通过大规模平行rna测序分析母亲血浆转录组的制作方法
【专利说明】通过大规模平行RNA测序分析母亲血浆转录组
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2013年2月28日提交的题目为"通过大规模平行RNA测序分析母亲 血浆转录组"的美国临时专利申请号61/770, 985的优先权，为了所有的目的将其通过引用 并入本文。
【背景技术】
[0003] 已经报道了母亲血浆中妊娠特异性的细胞外RNA分子i。它们已经提供了通过简 单地使用来自母亲的外周血液样品用于胎儿评估和妊娠监测的无创测试工具。迄今为止， 已经使用母亲血浆RNA开发了许多有希望的产前诊断应用2 8。研究人员已经积极搜索另外 的RNA标记物，以便在将应用延伸在不同的胎儿病症和妊娠病理学背景下。
[0004] 理论上，最直接的RNA标记物鉴定方法是直接描述母亲血浆中的细胞外RNA分子。 但是，该方法是不容易的，因为常规的高通量筛选技术，比如微阵列分析和基因表达的系列 分析（SAGE)，具有有限的能力检测通常低浓度的母亲血浆中部分降解的细胞外RNA9。而是， 大部分报告的RNA标记物筛选策略通过比较胎盘和母亲血细胞的表达概况而间接操作' 仅仅表达在胎盘中比在母亲血细胞中表达更高的转录体进一步在母亲血浆样品中通过高 灵敏度但是低通量技术，比如实时逆转录酶聚合酶链式反应（RT-PCR)研究。迄今，通过该 间接方法鉴定的血浆RNA标记物相对有限。该可能因为基于组织的挖掘策略未充分考虑影 响母亲血浆中胎盘RNA水平的所有的生物因素。另外，由非胎盘组织响应妊娠表达和释放 的转录体可能不被该方法鉴定。所以非常期望允许直接概述母亲血浆转录组的灵敏和高通 量方法。
[0005] 类似地，直接血浆RNA概述可用于有来自两个个体的RNA分子的混合物的其他情 形，比如用于器官移植。移植接受者的循环包含来自供体和接受者的核酸分子。由供体或接 受者提供的RNA分子相关图谱的改变可揭示移植器官或接受者的病理学，比如移植排斥。
[0006] 发明概述
[0007] 提供方法、系统和装置用于诊断妊娠相关的病症，确定等位基因比，确定母亲或胎 儿对循环转录体的贡献，和/或使用来自妊娠女性对象的样品鉴定母亲或胎儿标记物。在 一些实施方式中，样品是包含源自母亲和胎儿的RNA分子的混合物的血液血浆。
[0008] 分析（例如，测序）RNA分子，以获得多个读数，和鉴定参考序列中这些读数的位置 (例如，通过序列比对）。信息型基因座鉴定为对于母亲或胎儿中的第一等位基因是纯合 子，和对于母亲和胎儿中另一个的第一等位基因和第二等位基因是杂合子。然后过滤信息 型基因座并且进一步分析位于（例如，对齐）过滤信息型基因座的读数。在一些实施方式 中，计算对应第一等位基因和第二等位基因的读数的比例并且与截取值比较，以诊断妊娠 相关的病症。在一些实施方式中，使用位于信息型母亲基因座的读数测定胎儿起源的样品 中的一部分RNA。在一些实施方式中，计算个体过滤信息型基因座的对应第一等位基因和第 二等位基因的读数的比例，并且比例与截取值比较，以指定基因座为母亲或胎儿标记物。
[0009] 本发明不限于产前诊断并且可施用至包含源自两个个体的RNA分子混合物的任 何生物样品。例如，可使用获得自器官移植接受者的血液血浆样品。移植器官中表达的转录 体反映供体的基因型并且在接收者的血液中以可检测的水平出现。通过读取这些转录体， 可鉴定在供体和接受者二者的基因中表达的信息型基因座，并且可测量来自每个个体的等 位基因的相对表达水平。仅仅由于供体或接受者等位基因的异常表达水平可用于诊断移植 相关的病症。
[0010] 可用于本发明的生物样品包括血液、血浆、血清、尿、唾液和组织样品。例如，已经 在妊娠女性的尿中检测到胎儿核酸。肾移植接受者的尿已经显示包含无细胞核酸和来自移 植器官的细胞。在许多情况下已经观察到微嵌合。微嵌合指身体中存在来自另一人的细胞 或核酸来源，包括具体个体的器官和组织。在甲状腺、肝、脾、皮肤、骨髓和其他组织的活组 织检查中已经观察到微嵌合。微嵌合可由于之前的妊娠或输血而出现。
[0011] 也提供了基因用于诊断妊娠女性对象中妊娠相关的病症的用途。基因的表达水平 与从每个孕育健康胎儿的一个或多个其他女性对象确定的对照值比较。本文解决的妊娠相 关的病症包括先兆子痫、宫内生长限制、侵入性胎盘形成和早产。其他妊娠相关的病症可以 是使胎儿处在胎儿死亡风险的病况，比如新生儿的溶血病、胎盘功能不足、胎儿水肿、胎儿 畸形。仍其他妊娠相关的疾病可以是妊娠期间导致并发症的病况，比如母亲的ffiLLP综合 症、系统性红斑狼疮和其他免疫疾病。
【附图说明】
[0012] 图1显示血浆中的等位基因比B/A与各自基因的相对表达水平之间的。
[0013] 图2显示总基因表达水平与基因的相对表达水平之间的关系。
[0014] 图3是诊断妊娠相关病症的方法的流程图。
[0015] 图4和5显示RNA-seq读取比对结果的总结。
[0016] 图6显示来自测序两个个体的血液血浆RNA的数据。图6A显示从M9356P的 RNA-seq文库（用Ribo-ZeroGold预处理）和M9415P(不用Ribo-ZeroGold预处理）测 序读数的GC%分布。图6B显示M9356P和M9415P之间基因表达概况的相关性。
[0017] 图7显示母亲血浆中不同RNA转录体的RNA-SNP等位基因比和总血浆浓度，针对 相对组织表达水平（胎盘/血细胞）绘图。
[0018] 图8显示包含信息型SNP的不同基因的RNA-SNP等位基因比和总血浆水平，针对 相对组织表达水平（血细胞/胎盘）绘图。
[0019] 图9显示母亲血浆中胎儿特异性SNP等位基因的RNA-SNP等位基因比和包含这些 等位基因的RNA转录体的表达水平。
[0020] 图10显示母亲血浆中母亲特异性SNP等位基因的RNA-SNP等位基因比和包含这 些等位基因的RNA转录体的表达水平。
[0021] 图11显示先兆子痫和对照对象中母亲特异性SNP等位基因的数据。图11A显示 病例5641 (第三个三个月晚发型先兆子痫）和病例7171 (对照）对包括母亲特异性SNP等 位基因的信息型SNP的RNA-SNP等位基因比。图11B显示病例5641相对于7171 (对照） 的那些就包括母亲特异性SNP等位基因的信息型SNP的RNA-SNP等位基因比和血浆水平的 倍数差异。
[0022] 图12显示先兆子痫和对照对象中母亲特异性SNP等位基因的数据。图12A显示 病例5641 (第三个三个月晚发型先兆子痫）和病例9356 (对照）的包括母亲特异性SNP等 位基因的信息型SNP的RNA-SNP等位基因比。图12B显示RNA-SNP等位基因比和病例5641 血浆水平相对于9356的那些，包括母亲特异性SNP等位基因的信息型SNP的倍数差异。
[0023] 图13显示图11表格形式的数据。
[0024] 图14显示图12表格形式的数据。
[0025] 图15是在来自女性对象孕育胎儿的样品中确定胎儿起源的一部分RNA的方法的 流程图。
[0026] 图16显示母亲血浆转录组的信息型SNP分析的结果。
[0027] 图17显示晚期妊娠的母亲血浆样品中没有过滤等位基因特异性表达的相对胎儿 和母亲贡献。
[0028] 图18显示母亲血浆转录组中的胎儿和母亲贡献。图18A显示早期妊娠和晚期妊 娠的母亲血浆中源自胎儿和母亲的转录体的比例。图18B显示分娩之前和之后等位基因计 数和胎儿等位基因比。
[0029] 图19比较在一个RNA-SNP对于先兆子痫病例和对照妊娠病例的部分胎儿和母亲 贡献。
[0030] 图20是将基因组基因座指定为母亲或胎儿标记物的方法的流程图。
[0031] 图21是妊娠相关的基因的列表。
[0032] 图22显示与分娩前相比，分娩后对象中更低表达水平的妊娠相关的基因。
[0033] 图23显示使用131个妊娠相关的基因，血浆样品的分级聚类。
[0034] 图24显示胎盘、母亲血细胞和母亲血浆中131个妊娠相关的基因的表达水平。图 24A是两个晚期妊娠病例的胎盘和母亲血细胞以及分娩前和分娩后母亲血浆的基因表达的 热图（log2(转录体水平））。131个妊娠相关的基因优选在胎盘中表达。图24B显示胎盘 和血浆中131个基因的表达水平正相关（P〈0. 05,Spearman相关性）。
[0035] 图25比较胎儿和母亲对于用基于血浆和基于组织的方法鉴定的基因在血浆中 RNA的贡献。
[0036] 图26列举了母亲血浆中98个先兆子痫相关的RNA，如通过RNA-Seq鉴定。显示了 从无并发症妊娠女性和已经发展先兆子痫的女人收集的血浆中的表达水平。
[0037] 图27显示对于病例9415,PAPPARNA中单核苷酸多态性（SNP)位点的RNA-测序读 数计数。等位基因-A是共享等位基因和等位基因-G是胎儿特异性等位基因。
[0038] 图28显示对于病例9415，H19RNA中单核苷酸多态性（SNP)位点的RNA-测序读数 计数。
[0039] 图29显示通过甲基化敏感的限制酶酶切检测母亲H19甲基化状态。
[0040] 图30显示用于根据本发明的实施方式的系统和方法的示例性计算机系统3000的 方块图。
[0041] 发明详述
[0042] I?介绍
[0043] 十年前已经报道了母亲血浆中存在无细胞胎儿RNA11。该发现之后，开始进行许多 研究，以检测母亲血浆中胎儿和胎盘起源的循环RNA1'％12。有趣地，发现血浆中胎盘特异性 转录体的表达水平与胎盘组织中的那些正相关 ' 强调了血浆RNA分析作为无创工具的临 床用途，以监测胎盘或胎儿健康和发育。的确，母亲循环RNA的检查已经发现临床用于妊娠 相关的或胎盘相关的病症，比如先兆子痫2'1315,宫内生长迟缓4和早产 8,以及用于无创测试 胎儿染色体非整倍性5'7'16。这样的开发突出了RNA生物标记用于分子评估产前病症的潜在 用途。
[0044] 尽管血浆RNA分析在产前测试中有希望的展望，迄今母亲血浆中充分验证的妊娠 相关的或胎盘相关的转录体的数量仍有限。在这点上，使用逆转录酶（RT)-PCR进行血浆中 1^八生物标记的检查1'4'8' 1°'12'13，其是每次分析通常靶向相对少量1^4种类的灵敏方法。重 要地，这些研究主要关注在妊娠相关的基因主要源自胎盘的前提下，与母亲血细胞相比，胎 盘中具有相对高表达水平的基因。这样的方法已经鉴定了胎盘中高表达的妊娠相关的RNA 靶，但是可能错过其他重要的靶。此外，考虑血浆RNA的低浓度和差的完整性9'15,常规的高 通量方法比如基因表达的系列分析和微阵列分析可能对于直接检查血浆转录组不够刚健。
[0045] 通过RNA分析的大规模平行测序（MPS)，即RNA-测序（RNA-seq)，可潜在解决血浆 RNA分析的前述技术局限17'18。考虑改善的灵敏度和宽的动态范围，RNA-seq已经用于检查 许多人组织，包括胎盘中的基因表达19。通过其在直接概述健康的个体 2°和妊娠女性21'22中 血浆miRNA的可行性进一步表明了MPS的优势。然而，血浆转录组的完整图谱仍不清楚，其 可能由于血浆中与短miRNA相比长RNA种类更低的稳定性23。
[0046] 在该研究中，我们已经显示可在母亲血浆中检测源自胎儿和母亲的转录体并且可 使用RNA-seq，通过检查胎儿特异性和母亲特异性单核苷酸多态性（SNP)评估它们的相对 贡献。另外，可监测母亲血浆中胎盘的等位基因特异性表达模式。我们也已经表明可通过 直接检查分娩之前和之后母亲血浆鉴定妊娠相关的转录体。
[0047] II.使用SNP等位基因比诊断妊娠相关的病症的方法
[0048] 基因表达概况的分析用于检测个体的疾病状态。本发明的实施方式包括通过分析 来自两个不同个体的RNA分子的混合物分析个体表达概况的方法。方法使用一个个体特异 的等位基因和两个个体之间共享的等位基因的相对丰度。基于共享的和个体特异性等位基 因的相对丰度，可测定两个个体的基因表达概况。本发明一种可能的应用是通过分析包含 来自胎儿和妊娠女性二者的RNA的母亲血浆样品中的RNA，分析胎儿基因表达概况。另一应 用是从移植接受者收集的包含来自供体和接受者二者的RNA的血浆样品中源自供体的RNA 的基因表达概况的分析。
[0049] 在包含来自两个个体的RNA的混合物中，每个个体的表达概况不能基于混合物中 不同RNA转录体的总量分析而确定，因为难以确定每个个体对总RNA的相对贡献。不同RNA 转录体的相对丰度可用于监测个体的健康或检测疾病状态。
[0050] 在该方法中，可首先通过个体的直接基因分型或通过家族分析来确定两个个体的 基因型。例如，如果父母具有基因型AA和TT，那么胎儿的基因型应是AT。
[0051] 下述假设的例子图解了该方法的原理。对于每个感兴趣的的基因，编码区域中存 在SNP，从而在不同基因的RNA转录体中可观察多态性。假设胎儿和妊娠女性的基因型分 别是AB和AA。因此，B等位基因对于胎儿是特异性的和A等位基因是胎儿和母亲之间共享 的。胎盘和母亲血细胞中不同基因的相对表达水平如表1中所显示。
[0052] 在该例子中，我们假设胎盘和母亲血细胞为母亲血浆贡献相对相等比例的每个它 们RNA转录体的2%。换句话说，如果基因的胎盘表达水平是10000,其将为母亲血浆贡献 200个该基因的RNA转录体。如图1中所显示，等位基因比B/A显示与胎盘和母亲血细胞中 各自基因的相对表达水平的良好正关系。相反，总基因表达水平受母亲血细胞的表达波动 的影响，并且因此与胎盘的表达较不相关（图2)。
[0053] 表 1
[0054]
[0055] 使用等位基因比分析的另一优势是胎盘中具体基因的表达水平与母亲血细胞的 表达水平归一化。因为遍及不同的基因和不同的样品表达水平可能非常不同，该归一化使 得更稳健比较不同的基因并且避免必须与参考基因，例如，管家基因比较。换句话说，在常 规的基因表达分析中，参考管家基因测量样品中基因的表达水平或作为样品的总RNA的 量。常规上，为了鉴定异常基因表达，人们接着比较测试样品与对照样品的那些相对值。
[0056] 这里我们提出了新的方法，由此我们使用归一化至母亲相同基因的贡献的胎儿贡 献的相对量作为一种方式，以确定基因表达概况。在病理学状态下，例如先兆子痫、早产、母 亲疾病比如系统性红斑狼疮，由此胎盘或母亲器官中基因的表达的被改变，该基因的胎儿 与母亲比例当与没有这样的病理学病况的妊娠比较时而改变。该方法可使用母亲血浆中胎 儿特异性SNP等位基因相对于RNA转录体中共享的等位基因而实施。
[0057] 方法可也使用母亲血衆中母亲特异性SNP等位基因相对于RNA转录体中的共享等 位基因而实施。当与对于非病理学状态预期的比较，对于一个或多个RNA基因转录体的一 个或多个这样的等位基因比改变时，可鉴定病理学病况。遍及基因基因座或多个基因基因 座的这样的等位基因比的模式可用于鉴定病理学状态。非病理学状态可由正常妊娠的等位 基因比表示，在当妊娠不受病理学状态影响测试之前或之后获得的样品的等位基因比表示 或来自先前获得自正常妊娠的现有数据，即源自先前参考范围的等位基因比。
[0058] 可使用本方