一性，使得单个二氧化硅小球上荷载的酶和生物分子的量几乎相同，从而极大的提高了检测的可重复性。
文档编号G01N27/26GK101498719SQ20091002573
公开日2009年8月5日 申请日期2009年3月9日 优先权日2009年3月9日
发明者刘松琴, 吴亚锋, 陈成良 申请人:东南大学