专利名称：人溶菌酶在制备治疗间擦疹的药物中的新用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及人溶菌酶在制药领域的新用途，特别是人溶菌酶在制备治疗皮肤病的药物中的新用途。
背景技术：
抗生素创造了许多医学奇迹，使许多疾病消失无踪，如肺炎、脑膜炎、产褥热、败血症、结核等。21世纪的今天，耐药菌的发展令人触目惊心。如耐青霉素的肺炎链球菌，过去对青霉素、红霉素、磺胺等药品都很敏感，现在几乎“刀枪不入”。肺炎克雷伯氏菌对西力欣、复达欣等16种高档抗生素的耐药性高达51.85％-100％。而耐甲氧西林的金黄色葡萄球菌(MRSA)除万古霉素外已经无药可治。从细菌的耐药发展史可以看出，在某种新的抗生素出现以后，就有一批耐药菌株出现。开发一种新的抗生素一般需要10年左右的时间，而一代耐药菌的产生只要2年的时间，抗生素的研制速度远远赶不上耐药菌的发展速度。目前急需开发一种针对不同耐药菌株均有效的“超级抗生素”用于临床治疗。
发生在皮肤褶皱部位的急性浅表性炎症。又称间擦疹。婴儿、妇女、肥胖者多见，也见于高热环境工作者。颈、腋、腹股沟、臀沟、乳房下多见。皮肤相对的褶皱部位出现鲜红或暗红斑，表面潮湿，形成糜烂面，境界清楚，自觉痒痛，容易继发细菌和真菌感染。预防方法是注意皮肤清洁卫生，保持干燥。治疗可用纱布将摩擦部位分开，局部撒布滑石粉；也可用硼酸水湿敷；有感染者采用抗细菌及抗真菌治疗。
发明内容
本发明的目的是针对上述问题，提供一种人溶菌酶在制备治疗间擦疹的药物中的新用途，不过敏、不产生耐药菌、安全无毒副作用，制备工艺简单，使用方便，疗效显著。
实际上，本发明涉及人溶菌酶在制备治疗由金黄色葡萄球菌、表葡菌、白葡萄菌、腐生菌、真菌、白色念珠菌或耐药菌引起的间擦疹的药物中的应用。
所述人溶菌酶为基因工程表达的重组人溶菌酶、基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的人溶菌酶或者基因工程表达或化学合成突变体重组人溶菌酶。
所述药物中含有人溶菌酶1500U～30万U/mL。
所述药物按下述制备方法制成喷雾剂将纯度95％～99％的基因重组人溶菌酶制得1500U～30万U/ml/g，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.0～7.5)75～85％、5～25％丙二醇(或丙三醇)、5～15％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、万分之1～5吐温80，1～5％水溶性氮酮、尼泊金0.01～0.05％、山梨酸钾0.01～0.1％。在常温下混合均质，(在符合GMP要求的制药厂按制药规程完成)制成喷雾剂。
所述药物按下述制备方法制成乳剂(1)将纯度95％～99％的基因重组人溶菌酶制得1500U～30万U/ml/g；称取西西黄蓍胶0.1～0.4％和阿拉伯胶1～3％，放入50ml95％乙醇液中，备用。
(2)、分别称取山梨酸钾0.01～0.1％、尼泊金0.01～0.05％、万分之1～5吐温80、5～25％丙二醇(或丙三醇)、1～5％水溶性氮酮、5～15％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠加入到10～20mM(pH6.0～7.5)75～80％磷酸盐缓冲液中120℃高压灭菌待用。
(3)、在第(2)项水溶液不断的搅拌下，将第(1)项胶醇液搅匀倒入其中，继续搅拌乳化，在乳液降到50度时加入重组人溶菌酶，继续搅拌乳化，混合均质，(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)制成乳剂。
所述药物按下述方法制成乳膏剂(1)将纯度95％～99％的基因重组人溶菌酶制得1500U～30万U/ml/g备用；称取5～15％硬脂酸加热熔化，过虑、除杂、除菌备用。
(2)量取(pH6.0～7.5)75～80％磷酸盐缓冲液10～20mM，加入5～30％丙二醇(或丙三醇)、万分之1～8吐温80、1～5％水溶性氮酮、尼泊金0.01～0.05％、山梨酸钾0.01～0.5％、5～15％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、1～5％十八醇搅匀，加热至沸，除菌备用。
(3)将以熔化的固相在不断的搅拌下加入液相的水溶液中，进行乳化，待温度降至50度时，将重组人溶菌酶与其它原料搅拌、混合均质，(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)制成乳膏剂。
所述药物按下述制备方法制成软膏剂将纯度95％～99％的基因重组人溶菌酶制得1500U～30万U/ml/g备用，分别称取5～25％丙二醇(或丙三醇)、5～15％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、1～5％水溶性氮酮、羊毛脂1～5％、65～75％凡士林，并于120℃高压灭菌30min，待温度降至60～70度，分别过虑、除杂、除菌备用。待温度降至50度时，称取重组人溶菌酶混合均质，最后倒入凡士林中其它原料搅拌、混合均质，(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)制成软膏剂。
所述药物喷雾剂、乳剂、乳膏剂、软膏剂，含有重组人溶菌酶蛋白活性为30000U/mg。
本发明对基因重组人溶菌酶发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。与现有治疗间擦疹的药物相比，采有人溶菌酶为原料具有显著的优点人溶菌酶是一种小分子蛋白质，存在于机体的泪液、痰、鼻涕、白细胞和血清中，对多种革兰氏阳性菌和少数革兰氏阴性菌有杀菌作用，基因重组人溶菌酶(Human Lysozyme)主要切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1、4糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，引起细菌裂解。基因重组人溶菌酶不过敏、不产生耐药菌、安全无毒副作用，有很好的药用前景。基因重组人溶菌酶来源丰富，制备工艺简单，并可做成喷雾剂、乳剂、乳膏剂、软膏剂等，使用方便，疗效显著。
为了更好地理解本发明的实质，下面将用基因重组人溶菌酶的药效试验及结果来说明其在制药领域中的新用途。
基因重组人溶菌酶以配制200毫升培养基为基准，用H3PO44-8毫升、MgSO41-5克，K2SO42-6克，KOH1-3克，CaSO42H2O1-3.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。进行种子罐培养后进行生产罐培养。将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的蛋白浓缩液冰冻干燥，测定蛋白量、纯度和重组人溶菌酶活性(30000U/mg)保存。
一、基因重组人溶菌酶(HLZ)体外抗菌作用评价受试药品及试剂；1、基因重组人溶菌酶浓缩液(Human Lysozyme HLZ)活性单位30000单位/mL，由大连奇龙生物技术研究所提供，2、对照溶菌酶(contral Lysozyme，CLZ)白色粉未，活性单位50000单位/mg，美国SIGMA公司产品，批号L6876。
3、克拉霉素效价948μ/mg，中国药品生物制品检定所标准品，批号4、罗红霉素效价878μ/mg，中国药品生物制品检定所标准品，批号5、注射用阿莫西林哈尔滨制药厂产品，批号030504。
6、琼脂糖(B10WEST AGAROSE)7、三羟甲基氨基甲烷(Tris)成都化学试验厂，批号030211试验菌株所用菌株均为2003.2～2004.3月于四川、北京地区收集的临床分离致病菌。经本室用API方法重新鉴定后用于试验。
质控菌株金黄色葡萄球菌ATCC25923大肠埃希菌ATCC25922铜绿假单孢菌ATCC27853培养基1、Tris-HCl缓冲液0.1M Tris 100ml，0.1M HCl 70ml，HighWater 800ml，测PH值，用HCl溶液调至PH7.2，加High Water至1000ml。
2、Tris-HCl脂琼养基在Tris-Cl缓冲液中加入脂琼糖116℃无菌后使用。
3、M-H培养基中国药品生物制品检定所产品，M-H肉汤培养基称取25g加1000ml蒸馏水，加热溶解，分装，高压灭菌，116℃20分钟。M-H固体培养基称取36g，加1000ml蒸馏水，高压灭菌，116℃20分钟，用于革兰阳性、阴性需氧菌的药敏试验。
试验方法体外抗菌活性(MIC)测定采用琼脂二倍稀释法测定受试药物对试验菌株的最低抑菌浓度(MIC)。将受试药物用灭菌蒸馏水溶解，适当稀释。分别取1ml药液加9ml融化的Tris-HCl琼脂糖固体培养基混匀，以二倍稀释，制备系列含药平皿。每皿所含药物终浓度分别为4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03……0.001mg/ml；用多点接种仪(Denley A400，England)将稀释至105CFU/ml的试验菌液接种于各含药平皿表面，置于37℃培养8-10小时，取出分别吸取6ml融化的M-H培养基(50℃)覆盖上述系列平皿表面，再置于37℃培养10小时取出，观察结果，以无细菌生长平皿内所含最低药物浓度为该菌的最低抑菌浓度(MIC)。
试验结果人溶菌酶对临床分离菌株的体外抗菌活性见表1，人溶菌酶对临床分离致病菌的MIC50见续表1。根据试验结果表明人溶菌酶体外具有一定抗菌作用，对耐药菌株的抗菌活性也有很好的作用。
表1人溶菌酶、鸡溶菌酶、克拉霉素和罗红霉素体外抗菌活性MIC细菌HLZ CLZ CLA ROXmg/ml(万μ/ml)mg/ml(万μ/ml) mg/ml mg/ml金葡 MRSA02-22 0.025(0.03) 0.008(0.04) ＞1 ＞1金葡 MRSA02-23 0.025(0.03) 0.008(0.04) ＞1 ＞1金葡 MRSA02-26 0.025(0.03) 0.004(0.02) ＞1 ＞1金葡 MRSA02-28 0.5(1.5) 0.016(0.08) ＞1 ＞1金葡 02-19-50.03(0.1) ＜0.002(0.001) ＞1 ＞1表葡 MssE25 0.016(0.05) 0.004(0.02) ＜0.001 ＜0.001表葡 MRSE 02-29 0.063(0.2)0.5(2.5)0.030.5表葡 MRSE 02-5 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.003) ＜0.001 ＜0.001表葡 MRSE 02-6 ＜0.001(0.005)＜0.001(0.005) ＜0.001 ＜0.001表葡 MRSE 02-20-2 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) ＞1 1表葡 MRSE 02-20-3 ＜0.001(0.003)0.004(0.02) ＞1 1表葡 MRSE 02-20-4 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) ＞1 ＞1表葡 MRSE 02-20-5 0.004(0.012) ＜0.001(0.005) ＞1 ＞1表葡 MRSE 02-20-6 0.004(0.012) ＜0.001(0.005) ＞1 ＞1表葡 MRSE 02-20-7 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) 1 1表葡 MRSE 02-20-8 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) ＜0.001 ＜0.001表葡 MRSE 02-20-9 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) ＜0.001 ＜0.001表葡 MRSE 02-20-1 ＜0.001(0 003)＜0.001(0.005) ＜0.001 ＜0.001表葡 MRSE 02-3 1(3) 0.015(0.08) ＞1 ＞1表葡 MRSE 02-4 0.004(0.012) 0.008(0.04) 0.5 ＞1
续表1MIC细菌 HLZ CLZ CLAROXmg/ml(万/ml) mg/ml(万/ml) mg/ml mg/ml表葡 MRSE 02-10 0.004(0.012) 0.25(1.25) 1 1表葡 MRSE 02-12 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) 0.008 0.125表葡 MRSE 02-11 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡 MRSE 02-15 0.008(0.024) 0.002(0.01) 1 ＞1表葡 MRSE 02-17 0.004(0.012) ＜0.001(0.005) 0.25 ＞1表葡 MRSE 02-18 ＜0.001(0.003)＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001表葡 MRSE 02-20 0.008(0.024) ＜0.001(0.005) ＞1＞1表葡 MRSE 02-21 0.016(0.05) 0.25(1.25) ＜0.001＜0.001表葡 MRSE 02-22 0.004(0.012) ＜0.001(0.005) ＜0.001＜0.001白葡萄菌 02-6-4 0.008(0.02) 4(20)0.002 0.002白葡萄菌 02-6-5 0.008(0.02) 0.25(0.63) ＜0.001＜0.001白葡萄菌 02-6-6 0.008(0.02) 0.063(0.31) 0.008 0.25白葡萄菌 02-6-9 0.063(0.2)0.125(0.63) 0.008 0.016白葡萄菌 02-6-7 0.125(0.4)0.016(0.08) 0.032 0.25白葡萄菌 03-2-22 0.032(0.1)0.5(2.5) 1 1白葡萄菌 03-2-30 0.063(0.2)4(10)＞1＞1白葡萄菌 03-3-32 0.016(0.05) 0.25(1.25) 0.008 0.5白葡萄菌 03-3-33 0.032(0.1)2(10)＞1＞1白葡萄菌 03-3-36 0.063(0.2)4(20)0.25 0.5白葡萄菌 03-3-37 0.032(0.1)＞4(20) ＞11白葡萄菌 03-3-39 0.032(0.1)0.5(2.5) 0.51
续表1MIC细菌HLZ CLZ CLA ROXmg/ml(万μ/ml)mg/ml(万μ/ml) mg/mlmg/ml大肠埃希菌 03-2-41 0.032(0.1)0.5(2.5) ＞1 ＞1大肠埃希菌 03-2-42 0.016(0.05) 0.5(2.5) 0.063＞1大肠埃希菌 03-2-43 ＜0.001(0.003)＞4(20) 0.0160.25大肠埃希菌 03-2-45 0.032(0.1)2(10)0.25 0.5大肠埃希菌 03-2-51 0.032(0.1)＞4(20) ＞1 ＞1大肠埃希菌 03-2-52 0.032(0.1)＞4(20) ＞1 0.25大肠埃希菌 03-2-53 0.008(0.024) 4(20)0.03 0.25大肠埃希菌 032-54 0.032(0.1)1(5) ＞1 1大肠埃希菌 03-2-56 0.032(0.1)＞4(20) 0.0160.25大肠埃希菌 03-2-57 ＜0.001(0.003)2(10)0.0320.25大肠埃希菌 03-2-58 ＜0.001(0.003)4(20)＞1 0.5大肠埃希菌 03-2-59 0.032(0.1)4(20)0.1250.25腐生菌 2-30-8 0.008(0.02) 0.5(0.25)0.0080.016腐生菌 2-30-8 0.008(0.02) 1(5) 0.0080.016腐生菌 2-30-8 0.008(0.02) 0.125(0.63) 0.0160.016腐生菌 02-6-14 0.25(0.8) 1(5) 0.063＞1腐生菌 02-6-18 0.5(1.5) ＞4(20) 0.5 1注HLZ指人溶菌酶，CLZ指对照溶菌酶(鸡溶菌酶)，CLA指克拉霉素，RO红霉素二、重组人溶菌酶(HLZ)抗白色念珠菌作用评价受试药品及试剂(1)基因重组人溶菌酶浓缩液(Human Lysozyme HLZ)活性单位30000单位/mg，由大连奇龙生物技术研究所提供，
(2)对照药物；氟康唑批号031029971西安杨森制药有限公司产品。酮康唑批号031026573西安杨森制药有限公司产品。以上受试药物均以无菌水溶解稀释至所需浓度。药物终浓度为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125、0.06、0.03、0.015、0.008mg/l.
(3)葡萄糖、麦芽糖、蛋白胨、琼脂，成都化学试验厂。三羟甲基氨基甲烷(Tris)成都化学试验厂，批号010211。对照溶菌酶(contral Lysozyme，CLZ)白色粉未，活性单位50000单位/mg，美国SIGMA公司产品，批号L6876。
试验白色念珠菌真菌实验所用16株白色念珠菌均为2002.12～2004.2年从四川、重庆、北京等地医院的住院病人收集的临床分离致病菌，所用菌种在收集分离的单位(华西医科大学检验科、重庆医科大学传染科及北京医院细菌室)均经自动细菌检测仪鉴定后，再经本室用API系统重新鉴定后使用。
培养基沙氏(Subourand)培养基实验前新鲜配制葡萄糖40克，蛋白胨10克，琼脂20克，水1000ml.将上述成分溶于水，加热溶化，校正pH6.9-7.0.118℃高压灭菌15分钟。用于真菌药敏实验。
RPMI medium 1640培养基Life Technologies.Inc.GrandIsland，N.Y.14072 U.S.A真菌培养用液体培养基。
试验方法1、最低抑菌浓度(Minimal inhibition concentration，MIC)测定采用琼脂二倍稀释法测定LJG-9.98等药物对所试菌株的最低抑菌浓度(MIC)。采用多点接种仪(Denley A400)将细菌接种于含不同药物浓度的琼脂平皿表面，每点接种菌量约为106CFU/ml，真菌28℃孵育24-48小时观察结果，以无菌生长的平皿培养基中所含药物最低浓度为药物对该菌的最低抑菌浓度(MIC值)。
2、最低杀菌浓度(Minimal bactericidal concentration，MBC)测定先用液体二倍稀释法测定MIC值，再将未见细菌生长管培养液转种于沙氏(Subourand)固体培养基表面，真菌28℃继续孵育24-48小时观查结果，以人仍无菌生长的平皿培养基中所含药物最低浓度为药物对该菌的最低杀菌浓度(MBC值)。
试验结果重组人溶菌酶杀灭白色念珠菌作用见表2和附图，图1为白色念珠菌对照组照片；图2为白色念珠菌用药组杀菌照片。试验结果表明重组人溶菌酶对临床分离的白色念珠菌的体外试验有很好的杀灭作用，MIC值在0.05mg～4mg。由大连奇龙生物技术研究所研制的基因重组人溶菌酶(Human Lysozyme)作用机制；主要切断肽聚糖中N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸之间的β-1、4糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，引起细菌裂解。
表2MIC白色念珠菌HLZ CLZ氟康唑 酮康唑mg/ml(μ/ml) mg/ml(μ/ml) mg/ml mg/ml白色念珠菌 03-2-410.05(1500)0.03(1500) 0.20.3白色念珠菌 03-2-420.1(3000) 0.08(4000) 0.40.4白色念珠菌 03-2-430.06(1800)0.04(2000) 0.10.1白色念珠菌 03-2-450.08(2400)0.04(2000) 0.20.2白色念珠菌 03-2-514(12万) 2.5(12.5万)2 2白色念珠菌 03-2-520.05(1500)0.03(1500) 0.20.2白色念珠菌 03-2-530.08(2400)0.05(2500) 0.40.3白色念珠菌 01-2-543(9万)2(10万)1.51.5白色念珠菌 03-2-562(6万)1.5(7.5万) 1 1
白色念珠菌 03-2-570.3(9000) 0.2(10000)0.40.4白色念珠菌 03-2-580.07(2100)0.05(2500)0.20.2白色念珠菌 03-2-590.2(6000) 0.2(10000)0.50.5白色念珠菌 03-31-80.4(12000)0.3(15000)0.70.8白色念珠菌 03-31-80.8(24000)0.5(25000)0.30.3白色念珠菌 03-31-81(30000) 0.6(30000)0.60.6白色念珠菌 03-6-140.2(6000) 0.1(5000) 0.40.3白色念珠菌 03-6-180.5(15000)0.3(15000)0.90.8注HLZ指重组人溶菌酶，CLZ指对照溶菌酶(鸡溶菌酶)三、人溶菌酶对角叉菜胶致大鼠足跖肿胀的影响(1)受试药物人溶菌酶白色粉末，批号020110，3万单位/毫克，由大连奇龙生物技术研究所提供。临用时用无菌双蒸水配成所需浓度。
(2)对照品鸡溶菌酶白色粉末，2万单位/毫克，Lysozyine Sigma L6878。临用时用无菌双蒸水配制。
(3)试剂角叉菜胶，浅黄白色粉末，批号21H0340，Sigam Chemical CO生产。临用时用无菌生理盐水配成1％的浓度。
实验方法选用体重130-150克的健康雄性SD大鼠50只，由四川抗菌素工业研究所动物中心提供。合格证川实动管第99-32号。每笼5只。动物自由饮水，试验室温度控制在22~28℃左右，动物喂饲大鼠标准饲料。随机分成5组，每组10只。测量各鼠正常左后足跖容积。第1组为空白对照组，外涂等容积无菌双蒸水；第2、3、4组为人溶菌酶，剂量分别为120、60、30IU/只；第5组为鸡溶菌酶，剂量为30IU/只。每鼠外涂各组药物(20μl/只)一次后1小时，给大鼠左后足跖皮下注射1％的角叉菜胶0.1ml。致炎后半小时再涂一次药。致炎前和致炎后1、2、4、6小时按微量吸管测量法测定致炎前后大鼠左后足容积。致炎前后足容积差为肿胀度。试验重复一次。
数据处理和统计分析对计量资料，把原始数据按组分别输入Microsoft Excel中，各组结果以算术平均数±标准差表示。根据《新药西药临床前研究指导原则汇编》中的有关新药药效研究中统计处理的指导原则，选择Student t检验进行各用药组均数与模型对照组均数、相同剂量的受试药组与对照品组的差异显著性检验。
试验结果见表3，大鼠外涂人溶菌酶30、60、120IU/只，在致炎后1-4小时内，使由1％角叉菜胶诱发的左后足跖肿胀度明显减轻。说明人溶菌酶具有抗炎作用，重组人溶菌酶不但有杀菌作用，而且有很好的抗炎作用。
表3(1)人溶菌酶对大鼠由角叉菜胶所致足跖肿胀的影响(第一次试验结果)致炎后不同时间足跖肿胀度(X±SD，ml)组别 剂量 左后足跖(IU/只) 正常体积 1hr 2hr 4hr 6hr空白 - 0.86 0.35 0.49 0.42 0.29对照±0.06 ±0.06±0.05±0.08±0.13人溶 120 0.84 0.24**0.35**0.34*0.22菌酶±0.07 ±0.06±0.05±0.06±0.07人溶 600.87 0.30*0.41**0.35*0.24菌酶±0.09 ±0.04±0.05±0.06±0.08人溶 300.87 0.29*0.41*0.34*0.26菌酶±0.08 ±0.05±0.08±0.07±0.08鸡溶 300.86 0.29*0.40**0.34*0.25菌酶±0.08 ±0.06±0.05±0.07±0.10注经统计学处理，与空白对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。
表3(2)人溶菌酶对大鼠由角叉菜胶所致足跖肿胀的影响(第二次试验结果)致炎后不同时间足跖肿胀度(X±SD，ml)组别 剂量 左后足跖(IU/只) 正常体积 1hr2hr4hr 6hr空白 -0.92 0.30 0.40 0.35 0.29对照 ±0.10 ±0.08 ±0.10 ±0.05±0.15人溶 120 0.90 0.22*0.31*0.30*0.25菌酶 ±0.10 ±0.06 ±0.08 ±0.05±0.07人溶 60 0.92 0.23*0.31*0.29*0.24菌酶 ±0.11 ±0.04 ±0.06 ±0.05±0.07人溶 30 0.92 0.25 0.32*0.29*0.25菌酶 ±0.09 ±0.07 ±0.06 ±0.05±0.07鸡溶 30 0.89 0.22*0.32*0.30*0.26菌酶 ±0.10 ±0.05 ±0.07 ±0.04±0.12注经统计学处理，与空白对照组比较，*P＜0.05。
四、用法与用量1、喷雾剂直接喷雾作用于病灶局部给药，每日1～6次，每次1500u～30000u成人与小儿相同。每次按病灶部位大小给药。
2、乳剂、乳膏剂直接作用于病灶局部给药每日1～6次，每次1500u～30000u。每次按病灶部位大小给药。
3、霜剂、软膏剂直接作用于病灶局部给药，每日2～3次，每次1500u～30000u/g，每次按病灶部位大小给药。
图1为白色念珠菌对照组照片；图2为白色念珠菌用本发明药组杀菌照片。
具体实施例方式下面结合实施例对本发明做进一步的描述实施例1基因重组人溶菌酶以配制200毫升培养基为准，用磷酸6毫升、硫酸镁3克，硫酸钾4克，氢氧化钾1克，硫酸钙1.5克，加蒸馏水至200毫升，高压灭菌后接种甘油管种子，摇床转数为每分钟250转，培养温度为20-35℃，在恒温床上培养36-48小时。进行种子罐培养，最后进行生产罐培养。将发酵表达完成的培养液进行提取纯化，对提取纯化的基因重组人溶菌酶浓缩液进行测蛋白、测活性保存。将纯度95％基因重组人溶菌酶浓缩液溶于水中制得30000U/mL。
将纯度98％的基因重组人溶菌酶制得1500U U/ml/g，磷酸盐缓冲液10mM(pH6.0)85％、15％丙二醇(或丙三醇)、10％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、万分之3吐温80，3％水溶性氮酮、尼泊金0.02％、山梨酸钾0.05％。在常温下混合均质，(在符合GMP要求的制药厂按制药规程完成)制成喷雾剂。
实施例2重组人溶菌酶制备方法同实施例1，将纯度96％的基因重组人溶菌酶制得30000U/ml/g备用，其他原料为磷酸盐缓冲液15mM(pH6.5)78％、18％丙二醇(或丙三醇)、8％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、2％水溶性氮酮、阿拉伯胶2％、西黄蓍胶0.3％、尼泊金0.04％、山梨酸钾0.08％、万分之4吐温80。具体制法为(1)、称取西黄蓍胶和阿拉伯胶，放入50ml95％乙醇液中，备用。
(2)、分别称取山梨酸钾、尼泊金、吐温80、水溶性氮酮、2-吡咯烷酮-5-羧酸钠加入倒磷酸盐缓冲液中120℃高压灭菌待用。
(3)、在第(2)项水溶液不断的搅拌下，将第(1)项胶醇液搅匀倒入其中，继续搅拌乳化，在乳液降到50度时加入重组人溶菌酶，继续搅拌乳化，混合均质，(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)制成乳剂。
实施例3重组人溶菌酶制备方法同实施例1，将纯度97％的基因重组人溶菌酶制得10万U/ml/g备用，其他原料为磷酸盐缓冲液13mM(pH6.0)80％、20％丙二醇(或丙三醇)、万分之7吐温80、10％硬脂酸、4％水溶性氮酮、尼泊金0.03％、山梨酸钾0.15％、9％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、3％十八醇。具体制法为(1)称取硬脂酸加热熔化，过虑、除杂、除菌备用。
(2)量取磷酸盐缓冲液，加入丙二醇(或丙三醇)、吐温80、水溶性氮酮、尼泊金、山梨酸钾、吡咯烷酮-5-羧酸钠、十八醇搅匀，加热至沸，除菌备用。
(3)将以熔化的固相在不断的搅拌下加入液相的水溶液中，进行乳化，待温度降至50度时，将重组人溶菌酶与其它原料搅拌、混合均质，(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)制成乳膏剂。
实施例4重组人溶菌酶制备方法同实施例1，将纯度96％的基因重组人溶菌酶制得20万U/ml/g备用，其他原料为16％丙二醇(或丙三醇)、11％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、4％水溶性氮酮、羊毛脂3％、70％凡士林。具体制法为分别称取羊毛脂、凡士林、水溶性氮酮、吡咯烷酮-5-羧酸钠、丙二醇(或丙三醇)，并于120℃高压灭菌30min，待温度降至60～70度，分别过虑、除杂、除菌备用。待温度降至50度时，称取重组人溶菌酶混合均质，最后到入凡士林中其它原料搅拌、混合均质，(在符合GMP要求的制药工厂，按制药规程完成)制成软膏剂。
实施例5将纯度98％的基因重组人溶菌酶制得50000U/ml/g备用，其他原料为磷酸盐缓冲液17mM(pH6.5)78％、20％丙二醇(或丙三醇)、9％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、2％水溶性氮酮、阿拉伯胶1％、西黄蓍胶0.2％、尼泊金0.03％、山梨酸钾0.05％、万分之5吐温80，按实施例2的具体制法制得乳剂。
实施例6
将纯度97％的基因重组人溶菌酶制得25万U/ml/g备用，其他原料为磷酸盐缓冲液14mM(pH6.0)80％、22％丙二醇(或丙三醇)、万分之5吐温80、12％硬脂酸、3％水溶性氮酮、尼泊金0.04％、山梨酸钾0.3％、13％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、4％十八醇，按照实施例3的具体制法制得乳膏剂。
实施例7将纯度96％的基因重组人溶菌酶制得15万U/ml/g备用，其他原料为19％丙二醇(或丙三醇)、7％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、4％水溶性氮酮、羊毛脂2％、72％凡士林，按照实施例4的具体制法制得软膏剂。
权利要求
1.人溶菌酶在制备治疗间擦疹的药物中的新用途，其特征是人溶菌酶在制备治疗由金黄色葡萄球菌、表葡菌、白葡萄菌、腐生菌、真菌、白色念珠菌或耐药菌引起的间擦疹的药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的人溶菌酶在制备治疗间擦疹的药物中的新用途，其特征是人溶菌酶为基因工程表达的重组人溶菌酶、基因工程表达人溶菌酶的氨基端带有(谷氨酸-丙氨酸)2或(谷氨酸-丙氨酸)3修饰的重组人溶菌酶或者基因工程表达或化学合成突变体重组人溶菌酶。
3.根据权利要求1所述的人溶菌酶在制备治疗间擦疹的药物中的新用途，其特征是所述药物中含有重组人溶菌酶1500U～30万U/ml/g。
4.根据权利要求1所述的重组人溶菌酶在制备治疗间擦疹的药物中的应用，其特征是药物为喷雾剂、滴剂、乳剂、乳膏剂或软膏剂。
5.根据权利要求4所述的重组人溶菌酶在制备治疗间擦疹的药物中的新用途，其特征是含有重组人溶菌酶蛋白活性为30000U/mg。
6.根据权利要求4所述的重组人溶菌酶在制备治疗间擦疹的药物中的新用途，其特征是所述药物按下述制备方法制成喷雾剂将纯度95％～99％的基因重组人溶菌酶制得1500U～30万U/ml/g，磷酸盐缓冲液10～20mM(pH6.0～7.5)75～85％、5～25％丙二醇或丙三醇、5～15％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、万分之1～5吐温80，1～5％水溶性氮酮、尼泊金0.01～0.05％、山梨酸钾0.01～0.1％，在常温下混合均质，制成喷雾剂。
7.根据权利要求4所述的重组人溶菌酶在制备治疗间擦疹的药物中的新用途，其特征是所述药物按下述制备方法制成乳剂(1)将纯度95％～99％的基因重组人溶菌酶制得1500U～30万U/ml/g；称取西西黄蓍胶0.1～0.4％和阿拉伯胶1～3％，放入50ml95％乙醇液中，备用；(2)、分别称取山梨酸钾0.01～0.1％、尼泊金0.01～0.05％、万分之1～5吐温80、5～25％丙二醇或丙三醇、1～5％水溶性氮酮、5～15％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠加入到10～20mM(pH6.0～7.5)75～80％磷酸盐缓冲液中120℃高压灭菌待用；(3)、在第(2)项水溶液不断的搅拌下，将第(1)项胶醇液搅匀倒入其中，继续搅拌乳化，在乳液降到50度时加入重组人溶菌酶，继续搅拌乳化，混合均质，制成乳剂。
8.根据权利要求4所述的重组人溶菌酶在制备治疗间擦疹的药物中的新用途，其特征是所述药物按下述方法制成乳膏剂(1)将纯度95％～99％的基因重组人溶菌酶制得1500U～30万U/ml/g备用；称取5～15％硬脂酸加热熔化，过虑、除杂、除菌备用；(2)量取(pH6.0～7.5)75～80％磷酸盐缓冲液10～20mM，加入5～30％丙二醇或丙三醇、万分之1～8吐温80、1～5％水溶性氮酮、尼泊金0.01～0.05％、山梨酸钾0.01～0.5％、5～15％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、1～5％十八醇搅匀，加热至沸，除菌备用；(3)将以熔化的固相在不断的搅拌下加入液相的水溶液中，进行乳化，待温度降至50度时，将重组人溶菌酶与其它原料搅拌、混合均质，制成乳膏剂。
9.根据权利要求4所述的重组人溶菌酶在制备治疗间擦疹的药物中的新用途，其特征是所述药物按下述制备方法制成软膏剂将纯度95％～99％的基因重组人溶菌酶制得1500U～30万U/ml/g备用，分别称取5～25％丙二醇或丙三醇、5～15％2-吡咯烷酮-5-羧酸钠、1～5％水溶性氮酮、羊毛脂1～5％、65～75％凡士林，并于120℃高压灭菌30min，待温度降至60～70度，分别过虑、除杂、除菌备用，待温度降至50度时，称取重组人溶菌酶混合均质，最后倒入凡士林中其它原料搅拌、混合均质，制成软膏剂。
全文摘要
本发明涉及人溶菌酶在制药领域的新用途，本发明是人溶菌酶在制备治疗由金黄色葡萄球菌、表葡菌、白葡萄菌、腐生菌、真菌、白色念珠菌或耐药菌引起的间擦疹的药物中的应用。药物可做成喷雾剂、乳剂、乳膏剂、软膏剂等。本发明基因重组人溶菌酶发掘了新的医疗用途，开拓了一个新的应用领域。基因重组人溶菌酶不过敏、不产生耐药菌、安全无毒副作用，有很好的药用前景。并且基因重组人溶菌酶来源丰富，制备工艺简单，使用方便。
文档编号A61P17/00GK1634574SQ20041008755
公开日2005年7月6日 申请日期2004年11月12日 优先权日2004年11月12日
发明者张华 申请人:张华