专利名称：一种溶菌酶的发酵方法
技术领域：
本发明属于遗传工程和蛋白质工程领域，具体涉及一种溶菌酶的发酵方法。
背景技术：
溶菌酶是一种碱性球蛋白，全称为:.l,4_e-N-溶菌酶或者粘肽N-乙 酰基胞壁酰水解酶。它能水解细菌细胞壁的肽聚糖中N-乙酰胞壁酸和N-乙 酰葡萄糖胺之间的e-l，4糖苷键，破坏肽聚糖支架，在细菌内部渗透压作
用下导致细胞壁破裂，达到杀菌效果。
在临床上，溶菌酶对眼、耳、鼻、喉、口腔等的急、慢性炎症均有一-定
疗效，特别是对急性炎症如急性咽炎、急性喉炎、急性中耳炎等效果明显。 与抗生素联合使用，对于严重的急性炎症亦有一定疗效。在治疗皮肤病方面， 溶菌酶亦有广泛用途，可用于治疗扁平疣、传染性软疣、寻常性疣、尖锐湿 疣、带状疱疹等多种皮肤病。对于带状疱疹，内服溶菌酶即可。此外，溶菌 酶可用于小儿或乳儿哮喘性支气管炎、呼吸道内膜肿胀等，能够使黏膜肿胀 很快消除，使痰液变稀、呼吸通畅。溶菌酶亦可预防和治疗病毒性肝炎，尤 其对输血后肝炎及急性肝炎的效果较为显著。在机体内溶菌酶还具有抗流感 病毒的活性，其与胆酸盐酸盐的复合物能强烈抑制流感病毒和腺病毒的生 长，并能防止疱疹性病毒感染。
目前，在临床上应用的溶菌酶主要是蛋清溶菌酶，由于其是一种异源蛋 白，在人体内会产生免疫原性和毒副作用。而从人奶、胎盘或尿液中少量提 取溶菌酶，来源极其困难，无法进行工业化生产。并且从生物材料提取溶菌 酶有其固有缺陷， 一是受生物材料来源限制，二是生物材料由于取自不同生 物体，保鲜程度不一，易受病毒和其他有害物质污染，这会造成产品质量不稳定。且天然溶菌酶价格昂贵，因此无法用于临床。
迄今，国内尚无溶菌酶的规模生产。各实验室使用的溶菌酶大多为进口 产品，随着对溶菌酶的临床应用研究的深入，国内迫切需要质优价廉的溶菌 酶供应。
发明内容
本发明目的是对溶菌酶的发酵方法进行优化，使溶菌酶的产量稳定于较 高水平，从而达到规模生产要求。
本发明提供了一种溶菌酶的发酵方法，该方法包括以下步骤-
(1) 将活化的表达溶菌酶蛋白的毕赤酵母菌种置于培养基中发酵1-3
天；
(2) 在(1)的培养基中加入甲醇，继续培养l-5天；
(3) 收集发酵产物，去菌体，即可。
本发明中，表达溶菌酶蛋白的毕赤酵母菌种可以采用基因工程将溶菌酶 基因序列插入毕赤酵母的基因组而得。溶菌酶基因序列可以采用从适当的生 物体组织细胞中提取或者人工合成而得。通常，使用的溶菌酶基因序列是经 过偏爱密码子改造的，即将溶菌酶基因序列中的密码子序列改为毕赤酵母的 偏爱密码子。
由于品质优良的菌种通常被冷冻保存，以备后用，所以发酵前要将菌种 活化。菌种活化可以采用常规的方法进行，例如，室温复苏，稀释涂布于固 体培养基上培养过夜，然后挑取菌落接种液体培养基培养备用。
本发明中，发酵培养基可以使甩常规培养基。其中，该培养基中甘油含 量为5-4pml/L，蛋白胨含量为10-50g/L。培养基中还可以加入酵母粉，酵 母粉的含量为0-50g/L。培养基中还可以加入葡萄糖，葡萄糖的含量为 0-40g/L。培养基中还可以加入磷酸盐，磷酸盐含量为0-0. 1M/L。磷酸盐可 以是磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓沖液，磷酸 氢二钾-磷酸二氢钾缓冲液。该培养基在pH值为7-8. 5时效果较好。
本发明中，发酵温度可以采用常温。
本发明中，步骤(2)中发酵时间为36-60小时。
本发明中，步骤(2)中加入甲醇的量为每6-15小时添加甲醇0. 25-15ml/L 培养基。例如，每6、 8、 10、 12或者15小时添加一次；添加甲醇的量可 以是每次O. 2ml/L， lml/L, 2ml/L， 4ml/L， 5ml/L, 7ml/L， 8ml/L等，但要 保证甲醇的浓度在培养基中不超过3%的体积比。
本发明中，步骤(2)培养过程中加入含蛋白胨0. 01-0. 05g/ml和酵母 提取物，即酵母粉，0.01-0.05g/ml的培养基。
本发明中，歩骤(3)中去菌体方法可以为离心或者过滤、超滤。
本发明中，以离心方法为去菌方法时，离心条件可以为1500-10000rpm， 3-15分钟，0-IO'C。
由于溶菌酶为分泌蛋白，所以溶解在发酵产物上清中。
本发明釆用工业上常用的蛋白胨、酵母粉等原料进行生产，生产成本低 廉，适于大规模生产。与Invitrogen公司提供的培养基相比，生产1克溶 菌酶成本从6000余元人民币，降至2000余元人民币，从而提高了产品的竞 争力；此外，与工业上常用的培养基相比，本发明采用的培养基大大简化， 生产效率明显提高，成本降低，且营养平衡，产量增加，为基因工程菌的扩 大生产奠定了基础。
具体实施例方式
实施例1 发酵流程及产量计算
1.1菌种活化从-80匸取出菌种，室温复苏。将冻存管打开，用移液 枪反复抽吸数次。稀释10-'M音，涂布YPD平板固体培养基，置于30'C培养。
1.2种子培养YPD平板固体培养基中48h后，挑取直径2mra菌落接种 100ml优选培养基于1L三角瓶，以4层无菌纱布封口，进行摇瓶培养，温度 28 30'C，震荡速度300rpm, 36h后结束培养。
1.3发酵培养:将基础培养基6L装入15L发酵罐，115"髙压灭菌25min。 接种1.5L二级种子培养液，培养16~24h耗尽培养液中甘油，。培甲醇诱
导阶段共持续72h。重复培养两次。
1.4发酵液处理发酵结束，用低温高速离心机(5000g， 4'C， 10min) 离心发酵液，收集上清液，加入叠氮钠至0.02%浓度，4C保存。
在进行一次纯化后，可从250ml发酵液上清中纯化到7. 0mg的rh-LYZ， 而发酵液上清的rh-LYZ总活性减少50%,.因此推断，250ml发酵液上清中约 含14mg的rh-LYZ,每升发酵液中含56mg左右的rh-LYZ。
实施例2 甲醇浓度对表达量的影响
将优化培养基分装500ml三角瓶。培养48h后进行诱导。培养基A:,a，每 12h添加甲醇0.25ml;培养基BM，每12h添加甲醇0.5ml;培养基CM,每 12h添加甲醇lml;培养基D33,每12h添加甲醇1.5ml;培养基E33,每12h 添加甲醇2ml。诱导开始后，每隔12h取样，共8次，-20'C保存，发酵结 束检测人溶菌酶相对活性，绘制活性增长曲线。
结果表明，每24h添加1%，即10ml/L甲醇，培养液中蛋白的活性最高； 每24h添加0.59&、 1.5%、 2%、 2.5%甲醇的培养基中，蛋白活性相差不大；每 24h添加3%甲醇的培养基中蛋白活性最低。
权利要求
1.一种溶菌酶的发酵方法，其特征在于，该方法包括以下步骤(1)将活化的表达溶菌酶蛋白的毕赤酵母菌种置于培养基中发酵1-3天；(2)在(1)的培养基中加入甲醇，继续培养1-5天；(3)收集发酵产物，去菌体，即可。
2. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，(2)中发酵时间为36-60 小时。
3. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，(2)中加入甲醇的量为每 6-15小时添加甲醇2. 5-30ml/L培养基。
4. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，(2)培养过程中加入含蛋 白胨和酵母粉，加入的量分别为0. 01-0. 05g/ml和0. 01-0. 05g/ml培养基。
5. 如权利要求l所述的方法，其特征在于，(3)中去菌体方法为离心、 过滤或者超滤。
6. 如权利要求5所述的方法，其特征在于，离心条件为1500-10000rpm， 3-15分钟，0-l(TC。
全文摘要
本发明属于遗传工程和蛋白质工程领域，具体涉及一种溶菌酶的发酵方法。溶菌酶的用途相当广泛。许多研究者都在不断优化溶菌酶生产技术，以期在提高溶菌酶产量的同时降低生产成本。本发明采用工业上常用的蛋白胨、酵母粉等原料进行生产，生产成本低廉，适于大规模生产。与Invitrogen公司提供的培养基相比，生产1克溶菌酶成本从6000余元人民币，降至2000余元人民币，从而提高了产品的竞争力，为基因工程菌的扩大生产奠定了基础。
文档编号C12N9/36GK101353651SQ20071004426
公开日2009年1月28日 申请日期2007年7月26日 优先权日2007年7月26日
发明者龙 余, 唐丽莎, 李宗林, 鹏 黄 申请人:复旦大学