专利名称：用于产生细胞群体的蛋白表达谱的分析平台和方法
技术领域：
本发明涉及分析平台和用其产生细胞群体的定性和/或定量蛋白表达谱(特别是有差别的蛋白表达谱)的方法，其包含-产生一种或多种细胞群体的裂解物，该裂解物包含许多由各细胞群体表达的蛋白，-提供基本上平面的固体支持物，-以稀释的或未稀释的形式，将小量细胞裂解物在离散的位点直接沉积到所述固体支持物或应用在所述固体支持物上的粘附促进层上，从而在所述固体支持物上建立离散测量区的一个或多个一维或二维阵列，-应用许多结合试剂，作为包含在离散测量区的细胞裂解物中且待测的蛋白的特异性的结合配偶体，且如果适当，向所述测量区的一个或多个阵列上应用一种或多种检测试剂，在检测试剂结合到结合试剂之后，依次地或在一个添加步骤中将所述结合试剂和检测试剂应用到离散测量区的一个或多个阵列，和-以局部分辨的方式，测量和记录从所述离散测量区的一个或多个阵列发出的光信号，其中所述基本上平面的固体支持物是无孔的，且任选地应用的粘附促进层具有小于1μm的厚度。
一般背景本发明应具体地有助于增加或促进理解药物对生物或组织或细胞集合的药物作用和/或毒理学作用。本发明应具体地解决细胞信号传导级联的研究，和对处于它们的原始的或归因于细胞发育过程(且如果适当，归因于修饰这些过程的外部应用的诱导)的翻译后修饰形式的所有种类蛋白的检测。
本发明应提供非常确定的蛋白表达谱的表征方法(如蛋白印迹)的替代方案，其能实现更高的可能的时间通过量，即特别是处理大量不同的样品或针对应用到上面的许多试剂分析一种或多种样品，并能得出精确的定量结果。
对于许多应用领域，需要测定复杂样品中的多种生物上有关的分析物，例如，在诊断方法中，用于测定个体的健康状况，或在药物研究或开发中，用于测定施用生物活性化合物对生物和它的复杂的功能模式的作用。
然而，已经一般地最优化了已知的分析型分离方法，以在尽可能短的时间内，分离尽可能大数目的包含在给定样品中的化合物，这是根据给定的理化参数，例如分子量或分子荷质比进行的，生物亲和力有关的测定方法是基于具有最大的可能的特异性的生物的、或生化的或合成的识别元件对复杂内容物样品中的对应的(单个的)目标分析物的高选择性的识别和结合的。因而，许多不同的化合物的测定，需要应用相应大数目的不同的特异性的识别元件。
可以在均匀溶液中和在固体支持物表面上，进行基于生物亲和力反应的测定方法。依赖于具体的方法，可能在分析物结合识别元件和任选的其它示踪化合物后，和任选地在该过程不同步骤之间，需要洗涤步骤，以分离识别元件和待测分析物和任选的来自样品剩余部分的其它示踪化合物和任选地应用的其它指示剂之间形成的复合物。
现在，相对广泛地使用同时测定样品中的许多不同核酸的方法，它使用固定化到固体支持物的离散的、侧向分隔的测量区中的对应的互补核酸作为识别元件。例如，已知基于普通玻璃或显微镜平板的寡核苷酸阵列是具有非常高的特征密度(普通固体支持物上的测量区密度)的识别元件。例如，在美国专利号5,445,934(AffymaxTechnologies)中，已经描述和要求保护了具有超过1000部件/平方厘米的密度的寡核苷酸阵列。这类方法也已经用于测定核酸的表达谱，但是，该样品一般通过费力的方法进行纯化，并扩增在大多数情况下得到的修饰的核酸样品，即通过诸如聚合酶链反应(PCR)的方法，生化地富集(扩增)待测的分析物分子的数目。
最近，还经常描述类似的阵列和基于它的方法，以用于同时测定多种蛋白，例如在美国专利号6,365,418B1中。
对这样的用于测定核酸和其它生物聚合物(例如蛋白)的所谓“微阵列”的公开内容，描述了如何将多种特异性的识别元件固定化到离散测量区中，以产生用于分析物识别的阵列，然后与包含分析物(可能是在复杂的混合物中)的待分析样品接触。根据已知的公开内容，在分开的离散测量区中，以尽可能纯的形式提供不同的特异性的识别元件，从而致使普遍的不同的分析物能结合到具有不同的识别元件的测量区。
对于这类已知的测定，需要通过在有些情况下非常费力的步骤，富集要以尽可能纯的质量固定化的特异性的识别元件。由于不同的识别元件还在它们的理化性质(例如，它们的极性)方面存在或多或少的差异，所以在它们的最优化的固定化到普通支持物上的离散测量区中的条件方面，也存在相应的差异，所述固定化任选地由粘附促进层介导，例如，通过吸附或通过共价结合。因此，为固定化多种不同的识别元件选择的条件(例如粘附促进层的性质)，几乎不能对于要固定化的所有识别元件都是最佳的，但是通常是在不同的目标识别元件的固定化性质之间折衷。
而且，这类测定的缺点是，为了测定特定数目的样品中的分析物，必须在普通支持物或应用不同样品的离散支持物上提供对应数目的离散阵列。对于多种不同的样品的分析，这意味着需要大量的离散阵列，其生产是相对复杂的。
例如，已经描述了在合适的解离条件下，固定化的寡核苷酸和在样品中提供的互补寡核苷酸之间形成的杂交体，会高效率地解离，从而“再生”识别表面；但是，几乎不能保证100％再生。在与蛋白的生物亲和力复合物的情况下，复合步骤经常是不可逆的，即不能再生识别表面。
因此，需要改进的测定体系，其能同时分析普通支持物上的单个阵列中的多个样品中包含的分析物。为此目的，有用地是在支持物上不固定化不同的特异性的识别元件，而固定化待分析的样品本身，如果可能，直接地固定化，而不经其它预处理，或在尽可能少的预处理步骤后固定化。在下面，这类测定体系应被称作“反向测定体系”。
在美国专利号6,316,267中，描述了一种方法，其中例如将多氨基酸(可能在复杂的样品混合物中)应用到固体或“半固体”样品基质上。但是，不在生物亲和力测定中进行检测步骤，而是通过用包含所述公开内容中示例的某些金属复合物的试剂混合物进行染色进行。这显然不是特异性的分析物检测方法。
在美国专利号6,287,768中，描述了一种方法，其中分离来自生物样品的不同的待测RNA分子，通过大小分开，沉积到固体支持物上，然后在上面测定，例如在与已知的互补多核苷酸杂交后的杂交测定中。根据该专利的公开内容，如果它们以高度充足的量存在，则可以将待测的且从生物分离的RNA分子直接用于进一步的测定方法，或者必须通过已知的扩增方法(例如，通过聚合酶链反应，“PCR”)，预先扩增它们。
尽管在美国专利号6,287,768中提出的方法打开了同时测定来自不同样品的RNA的机会，但它仍然需要许多复杂的样品制备步骤，且特别是从生物样品基质的分离，随后根据分子大小分离样品。考虑到下述事实，即要求保护的方法(其仅仅参照RNA的实例进行描述)至少需要从原始样品基质分离，并根据大小分开生物聚合物，预期在该分离步骤之后和分析步骤之前，相对分子组成会与原始样品的相对分子组成不同。
在这里和下面，“相同的相对分子组成”指，要在分析中测定的分析物或它们的修饰形式(如磷酸化的、糖基化的、甲基化的或乙酰化的形式等)(在本发明的情况下，指由细胞群体表达的蛋白)的浓度的比率保持不变。在该命名后，当使用该名词时，将忽略在对应的测定方法中不测定的溶剂或基质分子或其它分子的含量的变化。
在这些方法中使用的检测步骤通常不足够敏感，以致于可达到样品中的待测分析物所需的检测极限的事实可被视作在所述分析方法中包括所述分离或富集步骤的原因。
尤其在蛋白免疫测定的情况下，已知一些方法，其中使用在具有三维表面的载体上产生的测量区的阵列进行测定，所述载体例如多孔载体，如硝酸纤维素膜，其可以是自支持的，或涂覆在固体支持物上，以方便操作，用以在免疫测定中彼此相互作用的结合配偶体的固定化，以增加相互作用表面和从而提高检测灵敏度。但是，这些三维固定化表面的显著缺点是，与临近的液体介质的液体交换或液体置换的不可避免的延迟，从而显著减少结合动力学的速度，并显著妨碍非特异性结合的或吸附的用于分析物(即，与本发明的范围有关目标蛋白)检测的结合试剂或检测试剂的去除，伴有增强的“背景信号”的高度危险，在该情况下，主要由非特异性的结合或吸附事件造成。另外，为了检测普通类型的测量区(即所谓的沉积的相同的相对分子组成的“点”)的许多不同的分析物，固定化表面的三维几何形状具有伪造不同的分析物(即，特别是蛋白)的检测条件的高度危险，这是因为固定化的特异性的结合配偶体的空间上不同的分布，和接近应用的对应结合试剂和检测试剂的空间上不同的条件。
因此，需要能够从进行最小化的样品预处理的样品产生蛋白表达谱的分析平台，以节省费力的制备步骤的成本和需要的试剂体积。另外，需要分析平台和方法，其能避免作为生化相互作用和识别表面的三维表面的所述缺陷。
本发明解决了这些任务。
附图简述
图1显示了根据本发明的分析平台和普通固体支持物上的测量区的6个相同阵列的排列(根据沉积的样品)，作为根据本发明的分析平台。在2幅放大图中，显示了产生的测量区的排列的几何形状(更多的解释见描述部分)。
图2在左边部分显示了与1∶500稀释的Cy3-抗-β-肌动蛋白(使用浓度6nM；暴露时间5秒，显示范围0-20 000)温育后，测量区阵列的各向同性地发射的荧光的图像。右侧测量区阵列的设计(1＝作为第一种对照细胞裂解物的“未公开的细胞裂解物I”，2＝作为测定性能的质量控制的“未公开的处理的细胞裂解物II”，3＝点样缓冲液，4＝未处理的结肠癌组织裂解物＝“肿瘤裂解物1”，5＝处理的结肠癌组织裂解物＝“肿瘤裂解物2”，6＝空白；对于每种裂解物，样品稀度从左向右递增，也见图1)。
图3显示了未处理的和处理的结肠癌组织裂解物(即，“肿瘤裂解物1和2”)的稀释图。数据点指示着每个蛋白浓度的2个重复点的平均净荧光信号。在与Cy3-抗-β-肌动蛋白抗体温育后，产生了荧光信号(RFI＝参照荧光强度)。
图4显示了用于检测所有点样的细胞和肿瘤组织裂解物中的β-肌动蛋白的参照荧光强度(RFI)。
图5显示了对于作为内部对照的2种结肠癌组织裂解物和2种细胞裂解物(分别是未处理的和处理的)在测量区的不同阵列上测量的蛋白表达的条形图，所述裂解物与作为特异性结合试剂的对不同信号传导标记蛋白特异性的抗体一起温育(途径激活)，然后与对应的作为检测试剂的荧光标记的抗-物种抗体一起温育(途径激活的实例)。
图6显示了对于作为内部对照的2种结肠癌组织裂解物和2种细胞裂解物(分别是未处理的和处理的)在测量区的不同阵列上测量的蛋白表达的条形图，所述裂解物与对不同细胞信号传导标记蛋白特异性的抗体一起温育(细胞增殖)。
图7显示了对于作为内部对照的2种结肠癌组织裂解物和2种细胞裂解物(分别是未处理的和处理的)在测量区的不同阵列上测量的蛋白表达的条形图，所述裂解物与对不同细胞凋亡标记蛋白特异性的抗体一起温育(细胞凋亡)。
图8显示了为每种蛋白分析物显示的“倍数信号”(如实施例的3.4部分所述的参照的和标准化的，从处理的和未处理的细胞群体(样品)得到的信号之间的荧光信号的比率)。实心条倍数信号，从＞LOD的表达信号(RFI)计算；空白条倍数信号，从表达信号(RFI)计算。
发明描述本发明的第一个主题是，产生一种或多种细胞群体的定性和/或定量蛋白表达谱的方法，其包含-产生一种或多种细胞群体的裂解物，该裂解物包含许多由各细胞群体表达的蛋白，-提供基本上平面的固体支持物，-以稀释的或未稀释的形式，将作为沉积样品的小量细胞裂解物在离散的位点直接沉积到所述固体支持物或应用在所述固体支持物上的粘附促进层上，从而在所述固体支持物上建立离散测量区的一个或多个一维或二维阵列，-应用许多(即一种或多种)结合试剂，作为包含在离散测量区的细胞裂解物中且待测的蛋白的特异性的结合配偶体，且如果适当，向所述测量区的一个或多个阵列上应用一种或多种检测试剂，在检测试剂结合到结合试剂之后，依次地或在一个添加步骤中将所述结合试剂和检测试剂应用到离散测量区的一个或多个阵列，和-以局部分辨的方式，测量和记录从所述离散测量区的一个或多个阵列发出的光信号，
其中所述基本上平面的固体支持物是无孔的，且任选地应用的粘附促进层具有小于1μm的厚度。
如果没有相反的明确说明，使用的“一(a)”或“一种(one)”结合试剂等术语应总是包括使用许多在“一”或“一种”使用的试剂溶液中的这样的相同种类的化合物的含义。
术语“蛋白表达谱的产生”包括待测蛋白的相同分子实体的绝对和/或相对拷贝数的测定，以及处于所有翻译后修饰形式(例如磷酸化、糖基化、甲基化、乙酰化等)的这种“蛋白”的检测。
根据特定的应用目的，可以在结合和检测步骤中，区分这些不同的形式，或者不区分(见下文)。
术语“定性的”蛋白表达谱的表征是指测定对应的蛋白存在于研究的样品(以稀释的或未稀释的形式沉积的细胞裂解物)中，还是不存在于这样的样品中。
术语“定量的”蛋白表达谱的表征是指，测定沉积的样品中包含的目标蛋白的绝对和/或相对量。其中，“相对”量是指，与参照或校正样品相比的量。
具体地，本发明的主题是，产生2种或更多种细胞群体的定性和/或定量的有差别的蛋白表达谱的方法，其包含-产生细胞群体的第一种裂解物，该裂解物包含许多由各细胞群体表达的蛋白，-产生其它细胞群体的第二种或更多种裂解物，该裂解物包含许多由各细胞群体表达的蛋白，-提供基本上平面的固体支持物，-以稀释的或未稀释的形式，将作为沉积样品的小量细胞裂解物在离散的位点直接沉积到所述固体支持物或应用在所述固体支持物上的粘附促进层上，从而在所述固体支持物上建立离散测量区的一个或多个一维或二维阵列，-应用许多结合试剂，作为包含在离散测量区的细胞裂解物中且待测的蛋白的特异性的结合配偶体，且如果适当，向所述测量区的一个或多个阵列上应用一种或多种检测试剂，在检测试剂结合到结合试剂之后，依次地或在一个添加步骤中将所述结合试剂和检测试剂应用到离散测量区的一个或多个阵列，和
-以局部分辨的方式，测量和记录从通过沉积稀释的或未稀释的形式的小量第一种裂解物产生的测量区发出的第一组光信号，-以局部分辨的方式，测量和记录从通过沉积稀释的或未稀释的形式的小量第二种或更多种裂解物产生的测量区发出的第二组或更多组光信号，-对比第一组光信号的测量值和第二组或更多组光信号的值，其中所述基本上平面的固体支持物是无孔的，且任选地应用的粘附促进层具有小于1μm的厚度。
术语“细胞群体的第一种裂解物”应当包含要对比其蛋白含量的“相同的或不同的细胞群体的许多第一种裂解物”。
例如，所述“第一种裂解物”可以从未处理的细胞群体得到，且可以用作对照样品。例如，所述“其它细胞群体的第二种或更多种裂解物”可以从已经用生物活性的化合物处理过的细胞群体得到。
相应地，术语“其它细胞群体的第二种或更多种裂解物”应当包含“其它细胞群体的许多第二种或更多种裂解物”。
因此，在应用许多第一种和/或第二种或更多种裂解物时，对比对应的更多组光信号的值。
在本发明的精神中，固体支持物上的空间上分开的或离散的测量区，由沉积的裂解物或沉积的参照试剂(如荧光标记的牛血清清蛋白)占据的封闭区域定义。这些区域可以具有任意的几何形状，例如，圆形、矩形、三角形、椭圆形等。
术语“裂解物”应该用于指，从源自细胞群体的细胞集合得到的液体样品，其用于以液体溶液形式沉积到根据本发明的分析平台上。优选地，以能使它们含有它们的来源细胞群体、细胞组织培养物的完整蛋白质组的方式，制备裂解物。可以在适当的缓冲溶液中，稀释待沉积的裂解物，或不稀释。优选地，沉积在固体支持物或所述固体支持物的粘附促进层上的离散位点的裂解物，具有与裂解物的来源细胞群体相同的待测蛋白的相对分子组成。依赖于具体的用途，可以在将它们沉积到固体支持物上之前，以不同的方式进一步处理裂解物。裂解物可以含有已知的添加剂，例如稳定剂，例如酶抑制剂，以预防生物聚合物或包含在其中的它们的修饰形式的消化。裂解物也可以含有已知浓度的作为添加剂的与待测分析物类似的化合物(作为标准品)，其在层析中可以与样品的“掺加”相比较。这样的添加剂可以用于例如校正目的。而且，裂解物可以含有与样品基质类似的化合物添加剂，例如牛血清清蛋白(BSA)，但是其不同于待测蛋白，其可以用于例如在测量区建立固定化的蛋白分子的对照表面密度。如果需要，可以从裂解物分离不溶的材料，例如通过离心。优选地，对裂解物不进行过滤和/或分级分离和/或稀释以外的其它样品处理步骤。
如果没有相反说明，诸如“待测蛋白”或“待测分析物”的术语总是包含相同种类的许多蛋白或分析物分子的检测的含义。
沉积的裂解物中含有的蛋白，包括所有翻译后修饰形式(例如磷酸化、糖基化、甲基化、乙酰化等)，可以以天然的或变性的形式存在，例如在用脲或表面活性剂(例如，SDS)处理裂解物后。沉积的裂解物中含有的蛋白，在用脲处理后，优选地以变性形式存在，所以它们的表位可以被自由地接近，以用于结合它们的对应的特异性的结合试剂。这可以通过用脲处理、破坏三级和四级结构而成为可能。
令人惊讶地，根据本发明的方法的灵敏度是这样的，以致于甚至可以高度稀释作为要分析的样品的裂解物，且混合物中含有的蛋白尽管在有些情况下的浓度非常低，且相应地在单个测量区可以得到的量小，但仍然可以被高精确地(定量地)测定，这是用已知的常规方法不可能实现的。这具有显著的优点，即在根据本发明的方法的情况下，作为在样品中包含的且待测的分析物的沉积的蛋白，即使在它们固定化后，通常仍然以与原始样品相同的相对分子组成存在。从而，根据本发明的方法可以提供分析结果，其代表原始样品的总分子组成，因为可以避免在其它情况下的一般的富集和分离步骤。
在本发明的精神中，可以与待分析样品中包含的不同化合物区分开、且可以被用于该目的的特异性的检测试剂结合的分子种类或化合物，尤其是蛋白，应当称作“分析物”。例如，如果仅仅应检测蛋白的磷酸化的形式，而不检测未磷酸化的形式，那么这2种形式的蛋白对应着根据该定义的2种不同的分析物。如果任意的磷酸化的化合物或种类能被另一种结合试剂识别和结合，那么，在这些条件下，对应的磷酸化的化合物或种类一起是一种分析物。根据该定义，可以选择分析物的特异性的结合试剂，例如，以它们排它地识别和结合待测化合物的磷酸化的或糖基化的或甲基化的或乙酰化的(或相应地，未磷酸化的和/或未糖基化的和/或未甲基化的和/或未乙酰化的)形式的方式进行。细胞或生物中的生物信号途径的活性，可以与控制对应的信号途径的磷酸化的或糖基化的或甲基化的或乙酰化的化合物分数(依赖于信号途径的性质)相关联。磷酸化的和糖基化的形式分别在对应的化合物的总量内的相对分数，即分别以它的磷酸化形式和它的糖基化形式存在的化合物的量和分别以磷酸化的和未磷酸化的形式或糖基化的和未糖基化的形式存在的该化合物的总量的比率，在下文中应当分别称为样品中的对应化合物的磷酸化程度和糖基化程度。类似地，可以定义甲基化或乙酰化的程度。化合物的“活化程度”的总称概括了磷酸化程度和糖基化程度，以及甲基化程度和乙酰化程度。但是，化合物的活化程度也可以指化合物的其它的、化学修饰的形式。
也可以以使它们仅仅结合待测化合物(蛋白)的方式，选择特异性的结合试剂，如果该化合物(蛋白)以特定的三维结构存在的话。例如，当它们以特定的三维结构提供时，许多抗体仅仅识别和结合待测化合物的特异性的局部区域(表位)。依赖于待测化合物的构象状态，这些局部区域(表位)可以被接近，以用于结合对应的结合试剂，或可以被隐藏。也可以以使它们结合待测化合物的区域的方式，选择特异性的结合试剂，其中这些区域的可接近性独立于对应的化合物的三维结构。通过使用适当地选择的结合试剂，从而可能确定样品中待检测的且显示特定构象状态的化合物的总量的相对量。
根据本发明的方法能实现许多不同的用于产生细胞群体的表达谱的策略。
在一个优选的实施方案中，将作为不同蛋白的特异性的结合配偶体的不同结合试剂应用到每种不同的待测蛋白的不同阵列上。在将要附着的检测试剂另外应用到结合试剂上后，其中所述结合试剂已经结合到待测蛋白上，实施该实施方案。但是，例如当使用测量区的表面-结合的分子量的增加和所得折射率的局部增加作为分析物检测的测量方法时，也可以不使用这样的检测试剂来实施该实施方案(见下文)。
在另一个优选的实施方案中，通过将不同的可区分的检测试剂应用到所述阵列上，不同的待测蛋白的数目对应着应用的不同的可区分的标记的数目，可在共同阵列中检测不同的蛋白。该实施方案最后需要应用检测试剂。在该情况下，可以同时或依次地应用不同的结合试剂和检测试剂。
在这2个实施方案的组合中，通过应用不同的作为不同阵列上的不同蛋白的特异性结合配偶体的结合试剂，检测测量区的阵列上的不同的蛋白和/或不同的可区分的检测试剂，检测了测量区的多个阵列中的许多不同的蛋白。
依赖于基于本发明的细胞蛋白表达的研究的实际范围，可以以不同的方式，选择沉积在离散测量区中的裂解物。根据本发明的方法的一个可行的实施方案的特征是，可以从无关的细胞群体产生裂解物。
“无关的细胞群体”应指，尚未一起进行共同培养过程的细胞群体，即一般地，源自彼此独立地生长或培养的不同生物、器官或细胞培养物等的细胞群体。结果，该术语应当包括例如源自下述的细胞群体源自不同的人、动物或植物或一般生物，源自不同的器官，源自这类生物或器官中的不同位置，如来自相同器官的癌性的和健康的组织，已经独立地培养的体外细胞培养物等。该术语也应包括，例如，已经在不同的时间点从相同的生物或器官得到，和/或然后在体外培养过程中进行不同的处理或暴露类型的细胞群体。从这些无关的细胞群体的裂解物产生的有差别的表达谱，然后可以例如用于监控不同生物之间、相同种类的健康和患病生物之间、不同生物之间等的细胞表达的差异，尤其是在暴露于用不同的化学或生化化合物如药物处理，或暴露于不同的生长条件之后。
根据本发明的方法的另一个实施方案的特征是，从已经从共同细胞群体得到的不同的细胞亚群产生不同的细胞裂解物。例如，在不同的时间点，已经从共同细胞群体得到不同的细胞亚群。不同的细胞亚群也已经从共同细胞群体得到，然后用不同的试剂处理或刺激，和/或暴露于不同的培养条件。用不同的试剂处理或刺激可以包括，将不同的化学试剂或药物应用于细胞亚群的培养物，且向不同培养条件的暴露可以包括，例如，暴露于紫外线，热激等，因为普遍应用的培养条件具体不适用于暴露的细胞培养物中含有的某些化合物。在根据本发明的方法的另一个重要的实施方案中，已经从患病的和健康的细胞群体产生了不同的细胞裂解物。
裂解物所来源的健康的或患病的和/或处理的或未处理的和/或刺激的细胞群体，可以源自原核细胞，例如细菌，和真核细胞，例如人、动物或植物细胞，特别是人或动物组织，例如器官、皮肤、毛发或骨组织，或植物组织，和含有细胞的体液或它们的组分，例如血液、血清或血浆、滑液、泪液、尿、唾液、组织液、淋巴。
通过已知的方法，包括组织切片或活组织检查，特别是微量制备方法如激光捕获显微解剖，已经得到了用于产生细胞裂解物的细胞群体或它们的部分。
通过选自下述的方法，可以将样品侧向选择性地直接沉积在固体支持物或沉积在其上面的粘附促进层上的离散测量区中墨水喷射点样，通过笔、针或毛细管的机械点样，“微接触印刷术(micro contactprinting)”，测量区与通过平行的或交叉的微通道供给的样品的流体接触，应用压力差或电势或电磁势，和光化学的或光刻法的固定化方法。
通常，按照根据本发明的方法，可以将几种不同的蛋白同时固定化到一个测量区中。一般，存在多种，即几百或甚至几千种不同的蛋白，作为固定化到一个测量区中的分析物。
因为根据本发明的方法的高灵敏度，所以可能分析甚至非常小体积和量的使用的样品。在这里，样品的量是指，沉积在离散测量区中的蛋白内容物的总量。样品可以包含例如小于20000细胞的蛋白内容物，且仍然被高精度地分析。沉积的样品甚至可以包含小于1000细胞的蛋白内容物。需要的样品量甚至可以包含小于100细胞的蛋白内容物，或甚至仅仅1-10细胞的材料，且仍然被可靠地分析。与单个细胞的内容物相对应的蛋白内容物，也应当称作细胞当量。当待测蛋白是相对高度丰富的内容物时，需要分析所必需的那样小的细胞当量的量。样品也可能具有小于1μl的体积。待测样品甚至可以具有小于10nl或甚至小于1nl的体积。
尤其是，为了促进测定和/或对比细胞群体的蛋白表达谱的分析方法，当将作为不同待测蛋白的特异性结合配偶体的不同结合试剂应用到每种待测蛋白的不同阵列上时，如果适当，组合应用一种或多种其检测试剂，如果可以区分，其可以以2或更大的数目应用于相同的阵列，那么如果测量区的相同阵列的副本提供在共同固体支持物上，则是有利的因此，在根据本发明的方法的另一个优选的实施方案中，是测量区的多个阵列，其排列成稀释的或未稀释的细胞裂解物的沉积位点的相同的几何形状，即相对于与来自沉积在其中的相同(稀释的或未稀释的)细胞裂解物的沉积量相对应的2个不同阵列中的测量区的行和列的类似位置。
通常，在特异性的结合反应中，固定化用于分析物测定的特异性的结合配偶体的最简单的方法是物理吸附，例如，基于要固定化的特异性的结合配偶体与固体支持物之间的疏水相互作用。但是，介质的组成和它的物理/化学性质，例如极性和离子强度，可以显著改变这些相互作用的强度。尤其在多步测定中依次供给不同试剂的情况下，识别元件(在本发明的情况下，是指沉积的裂解物中包含的蛋白)的粘附，在纯粹地吸附地固定化到表面上以后，经常是不够的。因此，如果固体支持物包含沉积样品的粘附促进层，以改善它们的粘附，则是优选的。
粘附促进层具有优选地小于200nm，尤其优选地小于20nm的厚度。
多种材料适用于产生粘附促进层。例如，粘附促进层可以包含下述化合物硅烷，官能化的硅烷，环氧化物，官能化的、带电荷的或极性的聚合物和“自组织的被动的或官能化的单层或多层”，硫醇，磷酸烷基酯和膦酸烷基酯，多官能的嵌段共聚物，例如聚(L)赖氨酸/聚乙二醇。
所述粘附促进层也可以包含通式I(A)的有机磷酸类化合物Y-B-OPO3H2(IA)或通式I(B)的有机磷酸类化合物Y-B-PO3H2(IB)和它们的盐，其中B是烷基、链烯基、炔基(alkinyl)、芳基、芳烷基、杂芳基(hetaryl)或杂芳基烷基残基，Y是氢或下述系列的官能团，例如，羟基、羧基、氨基、任选地被低级烷基取代的单或二烷基氨基、硫醇，或下述系列的负酸性基团，例如，酯、磷酸酯、膦酸酯、硫酸酯、磺酸酯、马来酰亚胺、succinimydyl、环氧或丙烯酸酯。这些化合物已经更详细地描述在国际专利申请PCT/EP 01/10077中，其在这里整体引入本公开内容。
优选地，以使固定化在测量区中的样品(稀释的或未稀释的细胞裂解物)的相对分子组成与应用到所述测量区的样品的原始相对分子组成相同的方式，设计根据本发明的方法。例如，如果沉积在测量区中的样品的材料量等于或小于在固体支持物上形成单层所需的材料量，则可以满足该要求。同时，在亚单层覆盖固体支持物表面的情况下，获得作为分析物的蛋白对结合试剂和如果适当，要与其接触的其它检测试剂的最佳可接近性。如果预先沉积的粘附促进层能导致定向的固定化，例如，如果沉积的样品中包含的抗体固定化地结合到它们的Fc-部分，而导致它们的特异性结合表位的可接近性，则甚至可以进一步提高可接近性。
根据本发明的方法允许测定沉积的样品中含有的作为分析物的一种或多种化合物的相对总量，作为它们以磷酸化的或未磷酸化的形式和/或糖基化的和/或未糖基化的形式出现的总和。如果在它们以磷酸化的和/或未磷酸化的形式和/或糖基化的和/或未糖基化的形式出现的每种情况下，测定沉积的样品中含有的作为分析物的一种或多种化合物的一种或多种所述形式的相对量，则是优选的。
根据本发明的方法允许测定样品中含有的一种或多种分析物的如上所定义的活化程度。具体地，根据本发明的方法允许测定样品中含有的一种或多种分析物的磷酸化程度和/或糖基化程度和/或甲基化程度和/或乙酰化程度。作为高灵敏度和高精确度和再现性的结果，尤其是作为同时或可替代地应用的许多独立的参照和校正方法的结果，根据本发明的方法的特征也在于，可以测定第一种样品和一种或多种对比样品中作为分析物的包含在磷酸化的和/或未磷酸化的和/或糖基化的和/或未糖基化的和/或甲基化的和/或未-甲基化的和/或乙酰化的和/或未-乙酰化的形式中一种或多种化合物的一种或多种所述形式之间的相对量的小于20％，优选地小于10％的差异。根据本发明的方法也允许通过测量来自不同的有关的或无关的细胞群体的裂解物，来测定各蛋白浓度、蛋白表达谱的小差异，例如40％，优选地小于30％，最优选地小于10％。
作为使用一种且相同的分析平台进行参照和/或校正的固有的、方法特异性的高灵敏度和可能性的多样性的结果，根据本发明的方法的一个重要的优点是，用该方法得到的测量结果的变化非常小。因而，根据本发明的方法也适用于研究生物或细胞培养物的疾病和/或外部操纵生物或细胞培养物后影响的含有的蛋白的相对量或浓度的瞬时演变(即变化)。
如果为了使示踪化合物的非特异性的结合最小化，使离散测量区之间的区域“钝化”，则是有利的，即将对分析物(即蛋白)和沉积的样品的其它内容物和所述分析物(即蛋白)的结合试剂和/或检测试剂“化学中性的”(即不结合的)化合物沉积在侧向分隔的测量区之间。
所述对分析物(即蛋白)和沉积的样品的其它内容物和所述分析物的结合试剂和/或检测试剂“化学中性的”(即不结合的)化合物，可以选自清蛋白，尤其是牛血清清蛋白或人血清清蛋白，酪蛋白，非特异性的、多克隆的或单克隆的、异源的或经验上非特异性的抗体(对于待测分析物，尤其是用于免疫测定)，去污剂-例如Tween 20-，不能与待分析的多核苷酸杂交的片段化的天然的或合成的DNA，例如鲱鱼或鲑鱼精子的提取物，或者无电荷的但是亲水的聚合物，例如聚乙二醇或葡聚糖。
不丧失一般性，待检测且包含在沉积在离散测量区中的样品中的作为分析物的蛋白，可以是下述蛋白化合物胞质、核和膜蛋白，体液中的分泌蛋白(胞质的和膜结合的细胞蛋白，尤其是参与细胞中的信号转导过程的蛋白，例如激酶)，翻译后修饰的蛋白，如磷酸化的、糖基化的、甲基化的和乙酰化的形式的蛋白，特别是在处理下超表达或表达不足的蛋白，其包括抗体，人工超表达的蛋白，人工超表达的修饰的蛋白，如具有另外的结合位点的功能化的蛋白(“标记蛋白”，例如“组氨酸标记蛋白”)，和荧光蛋白(“绿色荧光蛋白”，GFP等)。分析物可以是生物技术修饰的聚合物，例如，分别包含发光或荧光基团的生物表达的生物聚合物，例如“蓝色荧光蛋白”(BFP)、“绿色荧光蛋白”(GFP)或“红色荧光蛋白”(RFP)。
根据本发明的方法的一个实施方案，在结合添加的特异性结合试剂和如果适当，依次或在一个添加步骤中添加的检测试剂的步骤中，在检测试剂结合到结合试剂上后，根据待分析的稀释的或未稀释的沉积的裂解物中含有的磷酸化的和/或未磷酸化的形式和/或糖基化的和/或未糖基化的形式的发生，区分待检测且包含在沉积在离散测量区中的稀释的或未稀释的裂解物中的蛋白。
在另一个实施方案中，在结合添加的特异性结合试剂和如果适当，依次或在一个添加步骤中添加的检测试剂的步骤中，在检测试剂结合到结合试剂上后，在待分析的稀释的或未稀释的沉积的裂解物中含有的磷酸化的或未磷酸化的形式和/或糖基化的或未糖基化的形式的发生之间，不区分待检测且包含在沉积在离散测量区中的稀释的或未稀释的裂解物中的蛋白。
离散测量区中的待测分析物的特异性结合试剂，可以选自能特异性地结合所述蛋白分析物的化合物，如抗体对抗原，反之亦然，物种抗体的抗-物种抗体等，如本领域的专家所众所周知的。
检测试剂可以选自为例如特异性的光检测方法专用的试剂或标记，包含，基于局部分辨的电子自旋共振(ESR)测量的测量的ESR自旋标记，基于局部分辨的核磁共振(NMR)测量的测量的核磁共振(NMR)标记，用于测量作为标记的放射性同位素的放射性标记，质量标记，如用于局部分辨测量由于测量区的分子量的解吸或吸附造成的折射率变化的珠子，发光标记，特别是荧光标记(下面将进一步解释)。在将结合试剂加入测量区阵列后，或在结合第一种检测试剂(如将作为检测试剂的抗-物种抗体应用于分析物-特异性的抗体)后，可以随后应用这些标记，或作为检测试剂的整个部分。标记也可以直接附着到结合试剂上。
如果直接地或由粘附促进层介导地与产生的测量区物理接触的基本上平面的固体支持物的材料基本上是光学透明的，则是优选的。
如果应用到固体支持物上的粘附层的材料同样基本上是光学透明的，则也是优选的。
优选地，基本上光学透明的固体支持物的材料包含选自下述的材料可模塑的、可喷涂的或可轧的塑料，金属，金属氧化物，硅酸盐，例如玻璃、石英或陶瓷。
依赖于固体支持物的物理设计，分析物测定中的信号产生的度量衡学类型存在几种可能性。通常，一种方法是优选的，其中来自一个或多个多色或单色光源的探测光指向测量区的一个或多个阵列中的一个或多个测量区，并测量和记录从所述测量区的一个或多个阵列发出的光信号和/或这些光信号的变化。
该方法的一组实施方案的特征是，在表面照明(epi-illumination)构型中送递探测光。
另一组实施方案的特征是，在透射照明构型中输送探测光。
优选地，离散测量区中的一种或多种蛋白的检测基于一种或多种发光的强度或强度的变化的检测。
根据信号检测的方法的特定组的实施方案的特征是，离散测量区中的一种或多种蛋白的检测基于所述测量区上或在离这些测量区小于1μm的距离内的折射率的变化的检测。
在根据本发明的方法的该组特定实施方案内，一个变体的特征在于，所述测量区上或在离这些测量区小于1μm的距离内的折射率的变化的检测基于从在固体支持物上产生的测量区区域中的平面状固体支持物发出的光被从对不同折射率材料的界面平面发出的光干涉的模式的变化的检测，其原因是由于应用的特异性结合配偶体的结合或解吸或置换，造成的从所述界面发出的光和从测量区区域发出的光之间的相差的变化，且其中以局部地和如果适当，光谱地分辨的方式，测量从不同区域发出的干涉光。该实施方案的测量方法基于众所周知的从不同折射率的不同的平行薄层发出的光的干涉原理，其可以通过下述方式来利用以局部分辨的方式(相对于携带测量区阵列的固体支持物)，测定对待测蛋白和如果适当，额外应用的检测试剂特异性的结合试剂的结合诱导的相差和它们的变化，和/或干涉模式的光谱变化。
根据本发明的方法的该组实施方案内的另一个变体的特征是，用薄金属层，优选银或金，且优选地以20nm至200nm的厚度，提供固体支持物，其直接地或由粘附促进层介导地接触测量区，且所述测量区上或在离这些测量区小于1μm的距离内的折射率的变化的检测基于在所述金属层产生表面等离子子体共振的条件的变化的检测。
作为测量技术，可以为共振条件的变化的测定，测量共振角(在恒定波长的照射光的入射角变化后)和共振波长(在恒定入射角的照射激发波长变化后)。结果，所述共振条件的变化，可以由用于在作为所述固体支持物的一部分的薄金属层中产生表面等离子体的激发光的照射共振角的变化来反映。因此，所述共振条件的变化，也可以由用于在作为所述固体支持物的一部分的薄金属层中产生表面等离子体的照射激发光的共振波长的变化来反映。
作为特异性的结合试剂和/或检测试剂向离散测量区的样品中含有的作为分析物的蛋白的结合的后果，当作为损耗场传感器平台来提供时，所述固体支持物上的这些区域的有效折射率的局部变化，会造成要以侧向分辨的方式测定的光信号的变化。
在根据本发明的方法的另一个优选的实施方案中，固体支持物包含连续的光波导或分成单个的波导区的光波导。
如果光波导是光学薄膜波导，其具有第一个基本上光学透明的层(a)，后者面向具有比层(a)更低的折射率的第二个基本上光学透明的层(b)上的携带离散测量区的表面，则是尤其优选的。
因此，一个实施方案是优选的，其中，为了将探测光输入耦合(in-couple)进光学透明层(a)，使该层与一个或多个选自下述的光学输入耦合元件光学接触棱镜耦合器，具有重迭损耗场的组合光波导的损耗耦合器，具有聚光透镜的平端头耦合器，优选柱面透镜，其排列在波导层的一个面的前面，和光栅耦合器。
如果使用一个或多个特征在于光学透明层(a)的光栅结构(c)，将探测光输入耦合进光学透明层(a)，则是尤其优选的。
有效折射率的(局部)变化的检测的另一个变体的特征是，使用一个或多个特征在于光学透明层(a)的光栅结构(c’)，输出耦合光学透明层(a)中引导的光。在该情况下，可以将输出耦合角的变化(由输出耦合光栅上的分子量变化造成)用作测量参数。
在用于产生表面等离子体共振(如上所述)和将激发光耦合进波导层的构型中，当达到最大共振(或输入耦合进波导层)时，送递的光的波长可以保持恒定，并改变和记录匹配共振条件的角度，或者，入射角可以保持恒定，照射波长可以变化(例如，使用光谱可调谐激光或激光二极管)，并测量和记录当匹配共振条件时的波长。
如果作为结合试剂和任选地应用的检测试剂向离散测量区的样品中含有的分析物的结合的结果，要侧向分辨地测定的光信号的变化，是由位于固体支持物上的能发光的分子发出的一种或多种光的局部变化造成的，则是优选的。
如果将光波导设计成光学薄膜波导，其具有第一个光学透明层(a)，后者在具有比层(a)更低的折射率的第二个光学透明层(b)上，其中在一个或多个特征在于光学透明层(a)的光栅结构的辅助下，将探测光进一步输入耦合进光学透明层(a)，并作为导波送递给位于其上的测量区(d)，且其中使用一个或多个检测器，进一步测定在所述导波的损耗场中产生的能发光的分子的发光，且从这些发光信号的强度，确定测量区中含有的蛋白的相对量，则是特别优选的。
如果发光或一种或多种发光的变化源自能发光的分子或纳米颗粒(nanoparticle)，其作为发光标记，结合到一种或多种检测试剂上，或结合到离散测量区中含有的作为分析物的蛋白的一种或多种结合试剂上，则是优选的。
如果在与已经特异性地结合到测量区中的待测蛋白上的结合试剂相结合的检测试剂激发后，产生发光，且其中检测试剂包含用作发光标记的发光染料或发光纳米颗粒，其可以被激发，并在300nm至1100nm的波长发射，则是优选的。
如果将具有不同的发射波长和/或不同的激发光谱、优选地具有不同的发射波长和相同的激发波长的2种或更多种发光标记应用于分析物检测，则是尤其优选的。例如，如果具有不同的光谱性质、尤其具有不同的发射波长的几种发光标记，结合到不同的检测试剂上，或直接结合到结合试剂上，其接触测量区，则可以在单个检测步骤中测定不同的分析物，即当测量区接触所述检测试剂并同时或连续地检测产生的发光时，如果必要，在发射不同波长的探测光(或激发光，分别地)后。
根据本发明的方法的这样的变体尤其适用于例如，使用2种对应的不同的可区分的检测试剂，同时检测例如磷酸化和未磷酸化形式的化合物(蛋白)，尤其是也在一个(共同)测量区内。
以类似的方式，如果将具有不同的发射衰减时间(发射寿命)的2种或更多种发光标记(作为检测试剂的全部或完整部分)应用于分析物检测，则可以同时检测2种或更多种分析物。
对于根据本发明的方法，因此如果将2种或更多种发光标记应用于检测样品中的不同分析物，则是优选的。如果将2种或更多种发光标记应用于检测测量区中的不同分析物，则也是优选的。
如果以1fs至10分钟的持续时间，脉冲照射激发光，并以时间-分辨的方式，测量测量区的发射光，则也是有利的。
一个特别的变体在于测量区上的有效折射率的变化，后者在除了测定一种或多种发光之外进行测定。
为了进一步提高灵敏度，这里如果作为偏振-选择性的测量，进行一种或多种发光的测定和/或激发波长的光信号的测定，则是有利的。这里如果在不同于激发光的偏振的偏振，测量一种或多种发光，则是优选的。
本发明的另一个主题是分析平台，其用于光信号读数和产生一种或多种细胞群体的定性和/或定量蛋白表达谱，其包含-基本上平面的固体支持物，-所述固体支持物上的离散测量区的一个或多个一维或二维阵列，所述阵列通过下述方式产生以稀释的或未稀释的形式，将小量细胞裂解物在离散的位点直接沉积到所述固体支持物或预先应用在所述固体支持物上的粘附促进层上，该细胞裂解物源自一种或多种细胞群体，且含有许多由这些细胞群体表达的蛋白，其中所述基本上平面的固体支持物是无孔的，且任选地应用的粘附促进层具有小于1μm的厚度。
本发明的一个具体的主题是分析平台，其用于光信号读数和产生一种或多种细胞群体的定性的和/或定量的有差别的蛋白表达谱，其包含-基本上平面的固体支持物，-所述固体支持物上的离散测量区的一个或多个一维或二维阵列，所述阵列通过下述方式产生以稀释的或未稀释的形式，将小量2种或更多种细胞裂解物在离散的位点直接沉积到所述固体支持物或预先应用在所述固体支持物上的粘附促进层上，该细胞裂解物源自2种或更多种细胞群体，且含有许多由这些细胞群体表达的蛋白，其中所述基本上平面的固体支持物是无孔的，且任选地应用的粘附促进层具有小于1μm的厚度。
已经从如上定义的无关的细胞群体，产生了不同的沉积的细胞裂解物。
还已经从共同细胞群体得到的不同的细胞亚群，产生了不同的沉积的细胞裂解物。
根据本发明的分析平台的一个变体的特征是，已经在不同的时间点，从已经从共同细胞群体得到的不同的细胞亚群，产生了不同的沉积的细胞裂解物。
还已经从共同细胞群体得到的不同的细胞亚群，产生了不同的沉积的细胞裂解物，然后用不同的试剂处理或刺激，和/或暴露于不同的培养条件。
具体地，已经从患病的和健康的细胞群体，产生了不同的沉积的裂解物。
沉积的裂解物所来源的健康的或患病的和/或处理的或未处理的和/或刺激的细胞群体可以源自原核细胞，例如细菌，和真核细胞，例如人、动物或植物细胞，特别是人或动物组织，例如器官、皮肤、毛发或骨组织，或植物组织，和含有细胞的体液或它们的组分，例如血液、血清或血浆、滑液、泪液、尿、唾液、组织液、淋巴。
如果以稀释的或未稀释的形式，在离散的位点沉积到固体支持物或应用在所述固体支持物上的粘附促进层上的裂解物，具有与裂解物所来源的细胞群体相同的待测蛋白的相对分子组成，则是优选的。
如果对沉积的裂解物不进行过滤和/或分级分离和/或稀释以外的其它样品处理步骤，则是尤其优选的。
由于根据本发明的分析平台提供的高检测灵敏度，所以沉积在单个测量区中的材料可以对应着小于1000细胞的蛋白内容物。
根据本发明的分析平台的一个有利的实施方案是，其中阵列包含超过50，优选地超过500，最优选地超过5000个测量区的实施方案。
这里的每个测量区可以包含固定化的“性质相同的”样品或对比样品，其与固定化在其它测量区中的样品相似或不同。
阵列的测量区可以以超过10、优选地超过100、最优选地超过1000测量区/平方厘米的密度进行排列。
尤其是，为了促进测定和/或对比细胞群体的蛋白表达谱的分析方法，当将作为不同待测蛋白的特异性结合配偶体的不同结合试剂应用到每种待测蛋白的不同阵列上时，如果适当，组合应用一种或多种检测试剂，如果可以区分，其可以以2或更大的数目应用于相同的阵列，那么如果测量区的相同阵列的副本提供在共同固体支持物上，则是有利的因此，在根据本发明的分析平台的另一个优选的实施方案中，是测量区的多个阵列，其排列成稀释的或未稀释的细胞裂解物的沉积位点的相同的几何形状，即相对于与来自沉积在其中的相同(稀释的或未稀释的)细胞裂解物的沉积量相对应的2个不同阵列中的测量区的行和列的类似位置。
如果应用在固体支持物上的粘附促进层具有小于200nm、优选地小于20nm的厚度，则是优选的。
粘附促进层可以包含下述化合物硅烷，官能化的硅烷，环氧化物，官能化的、带电荷的或极性的聚合物和“自组织的被动的或官能化的单层或多层”，硫醇，磷酸烷基酯和膦酸烷基酯，多官能的嵌段共聚物，例如聚(L)赖氨酸/聚乙二醇。
所述粘附促进层也可以包含通式I(A)的有机磷酸类化合物Y-B-OPO3H2(IA)或通式I(B)的有机磷酸类化合物Y-B-PO3H2(IB)和它们的盐，其中B是烷基、链烯基、炔基、芳基、芳烷基、杂芳基或杂芳基烷基残基，Y是氢或下述系列的官能团，例如，羟基、羧基、氨基、任选地被低级烷基取代的单或二烷基氨基、硫醇，或下述系列的负酸性基团，例如，酯、磷酸酯、膦酸酯、硫酸酯、磺酸酯、马来酰亚胺、succinimydyl、环氧或丙烯酸酯。这些化合物已经更详细地描述在国际专利申请PCT/EP 01/10077中，其在这里整体引入本公开内容。
根据本发明的分析平台的实施方案的特征在于，为了使示踪化合物的非特异性的结合最小化，使离散测量区之间的区域“钝化”，即将对结合试剂和如果适当，对检测试剂“化学中性的”(即不结合的)化合物沉积在侧向分隔的测量区之间。
待检测且包含在沉积在离散测量区中的稀释的或未稀释的裂解物中的蛋白，可以是下述蛋白化合物胞质、核和膜蛋白，体液中的分泌蛋白(胞质的和膜结合的细胞蛋白，尤其是参与细胞中的信号转导过程的蛋白，例如激酶)，翻译后修饰的蛋白，如磷酸化的、糖基化的、甲基化的和乙酰化的形式的蛋白，特别是在处理下超表达或表达不足的蛋白，其包括抗体，人工超表达的蛋白，人工超表达的修饰的蛋白，如具有另外的结合位点的功能化的蛋白(“标记蛋白”，例如“组氨酸标记蛋白”)，和荧光蛋白(“绿色荧光蛋白”，GFP等)。
如果直接地或由粘附促进层介导地与产生的测量区物理接触的基本上平面的固体支持物的材料基本上是光学透明的，则是优选的。
同样地，如果应用到固体支持物上的粘附层的材料也基本上是光学透明的，则是优选的。
优选地，基本上光学透明的固体支持物的材料包含选自下述的材料可模塑的、可喷涂的或可轧的塑料，金属，金属氧化物，硅酸盐，例如玻璃、石英或陶瓷。
在根据本发明的分析平台的另一个实施方案中，用薄金属层，优选银或金，且优选地以30nm至200nm的厚度，提供固体支持物，其直接地或由粘附促进层介导地接触测量区，该平台可操作用于在所述金属层产生表面等离子体共振。根据本发明的分析平台的一个特别的变体包含损耗场传感器平台，其作为分析平台的一部分，包含薄金属层，其任选地处于位于其下面的折射率优选地＜1.5的中间层上，例如二氧化硅或氟化镁，且其中以在照射的激发光和/或产生的发光的波长激发表面等离子体的方式，选择金属层和任选的中间层的厚度。
这里如果金属选自金和银则是优选的。如果金属层具有10nm至1000nm，优选地30nm至200nm的厚度，则也是优选的。
在另一个实施方案中，优选地，固体支持物包含连续的光波导或分成单个的波导区的光波导。
如果光波导是光学薄膜波导，其具有第一个基本上光学透明的层(a)，后者面向具有比层(a)更低的折射率的第二个基本上光学透明的层(b)上的携带离散测量区的表面，则是优选的。
特别优选地是，根据本发明的分析平台包含一个分析平台，其中，为了将探测光输入耦合进光学透明层(a)，使该层与一个或多个选自下述的光学输入耦合元件光学接触棱镜耦合器，具有重迭损耗场的组合光波导的损耗耦合器，具有聚光透镜的平端头耦合器，优选柱面透镜，其排列在波导层的一个面的前面，和光栅耦合器。
如果一个或多个光栅结构(c)特征在于光学透明层(a)，以允许将探测光输入耦合进光学透明层(a)，则是有利的。
本发明还包含含有光学薄膜波导的分析平台，其中将所述光波导设计成光学薄膜波导，其具有第一个光学透明层(a)，后者在具有比层(a)更低的折射率的第二个光学透明层(b)上，且其中在一个或多个特征在于光学透明层(a)的光栅结构的辅助下，分析平台可操作用于将探测光输入耦合进光学透明层(a)，从而将所述探测光作为导波送递给测量区(d)，并激发能在所述导波的损耗场中发光的分子的发光。
本发明的另一个主题是，根据上述实施方案中的任一种的方法和/或根据上述实施方案中的任一种的分析平台在下述领域中的用途定量的和/或定性的分析，用于在药物研究、组合化学、临床和临床前开发的筛选方法中测定蛋白，用于亲和筛选和在研究中的实时结合研究和测定动力学参数，尤其是用于测定蛋白质组的蛋白质组差异，用于测量蛋白-DNA相互作用，用于测定蛋白(生物)合成的控制机理，用于筛选生物和化学标记化合物，用于患者分级。
在下面，通过应用实施例，进一步解释了本发明。本文中的实施方案不暗示一般性的任何丧失。
根据上述实施方案中的任一种的方法和/或根据上述实施方案中的任一种的分析平台，特别适用于途径激活标记的高通量特征分析，这在使蛋白的修饰对它们的表达的作用关联后进行，适用于在药物发现中表征和/或筛选化合物和/或药物候选物的功效和/或毒性，这在应用给作为疾病有关的应用的生物模型的细胞培养物(群体)后进行，适用于生物标记监控、生物标记发现和验证，药物靶的发现、验证和监控(例如，在使蛋白表达/表达活化和对应用的药物的反应关联后进行)，测定细胞-或组织-特异性的蛋白表达和/或例如处于不同发育状态(例如，癌性早前期和晚期)的癌细胞中的蛋白表达的活化，适用于将蛋白表达谱和它们的变化与生物事件相关联，适用于所谓的信号传导途径的“全局分析”，且适用于筛选抗裂解物样品中含有的蛋白靶的抗体组或文库的最好的特异性、选择性和亲和力。
实施例1.材料1.1.组织裂解物样品使用2种不同的组织裂解物，将为它们建立有差别的蛋白表达谱。裂解物从源自共同细胞群体的细胞亚群得到已将癌性组织(＝共同细胞群体)分成2个细胞亚群，然后彼此独立地培养。其中的一个不经进一步处理，并用于产生对照样品(“肿瘤裂解物1”)。化学地处理另一个细胞亚群，并然后用于产生第二个裂解物样品(“肿瘤裂解物2”)。样品具有下述特征
根据改进的Bradford试验，使用PIERCE考马斯Plus-试剂盒(见3.1部分)，测定蛋白浓度。
1.2.抗体和测定试剂选择下述标记-特异性的抗体，并用作特异性结合试剂(CST＝Cell Signaling Technology，Inc.，Beverly，MA 01915，美国，BD＝BDBiosciences，Basel，瑞士)·α-P-p44/42 MAPK(CST#9101)兔子·α-P-Akt(CST#4051)小鼠IgG2b·α-P-p38(CST#9211)兔子·α-P-SAPK/JNK(CST#9251)兔子·α-P-IκB-α(CST#9241)兔子·α-P-Stat3(CST#9138)小鼠IgG1·α-P-组蛋白H3(CST#9706)小鼠IgG1·α-P-Rb(CST#9308)兔子·α-P-p53/Ser15(CST#9284)兔子·α-细胞周期蛋白D1(CST#2926)小鼠IgG2a·α-切割的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3(CST#9664)兔子·α-切割的PARP(CST#9541)兔子·α-α-连环蛋白(BD#6101193)·α-β-连环蛋白(CST#9562)下面的荧光标记的化合物用作组织裂解物阵列的质量控制的检测试剂●Cy3-α-β-肌动蛋白(自身标记的)
下面的荧光标记的抗-物种抗体用作检测试剂●Alexa Fluor 647(α-兔子IgG)；Molecular Probes#Z-25308●Alexa Fluor 647(α-小鼠IgG1)；Molecular Probes#Z-25008● Alexa Fluor 647 (α-小鼠IgG2a)；Molecular Probes#Z-25108● Alexa Fluor 647(α-小鼠IgG2b)；Molecular Probes#Z-25208根据供应商的推荐，以在含有5％牛血清清蛋白(BSA)或5％脱脂奶粉的测定缓冲液中1∶250的稀度，使用所有分析物-特异性的抗体。以在含有5％BSA的测定缓冲液中1∶500的稀度，使用检测试剂(荧光-标记的Fab片段)。
2.作为根据本发明的分析平台的一部分的固体支持物使用平面状薄膜波导，作为根据本发明的分析平台的一部分的基本上平面的固体支持物，其具有14mm宽×57mm长×0.7mm厚的尺寸。这些薄膜波导包含玻璃基质(AF 45，作为第二个光学透明层(b))和五氧化二钽的150nm薄的高折射层(作为沉积在其上面的第一个光学透明层(a)。将平行于这些平板的长度的2个表面浮雕光栅(光栅结构(c)和(c′)，以彼此相距9mm的距离，调整在玻璃基质中(光栅周期318nm，光栅深度12nm+/-2nm)。用作将光输入耦合进高折射层的衍射光栅的这些结构在随后高折射层的沉积中延续进五氧化二钽层的表面。
小心地清洁薄膜波导平板后，在含水溶液(0.5mM DDP)中沉淀后，通过自发的自装配，在金属氧化物层的表面产生单十二烷基磷酸酯(DDP)的单层，作为粘附促进层。最初亲水的金属氧化物表面的这种表面修饰会产生疏水表面(对水的接触角是约100°)，其上面应沉积多个(稀释的或未稀释的)裂解物样品。
3.方法-组织裂解物阵列生产、测定准备和数据分析3.1.蛋白定量使用作为标准品的溶于10-倍稀释的裂解缓冲液中的BSA，用PIERCE考马斯Plus试剂盒(PIERCE#23238)，测定组织裂解物的蛋白浓度。在磷酸缓冲盐水(PBS)中，将组织裂解物稀释10倍，然后加入比色试剂。结果显示在1.1部分。
3.2.测量区和阵列几何形状的产生将组织裂解物稀释至用于沉积(“点样”)到如第2部分所述的随粘附促进层一起提供的固体支持物上的最终裂解物浓度。点样溶液的蛋白浓度分别是0.26mg/ml、0.21mg/ml、0.16mg/ml和0.10mg/ml，其溶于含脲的点样缓冲液中。使用墨水喷射点样器，通过沉积约400pl体积的单个小滴，在固体支持物上产生离散测量区(“点”)。在共同列中，彼此临近地产生来自每份裂解物溶液的2个重复点，且在一行中，总是从4份不同的裂解物稀释液，产生4个测量区(见图1)。将2个另外的、不同处理的细胞裂解物(在图1上部的放大图中称作“未公开的细胞裂解物”)点样为测定性能的内部阳性对照。阳性对照一般能揭示处理后信号传导途径标记蛋白P-Akt和P-Erk2水平的上调。点样缓冲溶液(不含有任何细胞或组织裂解物)产生用作阴性对照的测量区。
除了分别包含沉积的裂解物样品和缓冲溶液的测量区外，每个阵列还包含另外的测量区，后者含有固定化的用Cy5荧光标记的牛血清清蛋白(Cy5-BSA)，所述测量区用于参照激发光强度的局部差异和/或瞬时变化(在图1下部的放大图中称作“参照”)。以在3.5M脲、1M硫脲中0.5nM的浓度，沉积Cy5-BSA(标记比率约3Cy5分子/BSA分子)。将来自这些参照点的荧光信号用于信号标准化，以补偿阵列内部和之间的激发光强度的差异。
产生组织裂解物阵列后，通过用溶于50mM咪唑/100mM NaCl(pH7.4)中的BSA(30mg/ml)溶液温育表面，用牛血清清蛋白(BSA)饱和未涂布蛋白的平台的自由疏水区，其中BSA用作对分析物和沉积的样品的其它内容物和要应用的结合试剂和检测试剂“化学中性的”(即不结合的)化合物，以使向表面的非特异性的结合最小化。然后，用纯化水洗涤分析平台，在氮气流中干燥，并在使用前，在黑暗中保藏在4℃。
每个分析平台包含6个相同的测量区阵列。如国际专利申请WO 01/43875和WO 02/103331所述，将流体性的结构附着到分析平台的表面，以产生6个样品隔室的排列，所述隔室的内部体积为15μl，每个含有6个测量区阵列中的一个。
测定方法通过检测作为持家蛋白的β-肌动蛋白，进行裂解物阵列的质量控制，即遗漏点、点形状和均匀性以及应用的相对蛋白浓度的测定。通过将在含有5％BSA的测定缓冲液中的500-倍稀释的Cy3-α-β-肌动蛋白抗体加到一个测量区阵列上(应用浓度6nM)，随后在25℃温育1小时，在单步测定中进行β-肌动蛋白的检测。用含有5％BSA的测定缓冲液去除多余的荧光标记的抗体后，使用ZeptoREADERTM，通过产生的荧光信号的激发和检测，对阵列进行检测步骤(见下文)。
在2步依次测定中，检测组织裂解物点中的分析物(标记-特异性的蛋白)。第一步包含，将作为特异性的结合试剂的分析物-特异性的抗体(见1.2部分)加入测量区阵列，并温育过夜(在25℃)。在该情况下，总是将仅仅一种结合试剂应用到每个单阵列，从而致使列出的14种不同的结合试剂的应用，需要应用到14个不同阵列。去除多余的抗体后，用作为检测试剂的荧光标记的抗-物种Fab-片段，在25℃温育阵列1小时。将共同荧光标记(Alexa Fluor 647)用于信号产生，其附着到不同的抗-物种抗体上。根据它们的物种特异性，将不同的抗-物种抗体用作已经应用对应的结合试剂(小鼠或兔子抗体)的阵列的检测试剂。最后，用含有5％BSA的测定缓冲液洗涤阵列，并使用ZeptoREADERTM，通过产生的荧光信号的激发和检测，进行检测步骤(见下文)。
3.4检测来自测量区阵列的荧光信号使用ZeptoREADERTM(Zeptosens AG，Benkenstrasse 254，CH-4108 Witterswil)，以自动化的方式，依次测量来自测量区的各阵列的荧光信号。基本测量步骤如下对于测量区的每个阵列，调节根据本发明的分析平台，以匹配共振条件，用于将光输入耦合进波导五氧化二钽层，并用于使在测量区可得到的激发光最大化。然后，对于每个阵列，产生来自对应阵列的荧光信号的图像，其中操作者可以选择不同的曝光时间和要产生的图像的数目。在本实施例的测量的情况下，对于Cy5或Alexa Fluor 647荧光标记的激发，激发波长是633nm；对于Cy3荧光标记的激发，是532nm。使用冷却的照相机，使用干涉滤光片(透射675nm+/-25nm，“红色检测通道”)抑制位于照相机透镜前面的散射光，检测Cy5或Alexa Fluor 647在荧光波长的荧光。为了检测从在532nm激发的从Cy3荧光标记发出的荧光，使用在572nm+/-25nm(“绿色检测通道”)透射的干涉滤光片。产生的荧光图像自动储存在控制计算机的磁盘中。光学系统(ZeptoREADERTM)的其它细节描述在国际专利申请PCT/EP01/10012中，其整体引入本申请中。
3.5.数据分析使用能自动分析来自测量区的多个阵列的荧光图像的图像分析软件(ZeptoVIEWTM，Pro 2.0 Release 2.0，Zeptosens AG，CH-4108Witterswil)，测定与来自测量区(点)的裂解物样品分析物浓度的相对浓度对应的荧光信号强度。
照相机的单个像素的原始数据对应着数字化的测量数据的二维矩阵，从而对应着传感器平台的成像区域。为了数据分析，首先以使每个点的图像分数被包含在单个的二维网格单元中的方式，将二维坐标网格重叠到图像点(像素)上。在该网格单元内，将具有用户可定义的半径的可调节的圆形“目标区域”(AOI)分配给每个点。在该情况下，将点直径恒定地设定为120μm。将在选择的分析区内的像素值的算术平均值(信号强度)测定为每个点的平均的总信号强度。
从点之间测量的信号强度，确定背景信号。为此目的，将4个另外的圆形区(一般具有与点的分析区相同的半径)定义为每个点的背景信号测定的分析区，其优选地位于相邻点之间的中心。将平均背景信号强度测定为，例如，4个圆形区之一的定义的AOI内的像素值的算术平均值(信号强度)。然后，将来自测量区(点)的平均净信号强度计算为对应点的平均局部总的和背景信号强度之间的差异。
通过测量区的每个阵列的参照点(Cy5-BSA)，参照所有裂解物样品点的净信号强度。为此目的，通过插值法，计算特定行中的2个相邻的测量参照点之间的每个裂解物样品点位置的人工参照点信号强度。然后，对于每个裂解物样品点，通过用平均分析物点净信号强度除以对应人工参照点净信号强度的平均值，计算参照荧光强度。该参照方法在每个微阵列中和不同的微阵列之间能补偿沿着垂直于光传播方向可得到的激发光强度的局部差异。
为了进一步分析，为每次处理和每种抗体，将从如上所述的每个重复的点对平均得到的参照荧光强度(RFI)，绘制成应用的各组织裂解物的蛋白浓度的函数(未显示数据)。作为实例，对于β-肌动蛋白测量，显示了这样的作为校正曲线的稀释图(图3)。从该稀释图，为应用的最能线性拟合实验数据的(4个稀度的)蛋白浓度，标准化信号。此后，平均标准化的信号。因此，包含4个不同稀度的细胞裂解物的每个阵列区域(8个点)，最终为每个样品和抗体提供了标准化的表达信号。最后，将结果总结为条形图，每个条代表着标准化的表达信号(在RFI中)；误差条对应着这些标准化的表达信号的标准差。
4.结果4.1.组织裂解物阵列的产生-质量控制用能测量作为持家蛋白的β-肌动蛋白的表达水平的测定，检查点样的裂解物阵列的质量(例如，遗漏点的数目、点形状、点形态学、相对蛋白浓度)。使用在图1中称作“未公开的细胞裂解物”的、应用在测量区阵列上的、作为检测试剂的Cy3-标记的抗-β-肌动蛋白抗体，在ZeptoREADERTM的绿色检测通道中进行测量。
达到了生产的芯片的良好阵列质量●无遗漏点●良好的点形状●良好的点均匀性图2在左侧显示了与1∶500稀释的Cy3-抗-β-肌动蛋白温育后的荧光图像(曝光时间5秒，显示范围0-20’000)。图2的右侧解释了阵列的设计(几何形状)(1＝未公开的、对照细胞裂解物，2＝未公开的、处理的细胞裂解物，3＝点样缓冲液，4＝未处理的结直肠癌组织裂解物＝“肿瘤裂解物1”，5＝处理的结直肠癌组织裂解物＝“肿瘤裂解物2”，6＝空白；对于每种裂解物，沉积的样品的稀度从左向右递增，也见图1)。
在4个不同稀度的细胞/组织裂解物的点样允许●解决信号产生的动态范围，和●使用剂量依赖性的信号斜率，而不是单个的点测量值(即仅仅为单个的蛋白浓度测量的荧光强度)，提取更准确的信号。
对于所有应用的裂解物，观察到随着点样的组织裂解物蛋白浓度的递减，荧光信号强度明显减弱。作为实例，图3显示了通过用Cy3-抗-β-肌动蛋白抗体检测未处理的和处理的肿瘤组织得到的稀释图，其中参照的荧光信号线性依赖于沉积的裂解物样品中的蛋白浓度。数据点总是指示着每个蛋白浓度的2个重复点的平均净荧光信号(RFI＝参照荧光强度)。
图4显示了检测所有点样的细胞/组织裂解物的β-肌动蛋白的条形图，其从3.5部分所述的稀释图得到。
对于“未公开的细胞裂解物”，荧光信号水平是在几乎可对比的高度的，从而表明在相同的浓度点样了不同的细胞裂解物，且处理不会影响β-肌动蛋白的水平。对于结肠癌组织裂解物，与未处理的样品相比，对于处理的样品检测到了略高水平的β-肌动蛋白。由于在制备点样溶液之前，将2种组织裂解物的蛋白浓度平衡至相同的水平，所以得到的差异可能是由于从标准品测定正确的蛋白浓度的误差(一般的误差是在10-15％的范围内)。因此，在下面，为这种β-肌动蛋白信号的差异，校正处理的癌裂解物的所有分析物特异性的信号。
4.2.14种信号传导途径标记的蛋白表达谱为用作特异性的结合试剂的每种不同抗体和沉积的样品中的待测蛋白，测量测量区的一个阵列。在下面，为每种蛋白分析物，显示了从每个测量的微阵列得到的条形图。
图5显示了检测不同样品中的途径激活标记P-Erk2、P-Akt、P-p38、P-SAPK/JNK、P-IκB-α、P-Stat3、α-连环蛋白和β-连环蛋白的条形图。
图6显示了检测不同样品中的增殖标记P-组蛋白H3、P-Rb、P-p53和细胞周期蛋白D1的条形图。
图7显示了检测不同样品中的细胞凋亡标记(切割的PARP，切割的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3)的条形图。
4.3.有差别的蛋白表达谱/结果的总结图8总结了对于结合和检测14种不同的蛋白分析物，从用14种不同的标记抗体表征的2种不同地处理的结肠癌组织裂解物得到的结果。将“倍数信号”变化计算为处理的裂解物样品的信号与对照裂解物样品的信号的比率，从而代表着目标蛋白的有差别的表达谱。虚线指示着蛋白表达的显著的上调和下调的界限上调的界限＝1.24下调的界限＝0.81从更大组的可对比的研究实验，其一般能揭示重复抗体实验的7-14％(平均10％)范围内的倍数信号变化的CV’s，测定这些界限。在这里的实验中，从所有14个单独的抗体测量的平均表达信号(分别来自8个点重复)取平均值得到的一般的变异系数，是在2-20％范围内(平均CV＝8％)的。
这些极限线以上/以下的信号值，指示着处理后显著改变的蛋白表达水平。如从图中可以看出的，对于任一种研究的信号传导标记蛋白，都没有观察到显著的上调。仅仅对于一种蛋白，途径激活标记组的P-SAPK/JNK，观察到了显著的下调(0.50的信号水平)。2种其它的途径激活标记显示出了在显著性界限附近的微小的下调P-Erk2(信号水平0.74)和P-p38(信号水平0.71)。所有其它的分析物没有显示出显著的信号变化。
权利要求
1.产生一种或多种细胞群体的定性和/或定量蛋白表达谱的方法，其包含-产生一种或多种细胞群体的裂解物，该裂解物包含许多由各细胞群体表达的蛋白，-提供基本上平面的固体支持物，-以稀释的或未稀释的形式，将作为沉积样品的小量细胞裂解物在离散的位点直接沉积到所述固体支持物或应用在所述固体支持物上的粘附促进层上，从而在所述固体支持物上建立离散测量区的一个或多个一维或二维阵列，-应用许多结合试剂，作为包含在离散测量区的细胞裂解物中且待测的蛋白的特异性的结合配偶体，且如果适当，向所述测量区的一个或多个阵列上应用一种或多种检测试剂，在检测试剂结合到结合试剂之后，依次地或在一个添加步骤中将所述结合试剂和检测试剂应用到离散测量区的一个或多个阵列，和-以局部分辨的方式，测量和记录从所述离散测量区的一个或多个阵列发出的光信号，其中所述基本上平面的固体支持物是无孔的，且任选地应用的粘附促进层具有小于1μm的厚度。
2.产生2种或更多种细胞群体的定性和/或定量的有差别的蛋白表达谱的方法，其包含-产生细胞群体的第一种裂解物，该裂解物包含许多由各细胞群体表达的蛋白，-产生其它细胞群体的第二种或更多种裂解物，该裂解物包含许多由各细胞群体表达的蛋白，-提供基本上平面的固体支持物，-以稀释的或未稀释的形式，将作为沉积样品的小量细胞裂解物在离散的位点直接沉积到所述固体支持物或应用在所述固体支持物上的粘附促进层上，从而在所述固体支持物上建立离散测量区的一个或多个一维或二维阵列，-应用许多结合试剂，作为包含在离散测量区的细胞裂解物中且待测的蛋白的特异性的结合配偶体，且如果适当，向所述测量区的一个或多个阵列上应用一种或多种检测试剂，在检测试剂结合到结合试剂之后，依次地或在一个添加步骤中将所述结合试剂和检测试剂应用到离散测量区的一个或多个阵列，和-以局部分辨的方式，测量和记录从通过沉积稀释的或未稀释的形式的小量第一种裂解物产生的测量区发出的第一组光信号，-以局部分辨的方式，测量和记录从通过沉积稀释的或未稀释的形式的小量第二种或更多种裂解物产生的测量区发出的第二组或更多组光信号，-对比第一组光信号的测量值和第二组或更多组光信号的值，其中所述基本上平面的固体支持物是无孔的，且任选地应用的粘附促进层具有小于1μm的厚度。
3.根据权利要求1-2中的任一项的方法，其中将作为不同蛋白的特异性的结合配偶体的不同结合试剂应用到每种不同的待测蛋白的不同阵列上。
4.根据权利要求1-2中的任一项的方法，其中通过将不同的可区分的检测试剂应用到所述阵列上，在共同阵列中检测不同的蛋白，其中不同的待测蛋白的数目对应着应用的不同的可区分的标记的数目。
5.根据权利要求1-2中的任一项的方法，其中通过应用不同的作为不同阵列上的不同蛋白的特异性结合配偶体的结合试剂，检测测量区的阵列上的不同的蛋白和/或不同的可区分的检测试剂，检测测量区的多个阵列中的许多不同的蛋白。
6.根据权利要求1-5中的任一项的方法，其中从无关的细胞群体产生不同的裂解物。
7.根据权利要求1-5中的任一项的方法，其中从已经从共同细胞群体得到的不同的细胞亚群产生不同的裂解物。
8.根据权利要求7的方法，其中在不同的时间点，从已经从共同细胞群体得到的不同的细胞亚群产生不同的裂解物。
9.根据权利要求7-8中的任一项的方法，其中所述不同的裂解物从已经从共同细胞群体得到的不同的细胞亚群产生，然后用不同的试剂处理或刺激，和/或暴露于不同的培养条件。
10.根据权利要求1-9中的任一项的方法，其中从患病的和健康的细胞群体产生不同的裂解物。
11.根据权利要求1-10中的任一项的方法，其中裂解物所来源的健康的或患病的和/或处理的或未处理的和/或刺激的细胞群体，源自原核细胞，例如细菌，和真核细胞，例如人、动物或植物细胞，特别是人或动物组织，例如器官、皮肤、毛发或骨组织，或植物组织，和含有细胞的体液或它们的组分，例如血液、血清或血浆、滑液、泪液、尿、唾液、组织液、淋巴。
12.根据权利要求1-11中的任一项的方法，其中以稀释的或未稀释的形式，在离散的位点沉积到固体支持物或应用在所述固体支持物上的粘附促进层上的裂解物，具有与裂解物所来源的细胞群体相同的待测蛋白的相对分子组成。
13.根据权利要求1-11中的任一项的方法，其中所述裂解物含有添加的已知浓度的化合物(作为标准品)，其类似于作为添加剂的待测分析物，其可以例如用于校正目的。
14.根据权利要求1-13中的任一项的方法，其中沉积在单个测量区中的材料对应着小于1000细胞的蛋白内容物。
15.根据权利要求1-14中的任一项的方法，其中测量区的多个阵列排列成稀释的或未稀释的细胞裂解物的沉积位点的相同的几何形状，即相对于与来自沉积在其中的相同(稀释的或未稀释的)细胞裂解物的沉积量相对应的2个不同阵列中的测量区的行和列的类似位置。
16.根据权利要求1-15中的任一项的方法，其中应用在固体支持物上的粘附促进层具有小于200nm，优选地小于20nm的厚度。
17.根据权利要求16的方法，其中所述粘附促进层包含下述化合物硅烷，官能化的硅烷，环氧化物，官能化的、带电荷的或极性的聚合物和“自组织的被动的或官能化的单层或多层”，硫醇，磷酸烷基酯和膦酸烷基酯，多官能的嵌段共聚物，例如聚(L)赖氨酸/聚乙二醇。
18.根据权利要求16-17中的任一项的方法，其中通过选自下述的方法，将样品侧向选择性地直接沉积在固体支持物或沉积在其上面的粘附促进层上的离散测量区中墨水喷射点样，通过笔、针或毛细管的机械点样，“微接触印刷术”，测量区与通过平行的或交叉的微通道供给的样品的流体接触，应用压力差或电势或电磁势，和光化学的或光刻法的固定化方法。
19.根据权利要求1-18中的任一项的方法，其中为了使结合试剂和/或检测试剂的非特异性的结合最小化，使离散测量区之间的区域“钝化”，即将对分析物(即蛋白)和沉积的样品的其它内容物和结合试剂和如果适当，对检测试剂“化学中性的”(即不结合的)化合物沉积在侧向分隔的测量区之间。
20.根据权利要求1-19中的任一项的方法，其中待检测且包含在沉积在离散测量区中的稀释的或未稀释的裂解物中的蛋白，是下述蛋白化合物胞质、核和膜蛋白，体液中的分泌蛋白(胞质的和膜结合的细胞蛋白，尤其是参与细胞中的信号转导过程的蛋白，例如激酶)，翻译后修饰的蛋白，如磷酸化的、糖基化的、甲基化的和乙酰化的形式的蛋白，特别是在处理下超表达或表达不足的蛋白，其包括抗体，人工超表达的蛋白，人工超表达的修饰的蛋白，如具有另外的结合位点的功能化的蛋白(“标记蛋白”，例如“组氨酸标记蛋白”)，和荧光蛋白(“绿色荧光蛋白”，GFP等)。
21.根据权利要求1-20中的任一项的方法，其中在结合添加的特异性的结合试剂和如果适当，依次或在一个添加步骤中添加的检测试剂的步骤中，在检测试剂结合到结合试剂上后，根据待分析的稀释的或未稀释的沉积的裂解物中含有的磷酸化的和/或未磷酸化的形式和/或糖基化的和/或未糖基化的形式和/或甲基化的和/或未甲基化的形式和/或乙酰化的和/或未乙酰化的形式的发生，区分待测且包含在沉积在离散测量区中的稀释的或未稀释的裂解物中的蛋白。
22.根据权利要求1-20中的任一项的方法，其中在结合添加的特异性的结合试剂和如果适当，依次或在一个添加步骤中添加的检测试剂的步骤中，在检测试剂结合到结合试剂上后，在待分析的稀释的或未稀释的沉积的裂解物中含有的磷酸化的或未磷酸化的形式和/或糖基化的或未糖基化的形式和/或甲基化的或未甲基化的形式和/或乙酰化的或未乙酰化的形式的发生之间，不区分待检测且包含在沉积在离散测量区中的稀释的或未稀释的裂解物中的蛋白。
23.根据权利要求1-22中的任一项的方法，其中直接地或由粘附促进层介导地与产生的测量区物理接触的基本上平面的固体支持物的材料基本上是光学透明的。
24.根据权利要求16-23中的任一项的方法，其中应用到固体支持物上的粘附层的材料基本上是光学透明的。
25.根据权利要求1-24中的任一项的方法，其中所述基本上光学透明的固体支持物的材料包含选自下述的材料可模塑的、可喷涂的或可轧的塑料，金属，金属氧化物，硅酸盐，例如玻璃、石英或陶瓷。
26.根据权利要求1-25中的任一项的方法，其中来自一个或多个多色或单色光源的探测光指向测量区的一个或多个阵列中的一个或多个测量区，并测量和记录从所述测量区的一个或多个阵列发出的光信号和/或这些光信号的变化。
27.根据权利要求26的方法，其中在表面照明构型中送递探测光。
28.根据权利要求26的方法，其中在透射照明构型中送递探测光。
29.根据权利要求1-28中的任一项的方法，其中离散测量区中的一种或多种蛋白的检测基于一种或多种发光的强度或强度的变化的检测。
30.根据权利要求1-28中的任一项的方法，其中离散测量区中的一种或多种蛋白的检测基于所述测量区上或在离这些测量区小于1μm的距离内的折射率的变化的检测。
31.根据权利要求30的方法，其中所述测量区上或在离这些测量区小于1μm的距离内的折射率的变化的检测基于从在固体支持物上产生的测量区区域中的平面状固体支持物发出的光被从对不同折射率材料的界面平面发出的光干涉的模式的变化的检测，其原因是由于应用的特异性的结合配偶体的结合或解吸或置换，造成的从所述界面发出的光和从测量区区域发出的光之间的相差的变化，且其中以局部地和如果适当，光谱地分辨的方式，测量从不同区域发出的干涉光。
32.根据权利要求1-30中的任一项的方法，其中用薄金属层，优选银或金，且优选地以20nm至200nm的厚度，提供固体支持物，其直接地或由粘附促进层介导地接触测量区，且所述测量区上或在离这些测量区小于1μm的距离内的折射率的变化的检测基于在所述金属层产生表面等离子体共振的条件的变化的检测。
33.根据权利要求1-32中的任一项的方法，其中所述固体支持物包含连续的光波导或分成单个的波导区的光波导。
34.根据权利要求33的方法，其中所述光波导是光学薄膜波导，其具有第一个基本上光学透明的层(a)，后者面向具有比层(a)更低的折射率的第二个基本上光学透明的层(b)上的携带离散测量区的表面。
35.根据权利要求34的方法，其中，为了将探测光输入耦合进光学透明层(a)，使该层与一个或多个选自下述的光学输入耦合元件光学接触棱镜耦合器，具有重迭损耗场的组合光波导的损耗耦合器，具有聚光透镜的平端头耦合器，优选柱面透镜，其排列在波导层的一个面的前面，和光栅耦合器。
36.根据权利要求35的方法，其中使用一个或多个特征在于光学透明层(a)的光栅结构(c)，将探测光输入耦合进光学透明层(a)。
37.根据权利要求34-36中的任一项的方法，其中使用一个或多个特征在于光学透明层(a)的光栅结构(c’)，输出耦合光学透明层(a)中引导的光。
38.根据权利要求34-37中的任一项的方法，其中基于用于将探测光输入耦合进作为薄膜波导形成的固体支持物的层(a)中或输出耦合导入层(a)中的光的共振条件的变化，这些变化由结合试剂和/或其它检测试剂向测量区中含有的蛋白的结合导致，通过在光学薄膜波导的层(a)中形成的光栅结构，检测测量区的蛋白。
39.根据权利要求34-37中的任一项的方法，其中将所述光波导设计成光学薄膜波导，其具有第一个光学透明层(a)，后者在具有比层(a)更低的折射率的第二个光学透明层(b)上，其中在一个或多个特征在于光学透明层(a)的光栅结构的辅助下，将探测光进一步输入耦合进光学透明层(a)，并作为导波送递给位于其上的测量区(d)，且其中使用一个或多个检测器，进一步测定在所述导波的损耗场中产生的能发光的分子的发光，且从这些发光信号的强度，确定测量区中含有的蛋白的相对量。
40.根据权利要求39的方法，其中在与已经特异性地结合到测量区中的待测蛋白上的结合试剂相结合的检测试剂激发后，产生发光，且其中检测试剂包含用作发光标记的发光染料或发光纳米颗粒，其可以被激发，并在300nm至1100nm的波长发射。
41.根据权利要求40的方法，其中不同的可区分的检测试剂的特征在于不同的发射波长和/或不同的发射寿命。
42.根据权利要求1-41中的任一项的方法，其中以1 fs至10分钟的持续时间，脉冲送递探测光，并以时间-分辨的方式，测量测量区的发射光。
43.分析平台，其用于光信号读数和产生一种或多种细胞群体的定性和/或定量蛋白表达谱，其包含-基本上平面的固体支持物，-所述固体支持物上的离散测量区的一个或多个一维或二维阵列，所述阵列通过下述方式产生以稀释的或未稀释的形式，将小量细胞裂解物在离散的位点直接沉积到所述固体支持物或预先应用在所述固体支持物上的粘附促进层上，该细胞裂解物源自一种或多种细胞群体，且含有许多由这些细胞群体表达的蛋白，其中所述基本上平面的固体支持物是无孔的，且任选地应用的粘附促进层具有小于1μm的厚度。
44.分析平台，其用于光信号读数和产生一种或多种细胞群体的定性的和/或定量的有差别的蛋白表达谱，其包含-基本上平面的固体支持物，-所述固体支持物上的离散测量区的一个或多个一维或二维阵列，所述阵列通过下述方式产生以稀释的或未稀释的形式，将小量2种或更多种细胞裂解物在离散的位点直接沉积到所述固体支持物或预先应用在所述固体支持物上的粘附促进层上，该细胞裂解物源自2种或更多种细胞群体，且含有许多由这些细胞群体表达的蛋白，其中所述基本上平面的固体支持物是无孔的，且任选地应用的粘附促进层具有小于1μm的厚度。
45.根据权利要求43-44中的任一项的分析平台，其中已经从无关的细胞群体，产生了不同的沉积的裂解物。
46.根据权利要求43-44中的任一项的分析平台，其中从已经从共同细胞群体得到的不同的细胞亚群产生不同的沉积的裂解物。
47.根据权利要求46的分析平台，其中在不同的时间点，从已经从共同细胞群体得到的不同的细胞亚群产生不同的沉积的裂解物。
48.根据权利要求46-47中的任一项的分析平台，其中所述不同的沉积的裂解物从已经从共同细胞群体得到的不同的细胞亚群产生，然后用不同的试剂处理或刺激，和/或暴露于不同的培养条件。
49.根据权利要求43-48中的任一项的分析平台，其中已从患病的和健康的细胞群体产生不同的沉积的裂解物。
50.根据权利要求43-49中的任一项的分析平台，其中沉积的裂解物所来源的健康的或患病的和/或处理的或未处理的和/或刺激的细胞群体，源自原核细胞，例如细菌，和真核细胞，例如人、动物或植物细胞，特别是人或动物组织，例如器官、皮肤、毛发或骨组织，或植物组织，和含有细胞的体液或它们的组分，例如血液、血清或血浆、滑液、泪液、尿、唾液、组织液、淋巴。
51.根据权利要求43-50中的任一项的分析平台，其中以稀释的或未稀释的形式，在离散的位点沉积到固体支持物或应用在所述固体支持物上的粘附促进层上的裂解物，具有与裂解物所来源的细胞群体相同的待测蛋白的相对分子组成。
52.根据权利要求43-50中的任一项的分析平台，其中对沉积的裂解物不进行过滤和/或分级分离和/或稀释以外的其它样品处理步骤。
53.根据权利要求43-52中的任一项的分析平台，其中沉积在单个测量区中的材料对应着小于1000细胞的蛋白内容物。
54.根据权利要求43-53中的任一项的分析平台，其中测量区的多个阵列排列成稀释的或未稀释的细胞裂解物的沉积位点的相同的几何形状，即相对于与来自沉积在其中的相同(稀释的或未稀释的)细胞裂解物的沉积量相对应的2个不同阵列中的测量区的行和列的类似位置。
55.根据权利要求43-54中的任一项的分析平台，其中应用在固体支持物上的粘附促进层具有小于200nm，优选地小于20nm的厚度。
56.根据权利要求55的分析平台，其中所述粘附促进层包含下述化合物硅烷，官能化的硅烷，环氧化物，官能化的、带电荷的或极性的聚合物和“自组织的被动的或官能化的单层或多层”，硫醇，磷酸烷基酯和膦酸烷基酯，多官能的嵌段共聚物，例如聚(L)赖氨酸/聚乙二醇。
57.根据权利要求43-56中的任一项的分析平台，其中为了使示踪化合物的非特异性的结合最小化，使离散测量区之间的区域“钝化”，即将对结合试剂和如果适当，对检测试剂“化学中性的”(即不结合的)化合物沉积在侧向分隔的测量区之间。
58.根据权利要求43-57中的任一项的分析平台，其中待检测且包含在沉积在离散测量区中的稀释的或未稀释的裂解物中的蛋白，是下述蛋白化合物胞质、核和膜蛋白，体液中的分泌蛋白(胞质的和膜结合的细胞蛋白，尤其是参与细胞中的信号转导过程的蛋白，例如激酶)，翻译后修饰的蛋白，如磷酸化的、糖基化的、甲基化的和乙酰化的形式的蛋白，特别是在处理下超表达或表达不足的蛋白，其包括抗体，人工超表达的蛋白，人工超表达的修饰的蛋白，如具有另外的结合位点的功能化的蛋白(“标记蛋白”，例如“组氨酸标记蛋白”)，和荧光蛋白(“绿色荧光蛋白”，GFP等)。
59.根据权利要求43-58中的任一项的分析平台，其中直接地或由粘附促进层介导地与产生的测量区物理接触的基本上平面的固体支持物的材料基本上是光学透明的。
60.根据权利要求43-59中的任一项的分析平台，其中应用到固体支持物上的粘附层的材料基本上是光学透明的。
61.根据权利要求43-60中的任一项的分析平台，其中基本上光学透明的固体支持物的材料包含选自下述的材料可模塑的、可喷涂的或可轧的塑料，金属，金属氧化物，硅酸盐，例如玻璃、石英或陶瓷。
62.根据权利要求43-61中的任一项的分析平台，其中用薄金属层，优选银或金，且优选地以20nm至200nm的厚度，提供固体支持物，其直接地或由粘附促进层介导地接触测量区，所述平台可操作用于在所述金属层产生表面等离子体共振。
63.根据权利要求43-62中的任一项的分析平台，其中所述固体支持物包含连续的光波导或分成单个的波导区的光波导。
64.根据权利要求63的分析平台，其中所述光波导是光学薄膜波导，其具有第一个基本上光学透明的层(a)，后者面向具有比层(a)更低的折射率的第二个基本上光学透明的层(b)上的携带离散测量区的表面。
65.根据权利要求64的分析平台，其中，为了将探测光输入耦合进光学透明层(a)，使该层与一个或多个选自下述的光学输入耦合元件光学接触棱镜耦合器，具有重迭损耗场的组合光波导的损耗耦合器，具有聚光透镜的平端头耦合器，优选柱面透镜，其排列在波导层的一个面的前面，和光栅耦合器。
66.根据权利要求65的分析平台，其中一个或多个光栅结构(c)特征在于光学透明层(a)，以允许将探测光输入耦合进光学透明层(a)。
67.根据权利要求64-66中的任一项的分析平台，其中一个或多个光栅结构(c’)特征在于光学透明层(a)，其允许输出耦合光学透明层(a)中引导的光。
68.根据权利要求64-67中的任一项的分析平台，其中将所述光波导设计成光学薄膜波导，其具有第一个光学透明层(a)，后者在具有比层(a)更低的折射率的第二个光学透明层(b)上，且其中在一个或多个特征在于光学透明层(a)的光栅结构的辅助下，该分析平台可操作用于将探测光输入耦合进光学透明层(a)，从而将所述探测光作为导波送递给测量区(d)，并激发能在所述导波的损耗场中发光的分子的发光。
69.根据权利要求1-42中的任一项的方法和/或根据权利要求43-68中的任一项的分析平台在下述领域中的用途定量的和/或定性的分析，用于在药物研究、组合化学、临床和临床前开发的筛选方法中测定蛋白和它们的修饰形式，用于亲和筛选和在研究中的实时结合研究和测定动力学参数，尤其是用于测定蛋白质组的蛋白质组差异，用于测量蛋白-DNA相互作用，用于测定蛋白(生物)合成的控制机理，用于筛选生物和化学标记化合物，用于药物产品开发中的患者分级和用于治疗性药物选择。
全文摘要
本发明涉及分析平台和用其产生细胞群体的定性和/或定量蛋白表达谱(特别是有差别的蛋白表达谱)的方法，其包含产生一种或多种细胞群体的裂解物，该裂解物包含许多由各细胞群体表达的蛋白，提供基本上平面的固体支持物，以稀释的或未稀释的形式，将小量细胞裂解物在离散的位点直接沉积到所述固体支持物或应用在所述固体支持物上的粘附促进层上，从而在所述固体支持物上建立离散测量区的一个或多个一维或二维阵列，应用许多结合试剂，作为包含在离散测量区的细胞裂解物中且待测的蛋白的特异性的结合配偶体，且如果适当，向所述测量区的一个或多个阵列上应用一种或多种检测试剂，在检测试剂结合到结合试剂之后，依次地或在一个添加步骤中将所述结合试剂和检测试剂应用到离散测量区的一个或多个阵列，和以局部分辨的方式，测量和记录从所述离散测量区的一个或多个阵列发出的光信号，其中所述基本上平面的固体支持物是无孔的，且任选地应用的粘附促进层具有小于1μm的厚度。
文档编号G01N33/68GK1954213SQ200480042247
公开日2007年4月25日 申请日期2004年3月3日 优先权日2004年3月3日
发明者M·帕夫拉克, E·施克, P·奥罗什兰 申请人:拜尔技术服务有限责任公司