专利名称：在结合了转录/转译的无细胞体系中制备性表达基因的方法
技术领域：
本发明涉及分子生物学和生物技术，即涉及在结合了转录/转译的无细胞体系中制备性表达基因的方法。
众所周知，基因表达产物是肽或蛋白质。这些物质作为生物过程的生物调节剂，医疗药剂及诊断系统，广泛应用于医学上。例如，已知有免疫系统的肽活性剂，盐交换的肽刺激剂，蛋白质，血中糖量的调节剂及其它。已知多肽在农业中作为生物刺激剂例如生长激素的应用。
已知通过基因工程技术来制备性表达细胞的遗传材料的方法，该基因工程是基于把遗传材料通过宿主细胞器表达的异种DNA引入到活细胞内实现的。这种基因工程广泛用于蛋白质的工业生产。但是它在应用方面有一定的限制性。这是由于基因表达产物分离的复杂性，宿主细胞的某些目标产物的致死以及异种基因表达产物受到细胞蛋白酶的降解或聚集所引起的。后一种情况会使长度有15-70氨基酸残基的多肽的分离或使有人工改变的氨基酸顺序的蛋白质生产特别困难。
由上面的情况得到的结论是基因工程的方法不确保制备性表达任何基因的可能性。
还有一种基因表达方法，它是基于利用结合了转录/转译的无细胞体系。
这方法是基于使用DNA分子的细胞提取物。在这种体系中产生mRNA与DNA分子的扩增及其以后的转译。
结合了转录/转译的无细胞体系没有由细胞造成的限制，实际上保证了按适当方式所设计的呈DNA形式的任何基因的表达。
但是，这些方法的效率是非常低的。这种体系发挥功能的时间为20-60分钟，合成的多肽数量相对1毫升培育混合物不超过3-10微微摩尔。就这样，例如，已知在结合了转录/转译的无细胞体系中基因表达方法(基因，Vol.6，1979)。
根据这个方法，100微升结合了转录/转译的无细胞体系含25微升提取物S30，5微克DNA分子，19微克总tRNA，1.7毫摩尔ATP，GTP，CTP和UTP各1毫摩尔，88微摩尔cAMP，0.5微克叶酸，37毫摩尔磷酸烯醇丙酮酸，2.6%聚乙二醇6000，88微摩尔〔35S〕蛋氨酸，其它19种氨基酸各480微摩尔在缓冲液中77毫摩尔Tris-醋酸盐(pH8.2)，13毫摩尔醋酸镁，13毫摩尔醋酸钙，100毫摩尔醋酸钾，50毫摩尔醋酸铵，2.4毫摩尔DTT。
在温度37℃下进行基因表达。在合成过程中，在体系中积累起基因表达产物，包括呈多肽形式的目标产物，呈AMP，ADP，GDP，CDP，UDP，焦磷酸盐，无机磷酸盐形式的分解产物及其它产物，这些都是基因表达体系的抑制剂。由于有抑制作用，过30-60分钟系统停止自己的功能。在100微升这样的系统中，合成的多肽数量不超过0.5-1微微摩尔。
结合了转录/转译的无细胞体系发挥功能持续时间短的主要原因在于1.体系含有有限量的基质，提高它的含量会抑制体系。
2.在体系进行工作中生成的呈AMP，ADP，GDP，CDP，UDP，焦磷酸盐和磷酸盐形式的分解产物是体系抑制剂。
3.目标产物也会抑制结合了转录/转译的无细胞体系。
本发明的任务是要在结合了转录/转译的无细胞体系中制备性表达呈DNA分子形式的基因的方法，用这种方法通过延长体系发挥功能的持续时间可得到制备级数量的多肽。
这个任务是通过下面的途径来解决，即推荐出这样一个在结合了转录/转译的无细胞体系中制备性表达基因的方法，在体系中作为基质有氨基酸，ATP，GTP，CTP和UTP，并利用呈DNA分子形式的基因，生成基因表达产物，包括多肽，AMP，ADP，GDP，CDP，UDP，焦磷酸盐，无机磷酸盐，在该方法中，按照本发明，在结合了转录/转译的无细胞体系发挥功能过程中，随着基质的消耗，产物的生成，从体系中不断取出基因表达产物，包括多肽，AMP，ADP，GDP，CDP，UDP，焦磷酸盐和无机磷酸盐，同时不断往体系中加入呈氨基酸，ATP，GTP，CTP，UTP形式的基质，以保持它们原来的浓度。
作为本推荐方法中的基因表达体系，即可利用结合了转录/转译的原核无细胞体系，也可利用真核无细胞体系。在所推荐的方法中，使用的反应混合物组分的比例关系，合成的离子和温度条件，都是所选系统最佳的条件。这些条件的范围很宽，是由制备无细胞体系的有机体性质决定的。
所推荐的制备性表达基因方法，没有基因工程方法的限制，可用于任何肽和蛋白质的基因表达。这个性质对得到生物活性的肽和带有人工改变氨基酸顺序的蛋白质特别重要。
所推荐的方法确保结合了转录/转译的无细胞体系中的基因表达在50小时或更长的时间里有固定不变的高速度。在体系50-100小时的工作时间里，由1毫升反应混合物得到200-400微克目标产物，这有可能使基因表达产物的生产工业化。
下面，通过完成的实例及所附的图来说明本发明，图中示出了合成的多肽数量与合成时间的关系曲线。
在结合了转录/转译的无细胞体系中制备性表达基因方法的实现如下从原核细胞或真核细胞制备含所有转录和转译所需组分，但没有内源mRNA和DNA的提取物。往提取物中加入转录和转译的低分子量组分(氨基酸，ATP，GTP，UTP，CTP)，以及呈DNA分子形式的基因。
把反应混合物加入到贮藏器内，在那里进行结合了的转录/转译过程。为了防止反应过程的停止，通过半透膜不断从贮藏器中取出转录产物(无机磷酸盐，ADP，GDP，CDP，UDP)和转译产物(合成的多肽，AMP，GDP，无机磷酸盐和焦磷酸盐)。同时，往贮藏器内加入氨基酸，ATP，GTP，CTP，UTP，以恢复它们的初始浓度。使用装有吸附剂的柱子收集合成的多肽，同时在专用的贮藏器内收集转录和转译产物，供以后再生用。
为了更好理解本发明，在下面列出具体的实施例。
在无细胞体系中制备性表达质粒PUD18的基因制备结合了转录/转译的标准无细胞体系，质粒PUD18含有β-内酰胺酶和二氢叶酸还原酶基因。
溶液(A)含有55毫摩尔Tris-醋酸盐(pH8.2)，11毫摩尔醋酸镁，9.5毫摩尔氯化钙，76毫摩尔醋酸钾，1.5毫摩尔DTT，1.6%聚乙二醇6000，5毫摩尔磷酸烯醇丙酮酸，1.2毫摩尔ATP，GTP，CTP和UTP各0.8毫摩尔，5微克/毫升叶酸，100微摩尔〔3H〕白氨酸，其比放射活性为230毫居里/毫摩尔，其它氨基酸各100微摩尔。1毫升由缓冲液A制得的反应混合物，含430微升提取物S30，150微克质粒PUD18，200微克总tRNA。
在温度37℃下，在40分钟培育时间内，结合了转录/转译的标准体系，由每1毫升培育混合液合成出β-内酰胺酶和二氢叶酸还原酶各6微微摩尔。
在平行实验中，在一个连续作用的装置内，以3毫升/小时或2毫升/小时的速度往1.0毫升反应混合物内加入溶液(A)，同时以同样的速度，通过超滤膜XM-100(荷兰AMnKoH公司生产)从反应混合物中取出反应产物。在图中示出了这种体系内β-内酰胺酶和二氢叶酸还原酶基因表达的动力学，图中横座标为合成的时间t(小时)，纵坐标为生成的产物的数量m(微克)。在动力学曲线1段，溶液(A)以3毫升/小时的速度加入，在动力学曲线2段，溶液(A)以2毫升/小时的速度加入。由所给的图可知，多肽的合成速度取决于溶液(A)的加入速度，不取决于系统的工作时间。
这样的体系在50小时的工作时间内，每1毫升反应混合物合成出β-内酰胺酶和二氢叶酸还原酶各4.1微微摩尔，这相应于212微克β-内酰胺酶和二氢叶酸还原酶的蛋白质。
这样，推荐的本方法保证了在无细胞体系中制备性表达基因，产物的产率比结合了转录/转译的标准无细胞体系所合成的产物高500倍以上。
权利要求
1.一种在结合了转录/转译的无细胞体系中制备性表达基因的方法，体系中作为基质有氨基酸，ATP，GTP，CTP和UTP，利用呈DNA分子形式的基因，在体系中生成的基因表达产物，包括多肽，AMP，ADP，GDP，CDP，UDP，焦磷酸盐，无机磷酸盐，该方法的特点是，在转录/转译的无细胞体系工作过程中，随着基质的消耗和产物的生成，从体系中取出基因表达产物，包括多肽，AMP，ADP，GDP，CDP，UDP，焦磷酸盐和无机磷酸盐，同时往体系中加入呈氨基酸，ATP，GTP，CTP，UTP形式的基质，其目的是为了保持它们的原始浓度。
全文摘要
制备性基因表达是在结合了转录/转译的无细胞体系中实现的，体系中作为基质含有氨基酸，ATP，GTP，CTP和UTP，使用呈DNA分子形式的基因，其结果在体系中生成基因表达产物，包括多肽，AMP，ADP，GDP，CDP，UDP，焦磷酸盐和无机磷酸盐。在转录/转译的无细胞体系的工作过程中，随着基质的消耗和产物的生成，从体系中取出基因表达产物，包括多肽，AMP，ADP，GDP，CDP，UDP，焦磷酸盐和无机磷酸盐。同时往体系中加入呈氨基酸，ATP，CTP，UTP形式的基质，以保持它们的原始浓度。
文档编号C12P19/34GK1043743SQ8910262
公开日1990年7月11日 申请日期1989年4月26日 优先权日1988年12月22日
发明者弗拉基米尔·伊万诺维奇·巴拉诺夫, 伊格尔·米丽维奇·莫罗佐夫, 亚利山大·赛格维奇斯比林 申请人:苏联科学院蛋白质研究所