专利名称：以绿荧光蛋白(gfp)为标记的肿瘤转移模型的制作方法
技术领域：
本发明涉及肿瘤发展的研究。具体地说，涉及用于研究脊椎动物系统中肿瘤转移的模型系统。
背景技术：
一直以为，肿瘤组织的转移能力是恶性肿瘤威胁生命的主要原因。转移即在不同于原发肿瘤的部位长出了继发肿瘤。这样，虽然手术去除了原发肿瘤，但却不能阻止病情的发展。理解转移发生的机制对于开发出控制继发肿瘤生长的方法是至关重要的。为了理解转移机制，需要提供一种模型，它能够在大量的宿主细胞背景下鉴定出少量的肿瘤细胞，从而在实际病程发展中发现继发肿瘤栓和微转移。
已经有人用外部荧光标记的肿瘤细胞在体外证实了肿瘤转移过程中的外渗和最初的播种步骤。Khokha，R等，Cancer Metastasis Rev(1995)14279-301；Koop，S.等，Cancer Rev(1995)552520-2523。而且，Margolis，L.B.等，In VitroCell Dev Biol.(1995)31221-226显示外部荧光标记的肺肿瘤细胞在组织培养的宿主小鼠肺中的迁移。然而，在所有情况下由于外源荧光标记的限制而不能作长时间的观察。已知，用逆转录病毒来转移绿荧光蛋白基因(GFP)能在体外产生人癌症细胞(Levy，J.P.等，Nature Biotechnol(1996)14610-614)和造血细胞(Grignani，F.等，Cancer Res(1998)5814-19 & Cheng，L.等，Gene Therapy(1997)41013-1022)的稳定转染子。
曾经尝试提供以β-半乳糖苷酶基因为标记的模型(Lin，W.C.等，CancerRes.(1990)502808-2817；Lin，W.C.等，Invasion and Metastasis(1992)12197-209)。但是，这一标记被证实不理想，因为不能使用新鲜或处理过的组织。本发明提供了一种标记，它能够显示活的新鲜组织中肿瘤的的入侵和微转移。而且，采用合适的对比介质，本发明方法可用于显示已形成和正在生长的肿瘤中的血管生成。本发明方法不仅可以用来作为肿瘤生长和转移的模型，而且利用逆转录病毒载体还可以用于获得肿瘤患者体内的临床信息。
本发明用绿荧光蛋白(GFP)作为标记。美国专利5,491,084揭示了该蛋白的异源表达，主要用于监测融合DNA的表达。该专利说明了GFP在大肠杆菌和C.elegans中的表达，还假设一般细胞都可以经修饰来表达GFP。根据该专利，这样的表达不仅是监测融合DNA表达的方法，而且还是监测蛋白质在细胞内定位的方法。
本发明提供转移模型方面的内容已在许多出版物中报道和描述过。Chrishima，T.等，Cancer Research(1997)572042-2047说明的是构建含有人源化绿荧光蛋白(GFP)基因和二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的二顺反子载体。该载体转染入CHO-K1细胞而得到克隆-38。克隆-38表现出稳定的GFP表达，在氨甲蝶呤(MTX)存在下维持。克隆-38细胞注射给小鼠获取肿瘤片段，然后通过外科正位移植(OSI)将片段移植到裸鼠的卵巢绒毛膜上。可以在该模型中跟踪转移。
Chishima，T.等Proc Natl Acad Sci USA(1997)9411573-11576说明的是用来自Clontech的hGFP-S65T克隆的优化密码子转染Anip 973人肺腺癌制备克隆-26。克隆-26静脉注射给裸鼠，然后在组织培养物中跟踪生成的肿瘤。
Chishima，T.等Clin.Exp.Metastasis(1997)15547-552和Chishima，T.等Anticancer Res(1997)172377-2384说明了用克隆-26进行的类似的工作，其中，所述细胞被皮下接种给裸鼠，导致生成肿瘤，然后将所得的肿瘤通过SOI移植到裸鼠的胸膜脏层。还在该模型中观察到了肿瘤转移。
Chishima，T.等In Vitro Cell Dev Biol.(1997)33745-747说明的是克隆-26的组织培养和利用GFP发出的荧光显示其生长。
以上出版物均在此纳为参考。
此外，Chen，L.等，Gene Therapy(1997)41013-1022说明的是利用逆转录病毒启动子调控下的GFP基因来修饰造血干细胞。虽然，作者称用该系统转染人的干细胞只是有些困难，但是采用GFP的加强形式，可以获得令人满意的亮度。
此外，Grignani，F.等，Cancer Res(1998)5814-19报道，用表达GFP的EBV/逆转录病毒载体来实现向人造血祖细胞内的高效基因转移。
Clontch出售含有产生各种颜色的GFP各种修饰形式的载体。用于在哺乳动物细胞表达的Clontch载体将GFP置于巨细胞病毒(CMV)启动子的调控下。
本
发明内容
本发明提供的方法能够在实际情况下密切关注原发肿瘤的形成和转移。利用绿荧光蛋白(GFP)作为稳定而且显见的标记，可以建立这种转移进展的模型，并揭示其机制。
这样，本发明内容之一涉及跟踪原发肿瘤转移进展的方法，该方法包括获取脊椎动物的新鲜器官组织，该动物已经经修饰而含有了表达GFP的肿瘤细胞，以及观察组织切片中有否荧光。
此外，本发明涉及经修饰而含有表达GFP的肿瘤细胞的脊椎动物。
本发明所述的脊椎动物可以构建成模型系统，例如免疫力低下的小鼠，在其体内引入了经修饰后表达绿荧光蛋白的肿瘤细胞或肿瘤。或者，生物体可以是自发含有肿瘤的人或其它脊椎动物，但是该肿瘤已经经病毒感染或逆转录病毒载体转染来产生所述的GFP。
此外，本发明涉及经修饰能在异源调控元件调控下产生GFP的肿瘤细胞，涉及提供稳定细胞系并含有可见量GFP的无限繁殖的细胞，涉及含有产生GFP的转移肿瘤的组织，还涉及含有所述转移肿瘤的组织培养物。
本发明还包括观察和跟踪实体瘤内血管形成的方法，该方法(通常)包括暴露和观察所述的肿瘤。所述肿瘤将已经修饰而表达GFP的，而生物体将被给予对照染料来实现这种观察。
附图简述
图1a和1b显示了用于本发明的载体的构建。
实施本发明的方式本发明提供了主要用于研究肿瘤转移机制和研究实体瘤内血管形成的模型系统。利用了可见标记绿荧光蛋白(GFP)标记肿瘤细胞的优点，使得肿瘤在迁移和定位发展过程中向远离肿瘤的组织内的迁移和定位能够被跟踪。此外，通过给予生物体例如罗丹明之类对比染料，还可以观察到在GFP标记的实体瘤内的血管生成。
本发明各部分内容中采用的标记是绿荧光蛋白(GFP)。已经由生物发光的水母Aequorea victoria克隆得到编码该蛋白的天然基因(Morin，J.等，J.Cell.Physiol(1972)77313-318)。这种基因的获得使得用GFP作为基因表达的标记成为可能。GFP本是一种283个氨基酸的蛋白质，其分子量为27KD。为了发荧光，它不需要其天然来源的其它蛋白，也不需要只存在于其天然来源的底物或辅因子。(Prasher，D.C.等，Gene(1992)111229-233；Yang，F.等，NatureBiotechnol(1996)141252-1256；Cody，C.W.等，Biochemistry(1993)321212-1218)。GFP基因的突变体被发现可以用于加强表达和改善激发和荧光。GFP-S65T(其中第65位的丝氨酸被苏氨酸所取代)在本发明中特别有用，在490nm处具有单一的激发峰。(Heim，R.等，Nature(1995)373663-664)；美国专利5,625,048。其它突变基因可以参见Delagrade，S.等，Biotechnology(1995)13151-154；Cormack，B.等，Gene(1996)17333-38和Cramer，A.等，Nature Biotechnol.(1996)14315-319。其它突变体还有美国专利5,625,048。适当修饰可以改变GFP的发射光谱。所以，虽然本发明使用“GFP”一词，但是所包括的蛋白质并不一定显现绿色。各种形式的“GFP”显现除绿色之外的其它颜色，它们也包涵在“GFP”的定义之中，而且被用于本发明的方法和材料中。此外，需提出的是，本发明“GFP”所定义的绿荧光蛋白已经从其它生物中分离得到，例如海母，Renilla reriformis。任何合适和适宜形式的GFP基因都可以用来修饰肿瘤细胞用于本发明的方法，和用于逆转录病毒转化内源性肿瘤。以下实施例说明使用的是特定的人源化hGFP-S65T克隆。
用GFP标记一般细胞技术参见美国专利5,491,084。
在应用之一中，本发明提供了一种模型系统，用于研究各种候选治疗方法和物质对肿瘤转移进展的作用。
一般说来，所述模型涉及修饰脊椎动物，以哺乳动物为佳，使之含有肿瘤组织，其中的肿瘤细胞本身经修饰而含有GFP的表达系统。肿瘤细胞可以来自本发明经修饰而含GFP和SV40 T-抗原表达系统的肿瘤细胞系。可以在所述的脊椎动物系统中通过给予含有GFP表达系统的转化细胞并使得这些细胞形成肿瘤。通常，这类给予是皮下的，而形成的肿瘤是实体块。由此形成的肿瘤可以移植到任何合适的宿主组织内并发展、转移和发育。
培养初始肿瘤细胞的合适方法包括透皮注射产生GFP的肿瘤细胞，例如CHO细胞、Hela细胞，癌细胞细胞系和肉瘤细胞系，已建立成熟的细胞系(例如人肺腺癌细胞系Anip973，含GFP的人乳房癌细胞系MDA-MB468和MDA-MB435；人前列腺癌细胞系PC3和DU-145，人恶性胶质瘤细胞系324，小鼠黑色素瘤细胞系B16)和本领域可以得到的其它细胞，还包括本发明的无限繁殖化细胞。给予的细胞经修饰而含有GFP表达系统。在给予后，实体瘤逐渐发展，通常是在皮下注射部位。然后可以取出这些本身具有荧光的肿瘤用于移植到脊椎动物模型中。
将已用GFP标记的实体瘤移植到脊椎动物中的技术包括通过外科正位移植(SOI)直接在所需部位植入，通常即肿瘤细胞来源部位。合适的部位包括肺、肝、胰、胃、乳房、卵巢、前列腺、骨髓、脑和其它恶性肿瘤易发组织。植入实体瘤后，该脊椎动物即成为研究肿瘤转移的模型。然后，令肿瘤发展和发育，监测脊椎动物，看是否在远离原移植部位的地方出现GFP标记的细胞。可以通过将动物开膛并用荧光显微镜直接观察器官对脊椎动物的全身进行监测，或者切取组织进行显微镜检。有时，肿瘤具有足够亮度，因此不需要开膛-肿瘤可以透过皮肤直接被看到。只要GFP能够被肉眼看到，就不需要染色组织样品的显影系统。组织样品被适当加工成大小合适的新鲜样品切片，通常厚1mm，然后置于显微镜下接受检查。这样，即使少于10个细胞的集落也能被看见。本领域已知各种显微显影技术，任何合适的方法均可使用。
此外，可以在组织培养物中体外研究肿瘤的发育。这类研究的合适系统包括固相支持培养物，例如维持在胶原凝胶上的细胞等。
用作模型的脊椎动物最好是哺乳动物，例如家兔、大鼠、小鼠等常用实验室动物更好。至于更近似人的动物，可以采用灵长类动物。特别有用的是特别易发肿瘤的动物，例如免疫系统受损的动物，通常如裸鼠或SCID鼠。任何合适的脊椎动物都可使用，选择依据主要是方便和与最终感兴趣的系统的相似性。
可在待移植肿瘤细胞内起效的各种合适的表达系统均可使用。能够在各种肿瘤中表达的许多载体可购得。这些载体的特性根据肿瘤和载体来源的脊椎动物而不同。但是，在使用GFP显现模型系统内肿瘤转移时，宜采用无逆转录病毒启动子或其它病毒启动子的载体，这些启动子会使得模型复杂化。
为了提供有助于建立用于此类模型系统的肿瘤的细胞系，宜使用向细胞提供SV40-T抗原的表达载体。该抗原的存在确保培养物的无限繁殖。所以，本发明中特别有用的是包含如下表达系统的载体同时产生GFP和SV40-T抗原。
为了转染和修饰能够产生肿瘤的转化细胞，各种合适的转染方法都可以使用，例如脂质体、磷酸钙沉淀法、电穿孔和使用基因枪。以脂转染为佳。
相对而言，如果本发明方法用来显现生物体例如人癌症患者体内自发肿瘤的转移，宜使用含逆转录病毒或其他病毒启动子的载体。使用这类载体能够将GFP表达系统插入到已经存在的肿瘤内。此外，该表达系统可含有编码其他有用蛋白的核苷酸序列，所述的蛋白例如治疗蛋白，从而能够同时诊断转移和进行治疗。这些合适的蛋白质包括甲硫氨酸酶(参见PCT/US93/1131和PCT/US96/09935)。这类蛋白可以利用二顺反子表达系统生成与GFP的融合蛋白，或者用分别表达治疗蛋白和GFP的相互独立的表达系统来生成独立的蛋白。
Grignani，F.等，Cancer Res.(1998)5814-19和Cheng，L.等，GeneTherapy(1997)41013-1022已经说明了基于逆转录病毒的GFP表达系统。在这些报道中，逆转录病毒本身被用来转染造血祖细胞，或者用包装细胞来提供含病毒的上清液，然后直接用上清液感染哺乳动物细胞。这样，在本发明方法中，脊椎动物体内的肿瘤通常用经修饰和包装而含有GFP表达系统的病毒来感染。利用病毒的原位感染使得肿瘤获得产生GFP的能力并有效标记了自身。
各种用于在哺乳动物细胞内产生蛋白质的逆转录系统是本领域已知的。例如市售的载体和包装系统，例如Clontech，San Diego，California的产品，包括它们的逆转录-X载体pLNCX和pLXSN，它们能够通过在多克隆位点插入在多种启动子调控下表达GFP。这些载体含有ψ*(延伸病毒包装信号)和用于选择的抗生素抗性基因。许多此类系统已经被用于基因治疗，其中包括如下载体，它们具有一个夹在源自逆转录病毒的5’和3’LTR之间的多克隆位点，因此可用于标记人患者的肿瘤。
这样，可以将如图1a-1b所示的这类基于逆转录病毒的载体转染到包装细胞内，并直接传递给目标肿瘤细胞，或可以用包装细胞的上清液以逆转录病毒感染肿瘤细胞。逆转录病毒与包装细胞的优选组合包括包装细胞内的GFP逆转录病毒载体pLEIN在PT-67。包装细胞与结肠癌细胞的共培养使得GFP-逆转录病毒转移给了癌细胞。
已经证明，利用组织培养技术和产生GFP-pLEIN病毒的PT-67包装细胞上清液，能够成功修饰人癌组织以显示与GFP相关的荧光。体内应用时，宜将病毒给予肿瘤局部，然后可以在注射包装细胞或含病毒上清液后数小时内观察到病毒。恶性癌细胞可以通过其绿色来鉴定，有时绿色足够亮从而可以透过皮肤直接看到肿瘤。
此外，除了在模型系统或脊椎动物(通常是哺乳动物，更多时是人肿瘤患者)中直接观察肿瘤转移和生长，本发明方法还可以用来观察实体瘤内的血管形成。如上所述，肿瘤本身含有GFP标记。然后通常通过注射，以静脉注射为佳，给予生物体对比染料，使得肿瘤内的血管能被看到。合适的染料包括罗丹明及其它对比染料。形成与GFP的绿色相对比的颜色的各种染料都可以使用。较好的是，染料与惰性聚合物例如聚乙二醇偶联，以此延长染料滞留在血管中的时间。给予足量的染料以便于观察；所需的染料量取决于所选的染料、肿瘤的部位、背景GFP的特性和观察方法。数分钟内，可以观察到肠系膜、结肠壁和网膜等区域内实体瘤中生长的血管。观察可以持续相当长的时间，例如，用该方法数小时后的血管生长仍可以观察到。
以下实施例用来说明本发明而不是对本发明的限定。
实施例1制备产生GFP的肿瘤细胞Zolotukhin，S.等在J Virol(1996)704646-4654中所述的人源化hGFP-S65T克隆被用作绿荧光蛋白编码序列。这一密码子优化了的基因购自Clontech Laboratories，Inc.(PaloAlto，CA)，将其连接到表达二顺反子载体(pED-mtx1)，该载体购自Genetics Institute，Cambridge，MA，参见Kaufman，R.J.等，Nucleic Acid Res(1991)194485-4490。用HindIII消化hGFP-S65T，并截平末端；用XbaI切取完整的hGFP编码区，然后单向亚克隆到pED-mtx1内，后者先已用PstI消化、截平末端并再用XbaI消化。
在含10％胎牛血清、2mM L-谷氨酰胺和100μM非必需氨基酸的DMEM中培养CHO-K1细胞。接近铺满的细胞与LipofectAMINETM试剂(GIBCO)和饱和量质粒的沉淀混合物一起培育6小时，然后补充以新鲜的培养基。48小时后，用胰蛋白酶/EDTA收获细胞，按照1∶15传代到含1.5μM氨甲蝶呤(MTX)的选择培养基中。在含MTX的培养基中挑选出稳定整合了质粒的细胞，用EDTA用克隆离心机(Bel-Art Products，Pequannock，NJ)分离。扩增和转移后，克隆-38因其高强度的GFP荧光和稳定性被挑选出来。
以类似以上培育CHO-K1细胞的方法，培育得自Harbin Medical University，China的人肺癌细胞系，所不同的是，用RPMI164(GIBCO)代替DMEM。如上所述进行转染、选择和扩增及转移。克隆-26因其高强度的GFP荧光和稳定性被挑选出来。
实施例2使用修饰后CHO细胞的小鼠模型该模型中使用的是在1.5μM MTX中稳定且增殖速度与亲代CHO-K1细胞相同(通过比较倍增时间来确定)的克隆-38。
给3只6周龄的Balb/C nu/nu雌性小鼠皮下注射单剂量107个克隆-38细胞，所述细胞利用胰蛋白酶消化回收并用低温含血清培养液洗涤3次后保持在冰上。细胞在收获后40分钟内以0.4ml的总体积注射，在注射后第3周处死裸鼠。小鼠全都患有皮下肿瘤，直径为13.0mm至18.5mm(平均值＝15.2mm±2.9mm)。肿瘤组织发出强烈的荧光。从培养的克隆-38细胞中抽提的GFP与由肿瘤制备的克隆-38细胞中抽提的相比，两种细胞内的GFP产生水平相同。
为了构建这种模型，将上述培养的裸鼠皮下克隆-38肿瘤的片段(1mm3)通过外科正位移植术(SOI)移植到6个裸鼠的卵巢绒毛膜上，方法如Fu，X.等，AnticancerRes.(1993)13283-286，该文献在此纳为参考。简而言之，用异呋喃吸入法麻醉小鼠，沿左下腹直肠旁线至腹膜切开，暴露出左卵巢和部分绒毛膜，用镊子刮取。用8-0尼龙线将4份1mm3的肿瘤切片固定在刮取位置，然后将卵巢送回腹腔。用6-0丝线将腹壁和皮肤缝合。
4周后，将小鼠处死，取出肺及其它各种器官。将新鲜样品制成约1mm厚的切片，在荧光和共焦显微镜下直接观察。另外制备样品，用于荧光和常规染色的组织学检测。制备冷冻切片用磷酸盐缓冲液洗涤样品条，在4℃固定10分钟；加入10％甲醛和0.2％戊二醛以及PBS，并用PBS洗涤样品条。使用标准技术用苏木精和伊红染色固定后的组织。
用配有Xenon灯源和GFP滤光器(Chromotechnology Corp.，Brattleboro，VT)的Nikon显微镜进行光显微和荧光显微镜检。共焦显微镜即，在Nikon显微镜上装一MR-600共焦造影系统(Bio-Rad)，使用氩激光仪。
在处死时，小鼠卵巢内肿瘤的直径为18.7mm至25.3mm(平均值＝21.9±3.1mm)。对组织不加处理，在荧光显微镜下观察新鲜的器官组织，显示肿瘤在整个腹腔内播种，包括结肠(6/6小鼠)、盲肠(5/6)、小肠(4/6)、脾脏(1/6)和腹壁(6/6)。在全部小鼠的肺中都检测到了许多微转移，而且，在肝(1/6)、肾(1/6)、另一侧卵巢(3/6)、肾上腺(2/6)、主动脉旁淋巴结(5/6)和胸膜(5/6)也检测到多处微转移。前文所述的标准组织学技术无法测出单细胞微转移，甚至难以测出多个细胞的集落。随着集落的发育，病灶中心肿瘤细胞的密度显著下降。
在另一实验中，通过尾静脉给裸鼠注射5×106个克隆-38细胞，两分钟后处死小鼠。用荧光显微镜分析新鲜的内脏器官，显现在腹壁血管内有荧光细胞，它们在肺、肝、肾、脾、卵巢、肾上腺、胸腺和脑毛细血管内形成栓。
这样，用以上技术，随播种细胞进入相关靶器官内发展成集落，可以观察到微转移的进展。而且，对微转移的搜索可以在所有系统器官中快捷地进行。
实施例3使用人肺癌细胞的鼠模型过程大致如实施例2所述，所不同的是，用如实施例1所述制备的克隆-26细胞代替克隆-38CHO细胞。
A.如实施例2所述，在6周龄的Balb/C nu/nu雄性小鼠内培育肿瘤给小鼠皮下注射单剂量0.4ml 107个克隆-26细胞，40分钟内用胰蛋白酶消化收获，用冷的含血清培养液洗涤3次。注射前，细胞保持在冰上。当肿瘤直径达到约1.2cm时处死动物。直径1.2cm的肿瘤形成于约5周后。
B.如Astoul，P.等，Anticancer Research(1994)1485-92；Astoul，P.J.Cell.Biochem(1994)569-15(在此纳为参考)所述，将1mm3的肿瘤切片通过ISO移植到8个小鼠的左胸膜脏层。简而言之，用异呋喃吸入麻醉小鼠，在左胸横切开1cm，通过第4肋间间隔，使得整个肺萎陷(collapse)。用7-0尼龙手术线将5片肿瘤样本缝合在一起，并固定成一个结。用镊子将肺夹起，用单线将肿瘤缝入肺的下部，然后将肺放回胸腔，用单层6-0丝线将肌肉和皮肤缝合。用23号针抽除胸腔内的气体，使肺重新膨胀。
C.4周后处死4个小鼠，8周后处死另4个。4周组的隔膜肿瘤大244.40mm3-522.88mm3；8周组的隔膜肿瘤大1279.08mm3-2714.40mm3。这表示，平均值为371mm3和1799mm3。切取1mm厚的组织样本，在配有Xenon灯源的Nikon显微镜和配有汞灯源和GFP滤光器的Leica立体荧光显微镜直接观察。所有动物都表现出胸壁侵入，和肿瘤的局部和区域性扩散，但是在8周组的小鼠中，所有肿瘤都涉及纵隔和对侧胸膜腔，以及在胸膜脏层和壁层上的转移。在4周组的小鼠中有3个的肺门淋巴结有肿瘤，8周组的小鼠都患有肿瘤。8周组中有一小鼠测得颈淋巴结有肿瘤，但是没有观察到其它转移。还在切取组织之前直接观察动物。在正常肺组织内入侵的肿瘤边缘可以测到GFP荧光，在肿瘤边缘可以看到小血管在发展。
D.在另一实验中，通过尾静脉给8个裸鼠注射单剂量107个克隆-26细胞，这些细胞用胰蛋白酶消化收获，用低温含血清培养液洗涤3次。注射量为0.8ml，在收获后40分钟内注射。同样，4周时处死4只小鼠，8周时处死另外4只，获取组织样本，如前所述，用显微镜研究。在两组的整个肺组织中都观察到许多微转移集落，4周组的直径为5.2μm至32.5μm，8周组的直径为5.5μm至178.3μm。8周组的集落与4周组的相比，没有表现出进一步的发展。在两组小鼠的肺表面检测到许多少于10细胞的小集落，在4周组的1只小鼠和8周组的2只小鼠的脑内发现转移。8周组中有1个小鼠在脑内、颚下腺、全肺、胰脏内、两侧肾上腺内、腹膜内和肺门淋巴结内有系统性转移。
E.在另一实验中，与上一段相似，通过尾静脉给小鼠注射107个克隆-26细胞，在第4周，第8周和第12周将小鼠处死，并如前所述地进行组织检查。与在第4周处死的相比，第8周处死的小鼠内的大多数集落没有明显进一步发展，但是在肺表面发现许多少于10个细胞且大小为5.5μm-110μm的少量细胞。在第12周，虽然其它集落到此时已经广泛生长，它们的大小达到1100μm，但是主要是许多小的转移集落，这表示在肺部存在着异质性、优势性活性肿瘤集落。
实施例4克隆-26肿瘤细胞在组织培养中的生长给6周龄的SCID/SCID小鼠静脉注射单剂量7.5×107个克隆-26细胞，该细胞如前所述通过胰蛋白酶消化收获，用低温含血清培养液洗涤3次，并保持在冰上。在细胞收获后40分钟内，取0.5ml进行注射。3周后，在整个肺组织内观察到许多微转移集落，直径达约550μm。5周后，将小鼠处死，植有克隆-26的小鼠肺被取出，采用Leighton，J.Cancer Res.(1957)17929-941；Leighton，J.等，Cancer Res.(1960)20575-597；Hoffman，R.M.Cancer Cells(1991)386-92所的组织培养法将其培养在旋转凝胶上。肿瘤集落在肺组织内迅速扩散，1周后，肿瘤细胞开始侵入支持用胶原海绵凝胶上并在其上形成集落。2周后，在远离肺组织内原发集落的海绵凝胶内，肿瘤细胞形成卫星集落，这样，在组织培养中比在SCID小鼠内生长得更快。肿瘤集落可以在组织培养中生长一个月以上。
实施例5GFP逆转录病毒表达载体的构建和标记肿瘤细胞系的制备图1a和1b显示的是受SV40启动子调控的GFP表达载体的构建。该结构物使用购自Clontech的pEGFP系列载体。细菌和哺乳动物载体都有，它们除了GFP之外还产生其它蛋白，它们或者以融合蛋白的形式产生，或者在二顺反子系统内产生。图1a显示的是表达载体pGFP/Met的构建，它用于产生GFP与甲硫氨酸酶的融合蛋白；图1b显示的是载体pGFP/SV40的构建，用于产生GFP与SV40T抗原的融合蛋白。
购得的载体含有采用实施例6中的pLEIN系统的具有理想光谱特征的GFP编码序列，将它们转染到来自肿瘤的细胞系内，所述肿瘤例如人乳房癌肿瘤、人前列腺癌肿瘤、人恶性胶质瘤和鼠黑色素瘤。用这种方式建立起带绿荧光蛋白标记的人乳房癌细胞系MF-7、MDA-MB468和MDA-MB435、人前列腺癌细胞系PC3和DU145、人恶性胶质瘤细胞系324、人肺癌细胞Anip-73和H460、人结肠癌细胞系Colo-205、HCT-15和WiDr、人胃癌细胞系NVGC-4、人肾癌细胞系SN12C、人舌癌细胞系SCC-25、人黑色素瘤LOX和SK-mel-5、来自细胞系CHO-K1的标记的中国仓鼠卵巢细胞和鼠黑色素瘤细胞系B16。
SV-40T抗原被用来使培养的细胞无限繁殖化，以便建立永久性细胞系。所以，将pGFP/SV40载体转染到一系列肿瘤细胞培养物中提供发荧光的无限繁殖细胞系。
实施例6体内标记已建立的肿瘤用无标记Anip973细胞代替克隆-26细胞，用实施例3中A段和B段的方法在小鼠内建立人肺癌细胞系Anip973的无标记肿瘤。然后给小鼠注射1×107个包装细胞，后者为含有逆转录病毒载体GFP-逆转录病毒pLEIN的PT67细胞。该病毒包装系统购自Clontech，SanDiego，California。pLEIN含有EGFP编码序列插入片段，EGFP是GFP野生型的一种红移变异体，已经过优化可以在哺乳动物细胞内产生更亮的荧光和更高的表达。它的最大激发波长为488nm，最大发射波长为507nm。这一突变蛋白具有两处氨基酸取代，第64位的Phe变成Leu，第65位的Ser变成Thr。参见Comack，B.等，Gene(1996)17331-38。按照Haas，J.等，CurrBiol(1996)6315-324所述，为了使人密码子的使用偏性最大化，应有超过190处的沉默碱基改变。这样，pLEIN含有上述GFP的编码序列，该序列插入在pLXIN的多克隆位点内，获得一个二顺反子表达系统，该系统能够协调GFP和新霉素抗性的翻译。将细胞注射入小鼠腹腔后3天，在亮视野显微镜下和荧光显微镜下可以观察到精囊内的肿瘤。
实施例7血管形成的观察如实施例1所述，将含有1×107个克隆-38细胞的悬浮液注入小鼠的腹腔。5天后，从小鼠的尾部注射罗丹明，然后将其麻醉，打开腹腔，开口大至足以看到肿瘤。由以上手术恢复是很容易的。有时，不需要打开腹腔，因为通过完好的皮肤可以直接看到腹腔内的肿瘤。根据罗丹明的荧光，可以看到腹腔内的肿瘤，血管形成也很明显。在小肠壁网膜中和肠系膜中可以看到类似的结果。
在类似的实验中，如实施例1所述将含有1×107个克隆-26细胞的悬浮液注入小鼠的腹腔。1天后，肿瘤在肠系膜和结肠壁上出现。将小鼠麻醉后作最小的腹腔开口可以观察到以上情况。第3天对类似处理的小鼠的观察发现，除了小肠壁和网膜外，还在节肠壁和肠系膜内有肿瘤。第5天，给类似处理的小鼠从尾部注射100μl 2×10-3M罗丹明，在生长于肠系膜内的肿瘤内可以看到少量血管。60天后，在生长于结肠壁的肿瘤内可以看到大量血管。
权利要求
1.一种跟踪原发肿瘤转移进展的方法，该方法包括可选性地对经修改而含有表达绿荧光蛋白(GFP)的肿瘤的脊椎动物进行开膛，并观察组织中有否荧光。
2.根据权利要求1所述的方法，其中的动物被开膛。
3.根据权利要求2所述的方法，其中至少有些组织被切除。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述的被切除组织接受显微镜镜检。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述的脊椎动物经修饰后含有通过手术正位移植法植入的表达GFP的肿瘤。
6.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述动物体内的内源性原发肿瘤经修饰后含有GFP的表达系统。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述的表达系统包含一个病毒启动子；而且/或所述的脊椎动物是人；而且/或所述的表达系统还含有编码治疗蛋白的核苷酸序列。
8.一种脊椎动物，经修饰后含有表达GFP的肿瘤。
9.根据权利要求8所述的脊椎动物，它是哺乳动物；而且/或所述的动物是免疫力低下的；而且/或所述的肿瘤是肺肿瘤或卵巢肿瘤；而且/或所述的GFP是hGFP-ST65T；而且/或其中，表达GFP的肿瘤是通过手术移植表达GFP的前体肿瘤到如下组织或器官部位而得到的，肿瘤所含的细胞即来自所述的前体肿瘤含有的细胞，或者，所述的表达GFP的肿瘤是通过将GFP表达系统提供给所述动物的内源肿瘤得到的。
10.一种经修饰而能产生GFP的肿瘤细胞，其中的肿瘤细胞被如下表达载体转染，该载体包含在异源调控序列调控下的编码所述GFP的核苷酸序列。
11.根据权利要求10所述的细胞，它是无限繁殖化细胞系。
12.根据权利要求11所述的细胞系，它是人乳房癌细胞系、人前列腺癌细胞系、人恶性胶质瘤细胞系、人肺癌细胞系、人结肠癌细胞系、人胃癌细胞系、人肾癌细胞系、人舌癌细胞系、人黑色素瘤细胞系、小鼠黑色素瘤细胞系或中国仓鼠卵巢细胞系。
13.经修饰而能产生GFP的肿瘤细胞，所述的肿瘤细胞被含有如下核苷酸序列的表达载体所转染，所述核苷酸序列编码GFP还编码治疗蛋白或无限繁殖化蛋白。
14.制备含有表达GFP的肿瘤的脊椎动物的方法，所述方法包括给脊椎动物皮下注射权利要求10所述的肿瘤细胞，注射量足以在所述动物内产生肿瘤，该方法或者包括在所述动物体内引入所述GFP的逆转录病毒表达系统。
15.一种含有转移性肿瘤细胞的脊椎动物组织或由这种组织制得的组织培养物，其中所述的肿瘤细胞产生GFP。
16.一种观察脊椎动物肿瘤中血管形成的方法，该方法包括可选性地暴露出所述动物的组织并观察所述肿瘤中的血管，其中所述的血管通过对比染料的存在而可以看见，所述的肿瘤已经经修饰而能表达GFP。
17.一种无限繁殖细胞系，其中的细胞是经修饰而含有SV40-T抗原和可视量GFP的细胞系。
全文摘要
本发明提供了一种跟踪原发肿瘤转移进展的方法,该方法包括取出脊椎动物的新鲜器官组织,所述动物经修饰已经含有表达GFP的肿瘤细胞,观察切取的组织中有否荧光。也可以原位观察荧光。含有产生GFP的肿瘤的脊椎动物主体可用作研究肿瘤转移机制的模型。此外,可以处理已经具有肿瘤的动物,将内源性肿瘤修饰成含有GFP。这可以用于临床。最后,给含有GFP－标记的肿瘤的动物注射对比染料可以直接观察肿瘤内的血管形成。
文档编号C12N5/10GK1264429SQ98804513
公开日2000年8月23日 申请日期1998年4月28日 优先权日1997年4月28日
发明者谭玉英, 千岛隆司 申请人:抗癌股份有限公司 被以下专利引用 (2),