基于丝瓜转录组序列开发的est-ssr核心引物组及应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一套基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组，包括50对引物，其核苷酸序列如序列表SEQIDNO.1～100所示。本发明的50对EST-SSR核心引物具有多态性丰富、扩增稳定、重复性好、便于统计等优点，同时由于这些引物均来自丝瓜表达基因，能够反映基因组中功能序列的变异，从而能够更好的区分丝瓜遗传种质的多样性。本核心引物组可用于丝瓜品种鉴定、品种遗传系谱分析和种质资源遗传多样性分析等领域，有利于保护育种者、生产者和消费者的合法权益，促进丝瓜遗传育种和丝瓜生产的健康发展。
【专利说明】基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组及应用
【技术领域】
[0001]本发明涉及EST-SSR核心引物组，具体涉及一套基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组及其应用。
【背景技术】
[0002]丝瓜为葫芦科(Cucurbitaceae)丝瓜属(Luffa spp.) —年生攀援性草本植物,其作为一种重要的蔬菜作物在我国的南北各地均有广泛的种植面积。丝瓜除作为蔬菜外，还是一种重要的药用植物。现代药理学证明，丝瓜中含有生物碱类、黄酮类、固醇类、糖苷类等多种有效成分，具有抗真菌、抗细菌、消炎等作用。最近的研究结果证明，丝瓜种子中含有核糖体失活蛋白，能够抑制艾滋病病毒的生长，因此是潜在治疗艾滋病的药物。
[0003]近年来，随着人们对营养保健的日益重视，丝瓜作为一种药膳兼用及高温季节市场供应蔬菜，深受人们喜爱，需求量不断增大，栽培面积呈扩大趋势。我国研究者从20世纪60年代起开始丝瓜遗传育种、杂种优势及遗传特性等方面的研究，取得了一定进展，培育了一批优良新品种。由于丝瓜的基础理论研究薄弱，目前在丝瓜育种及品种保护方面存在两个突出问题:一、如何对丝瓜种质资源的遗传多样性进行准确鉴定，从而高效的指导育种家进行亲本的选配；二、如何准确、快速进行丝瓜品种的鉴定，从而更好的推动丝瓜品种审定、品种保护、真假品种辨别、品种的产权纠纷的解决等方面的发展。
[0004]基于个体间DNA序列多态性的分子标记技术具有测试周期短、潜在标记数量多、不受环境影响和季节限制、没有组织特异性、准确性高、利于高通量测试分析等优势，已被广泛用于种质资源遗传多样性分析、新品种鉴定、种子纯度检测中。在丝瓜中，已有一些研究者利用分子标记对丝瓜种质资源进行了遗传多样性分析，但是一般都是采用的RAPD、ISSR、SRAP等随机引物标记。这些标记均是基于无基因组(或转录组)序列信息开发的标记技术，尽管有一定的实用性，但是标记的随机性强、稳定性差，从而影响了实验结果的准确性。
[0005]EST-SSR是基于EST序列或cDNA数据开发的一种SSR分子标记。由于其来自表达基因，因而除具备传统基因组来源SSR标记的所有优势外，还具有信息含量高(反映表达基因信息)、开发费用低、通用性好等优点，从而强化了该标记在遗传研究中的应用。目前，该标记在遗传多样性分析、品种鉴定、遗传图谱构建、基因(QTL)定位等研究领域得到了较好的应用。目前，在玉米、小麦、谷子等作物中为提高SSR技术的检测效率，开展了核心引物组的相关研究，取得了较好的效果。核心引物组指均匀覆盖全基因组、多态性高、稳定性强、重复性好的一套引物，利用其进行遗传多样性分析、品种鉴定具有快速、简便、准确性高的优点。目前，丝瓜尚无基于基因组或者转录组序列开发的特异性分子标记，因此，开发丝瓜EST-SSR核心引物组，已成为丝瓜育种、生产和品种保护领域中迫切需要解决的问题。
【发明内容】
[0006] 本发明的一个目的在于提供一套基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组。
[0007]本发明的另一个目的在于提供上述的基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组在丝瓜种质资源遗传多样性分析、丝瓜品种遗传系谱或丝瓜品种鉴定中的应用。
[0008]本发明所采取的技术方案是:
基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组，其包括50对引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1~100所示。
[0009]利用上述基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组进行丝瓜种质资源遗传多样性分析、丝瓜品种遗传系谱或丝瓜品种鉴定的方法，包括如下步骤:
(1)提取待测丝瓜样品基因组DNA；
(2)以步骤(1)提取的待测样品DNA为模板，利用序列表SEQID N0.1~100所示引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物； (3)将步骤(2)的PCR扩增产物采用采用6%变性聚丙烯酞胺凝胶电泳检测，银染显色，统计检测结果；
(4)利用步骤(3)的统计结果进行丝瓜种质资源遗传多样性分析、丝瓜品种遗传系谱或丝瓜品种鉴定。
[0010]所述PCR 扩增反应体系(20 μ L)包括:2 μ LlOXbuffer ；0.5μ L Taq 酶(2U.μ L-1) ;0.4μ L dNTP(10mmol.171);上、下游引物各 0.1 μ L(50pmoL.μ L—1) ;lyL 模板DNA (50ng.μ L-1) ; 15.9 μ L ddffiOoPCR程序为 Touch-down PCR:94°C预变性 3min ；94°C 30S,65°C ( -10C /cycle) lmin,72°C lmin，15 个循环；94°C 30S，5(TC lmin,72°C lmin，25 个循环；72°C终延伸IOmin。
[0011]所述丝瓜种质资源遗传多样性分析或丝瓜品种遗传系谱分析方法为:使用NTSYS-pc2.1Oe软件进行基于UPGMA法的聚类分析；使用POPGENE软件计算各引物的等位基因数(Na)、基因多样性(h)和Shannon值⑴。
[0012]所述丝瓜品种鉴定方法为:统计每个品种在引物中的扩增情况，构建DNA指纹图谱，一一比较各引物位点差异，差异引物数> 2，判定两个品种为不同品种；差异引物数=1，判定两个品种为近似品种；差异引物数=0，判定两个品种为相同品种。
[0013]本发明的有益效果是:本发明的50对EST-SSR核心引物具有多态性丰富、扩增稳定、重复性好、便于统计等优点，同时由于这些引物均来自丝瓜表达基因，能够反映基因组中功能序列的变异，从而能够更好的区分丝瓜遗传种质的多样性。本核心引物组可用于丝瓜品种鉴定、品种遗传系谱分析和种质资源遗传多样性分析等领域，有利于保护育种者、生产者和消费者的合法权益，促进丝瓜遗传育种和丝瓜生产的健康发展。
【专利附图】
【附图说明】
[0014]图1为依据50对丝瓜EST-SSR核心引物组对46份丝瓜材料聚类分析。
【具体实施方式】
[0015]下面结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
实施例
[0016]一、丝瓜EST-SSR核心引物组的开发1、材料
从本单位保存的丝瓜种质资源中筛选出46份核心种质资源材料(表1)用于丝瓜EST-SSR核心引物组的评价和资源遗传多样性的鉴定。46份丝瓜资源材料中包括36份有棱丝瓜，10份普通丝瓜；其中25份材料来自中国，8份材料来自泰国，7份材料来自马来西亚，另有6份材料未知来源。
表1本发明中用于丝瓜资源遗传多样性分析材料信息
【权利要求】
1.基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组，其特征在于:所述引物组包括50对引物，其核苷酸序列如序列表SEQ ID N0.1~100所示。
2.根据权利要求1所述的基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组在丝瓜种质资源遗传多样性分析中的应用。
3.根据权利要求1所述的基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组在丝瓜品种遗传系谱中的应用。
4.根据权利要求1所述的基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组在丝瓜品种鉴定中的应用。
5.利用权利要求1所述基于丝瓜转录组序列开发的EST-SSR核心引物组进行丝瓜种质资源遗传多样性分析、丝瓜品种遗传系谱或丝瓜品种鉴定的方法，包括如下步骤: (1)提取待测丝瓜样品基因组DNA； (2)以步骤(1)提取的待测样品DNA为模板，利用序列表SEQID N0.1~100所示引物进行PCR扩增，得到PCR扩增产物； (3)将步骤(2)的PCR扩增产物采用凝胶电泳检测，统计检测结果； (4)利用步骤(3)的统计结果进行丝瓜种质资源遗传多样性分析、丝瓜品种遗传系谱或丝瓜品种鉴定。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述丝瓜种质资源遗传多样性分析或丝瓜品种遗传系谱分析方法为:使用NTSYS-pc 2.1Oe软件进行基于UPGMA法的聚类分析；使用POPGENE软件计算各引物的等位基因数(Na)、基因多样性(h)和Shannon值(I)。
7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述丝瓜品种鉴定方法为:统计每个品种在引物中的扩增情况，构建DNA指纹图谱，一一比较各引物位点差异，差异引物数>2，判定两个品种为不同品种；差异引物数=1，判定两个品种为近似品种；差异引物数=0，判定两个品种为相冋品种。
8.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤(3)采用6%变性聚丙烯酞胺凝胶电泳检测，银染显色。
9.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，20UL PCR扩增反应体系包括:2 μ LIOXbuffer ；0.5 μ L Taq 酶(2U.μ L-1) ；0.4 μ L dNTP (IOmmol.L-1);上、下游引物各 0.1μ L (50 pmoL.μ L-1) ；1 μ L 模板 DNA (50 ng.μ L-1) ; 15.9 μ L ddH20。
10.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，PCR扩增程序为Touch-downPCR:94°C预变性 3min;94°C 30S,65°C (― 1°C /cycle) lmin,72°C lmin，15 个循环；94°C 30S,50°Clmin，72°C lmin，25 个循环；72°C终延伸 IOmin0
【文档编号】C12Q1/68GK104004833SQ201410196610
【公开日】2014年8月27日 申请日期:2014年5月9日 优先权日:2014年5月9日
【发明者】吴海滨, 罗剑宁, 龚浩, 何晓莉, 罗少波, 郑晓明, 张长远 申请人:广东省农业科学院蔬菜研究所