制备靶rna消除组合物的方法和试剂盒的制作方法

制备靶rna消除组合物的方法和试剂盒的制作方法
【专利说明】制备靶RNA消除组合物的方法和试剂盒 发明领域
[0001] 本发明提供了从初始的含RNA组合物制备靶RNA消除组合物的方法。本文公开的 方法能够从分离的总RNA中有效地消除不需要的靶RNA，如rRNA。该方法特别适合于制备 用于下一代测序应用，特别是转录组测序的RNA。此外，提供了适合实施本发明方法的试剂 盒。
[0002] 发明背景
[0003] 转录组学是表征从所研宄的特定基因组转录的RNA的科研领域。现已开发了几种 方法来分析转录的RNA，例如基因表达系列分析（SAGE)、Cap分析基因表达（cap analysis gene expression，CAGE)和大规模平行签名测序。另一种方法是转录组测序。传统上，测 序由Sanger测序进行。
[0004] 在最近几年，出现了根本性的转变，从利用Sanger法进行测序转为所谓的"下一 代测序"(NGS)技术。在此，存在不同的NGS技术和方法，例如焦磷酸测序，合成测序或连接 测序。然而，大多数NGS平台共享一个技术特征，即，克隆扩增的或单个DNA分子的大规模 平行测序，所述DNA分子是在流动室中或通过产生油-水乳液而在空间上分离的。在NGS 中，测序是通过聚合酶介导的核苷酸延伸的重复循环，或以一种格式，通过寡核苷酸连接的 迭代循环进行。作为大规模平行处理，NGS在一次仪器运行中根据平台的不同产生数百个 百万碱基到十亿碱基的核苷酸序列输出。廉价地生产大量序列数据是其相比于传统方法的 主要优点。因此，NGS技术已经成为遗传学研宄的主要驱动力。现已发现几个NGS技术平 台可广泛使用，包括，例如，以下NGS平台：罗氏（Roche)/454，Illumina Solexa基因组分析 仪，应用生物系统公司的SOLiD?系统，Ion Torrent TM半导体序列分析仪，PacBio?:实时 测序和Helicos?单分子测序（SMS)。NGS技术、NGS平台和NGS技术的常规应用/领域总 结于，例如 Voelkerding 等（Clinical Chemistry 55:4641-658,2009)和 Metzker (Nature Reviews/Genetics第11卷，2010年1月，第31-46页）。除了 NGS技术中的测序是以大规 模平行方式进行的特征，NGS技术平台的共同之处在于它们需要制备适于大规模平行测序 的测序文库。此类测序文库例子包括片段文库，末端配对文库（mate-paired library)或 条形码片段文库（barcoded fragment library)。在仪器上"运行"前，大多数平台采取略 作修改的常规文库制备过程。此过程包括将可从cDNA获得的DNA片段化（例如，通过机械 剪切，如声波处理（sonification)、水力剪切、超声波、雾化或酶促片段化），随后进行DNA 修复和末端抛光（end polishing，平端或A突出端），和，最后的，往往是平台特异性适配体 连接。此类测序文库的制备和设计也描述于Voelkerding，2009和Metzker，2010。
[0005] 这些新的高通量、下一代测序技术已经在许多研宄领域获得了快速和全面的结 果，包括但不限于诊断、癌症、干细胞研宄、宏基因组学、群体遗传学和医学。当今的NGS研 宄越来越依赖于从复杂样品和有限的起始原料中获得高质量测序数据的能力。NGS也已用 于转录组测序。转录组测序也称为"RNA-seq"和用于，例如生物学样品的作图和定量记录 中。该技术已迅速用于癌症等疾病的研宄中。凭借深覆盖和基准水平分辨率，下一代测序 提供基因的差异表达信息，包括等位基因和不同剪接转录物；非编码RNA ;转录后突变或编 辑；和基因融合。可采用上述的各种平台进行转录组测序（RNA-seq)。进行下一代测序所 必需的测序文库的产生可能会在平台之间有所不同，但各技术中也有共同性内。转录组测 序的一个主要问题是存在干扰性RNA分子。例如，核糖体RNA(rRNA)是总RNA中最丰富的 分子，其中通常超过90%的总RNA为rRNA。然而，核糖体RNA提供的关于转录的信息很少。 在应用中，如RNA测序（RNA-seq)时，最大程度提高从测序运行接收到的信息量是极其令人 感兴趣的。如果文库构建涉及丰富的rRNA，大部分的测序能力将用于测序这些无所不在的 分子，从而减少研宄其余转录组可用的能力。因此，宝贵的测序资源被浪费。此外，存在核 糖体RNA可能会导致低信噪比，从而难以检测感兴趣的RNA种类。因此，除去rRNA和/或 其它不需要的RNA提高了下游测序的价值。为了提供不含rRNA或其它不需要的RNA种类 的测序文库，现有技术中开发了几种方法。
[0006] 根据该基于polyA富集的常用方法，polyA+RNA从总RNA获得。PolyA RNA可采用 普通方法分离，例如利用以poly (T)寡核苷酸作官能化，从而可相应捕获PolyA RNA的磁性 珠。从polyA RNA制备测序文库的优点在于，不携带polyA尾的RNA，例如rRNA不会从总 RNA中回收，并且相应地不会被带入测序反应。因此，从利用polyA RNA产生的测序文库中 获得的大多数序列对应于确实携带polyA尾的蛋白编码mRNA。然而，利用纯化的polyA RNA 制备测序文库也有缺点。有几种类型的RNA不带有polyA尾，并因此在polyA富集中丢失， 但仍是转录组测序所感兴趣的。例如，polyA富集导致作为转录组重要组成部分的非聚腺苷 酸化mRNA序列损失。某些真核mRNA，例如那些编码组蛋白的，也不携带polyA尾，其它携带 polyA尾太短，从而无法通过寡聚dT有效捕获。此外，该方法不能用于原核mRNA，因为它们 未聚腺苷酸化。再一缺点是，polyA富集需要高品质的完整的总RNA作为输入材料。PolyA 富集对于降解的RNA样本不可行，因为只有携带polyA尾的片段才能被捕获。
[0007] 因为polyA富集相关的这些缺点，开发了替代方法。相比于基于polyA富集的方 法，这些方法的目的不是富集感兴趣的RNA，而是着眼于消除和因此去除后续转录组分析不 感兴趣的RNA类型，例如rRNA。相比于polyA富集，基于rRNA消除的方法保留了非腺苷酸 化、非编码和调控RNA的信息，从而能研宄RNA调节、新生转录、RNA编辑和增加我们对转录 组复杂性理解的其它现象。在此，再次开发了不同的方法以消除不需要的靶RNA，以便制备 用于NGS的总RNA。一种方法是借助杂交在靶RNA全长上的长探针来消除不需要的靶RNA， 如核糖体RNA。市售可得的产品是RiboZero (Epicentre)，它使用rRNA的生物素化长转录 物作为探针与初始RNA组合物中存在的rRNA杂交。得到的杂交体利用链霉亲和素珠除去。 藉此获得rRNA消除组合物。所用的探针是RNA探针，因此必须贮存于不便于处理的-70 至-80°C。相应的技术描述于W0 2011/019993。所述方法的优点是它即便在降解RNA的情 况下，也有效地去除了核糖体RNA。然而，所述方法对于不同生物的效率有所不同。此外，在 片段化rRNA的情况下，有效去除rRNA所必需的长探针也有缺点，即，它们可以与非靶RNA 交叉杂交，从而产生信息性RNA的非特异性消除。因此，该方法的缺点在于特异性。另一种 市售可得的rRNA消除方法/试剂盒是英杰公司（Invitrogen)的RliboMinus技术。在此， 生物素化锁定核酸探针用于杂交不需要的靶RNA，利用链霉亲和素珠结合并除去标记的杂 交体。该方法使用较短的探针，因此效率明显低于RiboZero方法，特别是在片段化RNA的 情况下消除rRNA的效率较低（也参见实施例）。此外，该现有技术带来的风险也在于rRNA 消除期间，因为rRNA探针和，例如mRNA序列之间的非特异性相互作用导致信息RNA的非特 异性消除。因此，需要这样一种靶RNA消除方法，该方法在片段化的情况下的特异性改善， 而且能有效地消除不需要的靶RNA。
[0008] 无论是通过消除不需要的靶RNA或是富集想要的RNA类型，制备RNA组合物后，制 备得到的RNA以供NGS测序的典型方法涉及产生第一链cDNA，例如通过随机六聚体引发的 逆转录，和随后利用RNA酶H和DNA聚合酶产生第二链cDNA。例如，该cDNA可以片段化并 连接到NGS适配体。对于小RNA，例如微小RNA(miRNA)和短干扰RNA，通常采用经由小RNA 富集方法的优先分离、在电泳凝胶上作尺寸选择，或这些方法的组合。RNA连接酶可用于连 接适配体序列与RNA ;该步骤后常是PCR扩增步骤，然后进行NGS处理。测序后，获得的读 取值可与参比基因组比对，与已知的转录物序列比较，或从头组装头，以构建基因组规模的 转录图谱。
[0009] 从总RNA中消除不需要的RNA分子（如rRNA)的另一种方法描述于W001/32672。 将RNA与诱饵分子接触，所述诱饵分子能够与不需要的靶序列，例如rRNA形成复合物，由此 形成诱饵：靶复合物，从而可自初始组合物中除去。可用信号部分标记得到的rRNA消除组 合物，将之用于制备mRNA文库，或者利用阵列杂交技术将之用于表达研宄。公开了几种方 法用于除去诱饵：靶复合物，多种其他方法也是基于杂交体捕获的方法。
[0010] 本发明的目的是提供适合于从总RNA中消除不需要的靶RNA，如rRNA，并能避免现 有技术方法中至少一个缺点的方法。具体地，该目的是提供用于制备总RNA以供下一代测 序应用，特别是转录组测序的方法，该方法是有效的，特异性的，也可以用来从不同的样品， 包括源自不同物种的样品和降解样品中消除不需要的靶RNA。
[0011] 发明概述
[0012] 本发明是基于以下发现，即，将与待消除的靶RNA杂交的专门设计的探针分子与 杂交体捕获联用，提供从含有RNA的组合物中除去和由此消除不需要的靶RNA的显著改进 方法。可利用该方法特异性且高效地从总RNA中消除rRNA，从而提供可用于NGS应用，如转 录组测序的rRNA消除的RNA。
[0013] 根据第一方面，提供了从初始的含RNA组合物制备靶RNA消除组合物的方法，包 括：
[0014] a)使初始的含RNA组合物与一组或多组探针分子接触并在靶RNA和探针分子之间 产生双链杂交体，其中的探针分子组具有以下特征：
[0015] i)该组包括长度为l〇〇nt或更小的两种或多种不同的探针分子；
[0016] ii)包含于所述组中的探针分子与靶RNA中存在的靶区域互补；
[0017] iii)当与所述靶区域杂交时，所述两种或更多种不同的探针分子在形成的双链杂 交体中处于彼此邻近定位；
[0018] b)利用结合双链杂交体的结合剂捕获所述双链杂交体，由此形成杂交体/结合剂 复合物；
[0019] C)从所述组合物中分离所述杂交体/结合剂复合物，从而提供靶RNA消除的组合 物。
[0020] 本发明采用专门设计的探针分子组，所述探针分子杂交并标记不需要的靶RNA，例 如不同的rRNA物质以便消除。各组探针分子靶向靶RNA中的特定区域，在此也称为靶区域， 各组探针分子包括两种或更多种不同的与所述靶区域杂交的短探针分子。当杂交至其靶 区域时，一组的短探针分子在所形成的双链杂交体中均位于彼此相邻的位置并由此非常接 近。所形成的双链杂交体跨越并由此覆盖靶区域。然后包含一组短探针分子的所形成的双 链杂交体与抗杂交体结合剂结合，从而形成杂交体/结合剂复合物。所述复合物可以从剩 余的组合物中容易地分离，从而去除不需要的靶RNA，由此提供靶RNA消除的组合物。如实 施例所示，与现有技术靶RNA消除方法相比，将专门设计的探针分子与杂交体捕获技术联 用显著地提高了靶RNA去除的特异性和有效性。利用一种或多组包含与靶RNA内特定靶区 域杂交的多个短探针分子，重要的优点在于特异性的增加，因为与较长的探针分子相比，短 探针分子对错配的耐受较低。如此在探针水平降低了与非靶RNA的非特异性结合。使用短 探针长度的额外优点是生物信息学设计的自由度。探针分子越短，可设计的探针的可能非 重叠组合越多。如此能够提供与非靶序列很少或甚至不交叉杂交的探针分子。由于进行了 杂交体捕获步骤，而使特异性得到第二级的提高。如果所述杂交体不包含或只含有很少的 错配，抗杂交体结合剂，例如抗杂交抗体仅识别双链杂交体。这有利于捕获完美匹配，这通 常发生在探针分子与其靶RNA结合的情况下。此外，如果本发明方法特别利用长度为35nt 或更小，优选30nt或更小的短探针分子，这会对特异性有额外的提高。如果长度为35nt 或更少的单个探针分子非特异性地杂交非靶RNA，抗杂交体结合剂通常不能很好地识别如 此形成的短的双链杂交体。因此，非特异性地结合非靶RNA的相应单个探针分子不能提供 足够长的双链杂交体，以便与抗杂交体结合剂有效结合，特别是在抗杂交体抗体的情况下。 此外，如果一种以上的抗杂交体结合剂，例如抗杂交体抗体能够结合于待消除的杂交体，就 像如果一组的探针分子杂交于靶标的情况下，捕获和由此的消除效率得以提高。基于上述 理由，大多数非特异性结合事件将不会被抗杂交体结合剂捕获，因此，非特异性结合的非靶 RNA不从含有RNA的组合物中消除。然而，如果一组的所有探针分子杂交到其靶区域，形成 明显较长的双链杂交体。抗杂交体结合剂很好地识别不含错配的所形成的长双链杂交体， 从而确保有效的捕获和去除。因此，当与其靶区域杂交时，短探针分子组基本上模拟了长探 针分子的特征，改善了抗杂交体结合剂的捕获情况。当利用由此优选的抗杂交体抗体时，尤 其能够实现特异性提高的这种有益效果。
[0021] 实施例证明了本发明方法的优异效率和优良的特异性，这些实施例尤其显示了与 现有技术的方法相比，将多种相邻的短探针分子与杂交体捕获联用显著提高了靶RNA去除 的特异性，从而导致更少的感兴趣RNA被非特异性地去除（具体参见图6和7)。此外，即便 在片段化RNA的情况中，该方法实现超过99%的消除率，是高效的。因此，当如本文所教导 采用包含两种或更多种相邻短探针分子的一组或多组探针分子时，与较长探针相比，靶RNA 的结合效率未受影响。然而，因为非特异性结合事件较少导致了特异性显著提高，以及由于 抗杂交体结合剂（因此优选抗杂交体抗体）捕获正确形成的双链杂交体而导致的额外的特 异性水平。因此，靶RNA消除组合物有利地保留了 RNA种类的多样性，包括polyA mRNA、非 腺苷酸化mRNA、非编码RNA和调节RNA。信噪比得到改善，并能够检测低丰度RNA。采用本 发明方法可以同时消除多种不需要的靶RNA。因此，本发明提供的方法显著改善了现有的靶 RNA消除方法。靶RNA消除组合物可以用于许多下游应用，包括但不限于微阵列分析、文库 构建、逆转录、扩增、转录谱、表达分析和重要的测序应用。
[0022] 根据第二方面，提供了对包含在样品中的感兴趣RNA分子进行测序方法，包括：
[0023] a)获得含RNA的组合物，优选从样品中分离总RNA ;
[0024] b)采用第一方面的方法，从该含RNA的组合物，优选总RNA中消除不需要的靶 RNA，从而提供靶RNA消除的组合物；
[0025] c)任选除去未结合的探针分子；
[0026] d)对包含在靶RNA消除组合物中的RNA分子进行测序。
[0027] 如上文所释，第一方面的方法有效地从总RNA中除去不需要的靶RNA，如不同类型 的核糖体RNA(rRNA)，同时确保回收不同物种，包括人、小鼠和大鼠的mRNA和非编码RNA。通 过提高有用数据的比例，降低偏倚并保留非编码RNA，该方法提供了特别适用于下一代测序 (NGS)应用的高质量RNA。通过将所述消除方法整合入常规的测序应用，特别是NGS应用， 例如转录组测序，为测序RNA分子提供了改进的方法。
[0028] 根据第三方面，提供一种试剂盒，适合于从含有RNA的组合物中消除靶RNA，包括
[0029] a) -组或多组消除靶RNA的探针分子，其中，探针分子组具有以下特征：
[0030] i)该组包含长度为l〇〇nt或更小的两种或多种不同的探针分子；
[0031] ii)包含在所述组中的探针分子与靶RNA的靶区域互补；
[0032] iii)与所述靶区域杂交时，所述两种或更多种不同的探针分子在形成的双链杂交 体中彼此邻近定位；
[0033] 和
[0034] b)适合与探针分子和靶RNA之间形成的双链杂交体结合的结合剂。
[0035] 可利用相应的试剂盒实施本发明第一方面的方法。可将试剂盒中所用的各组探 针分子设计成与多种不需要的靶RNA，如大（18S，28S)，小（5S，5. 8S)，与线粒体（12S，16S) rRNA特异性地杂交。每种靶RNA利用多种短寡核苷酸以确保，即使有降解靶RNA或突变的 存在，所述靶RNA也会被完全从样品中除去。由于它们的长度短，可以仔细设计探针以确保 与非靶RNA分子的交叉反应性最小。进一步的优点如上所述。可将此试剂盒中的探针设计 成能够除去不同物种，例如人、小鼠和大鼠的靶RNA。如实施例所示，本发明的试剂盒能够从 总RNA中除去>99. 9%的靶RNA分子。因此，该试剂盒可用于高选择性地有效除去不需要的 靶RNA，如不同类型的rRNA，以便用于下一代测序应用。
[0036] 本领域技术人员从以下描述和所附权利要求会明白本申请的其它目的、特征、优 点和各方面。然而，应当理解，虽然以下描述、所附的权利要求和具体的实施例显示了本申 请的优选实施方式，但这些仅是通过举例说明的方式给出。本领域技术人员从阅读下文不 难明白所公开的本发明构思和范围内的各种变化和修改。
[0037] 发明详述
[0038] 在第一方面，提供了从初始的含RNA组合物制备靶RNA消除组合物的方法，包括：
[0039] a)使初始的含RNA组合物与一组或多组探针分子接触并在靶RNA和探针分子之间 产生双链杂交体，其中的探针分子组具有以下特征：
[0040] i)该组包括长度为l〇〇nt或更小的两种或多种不同的探针分子；
[0041] ii)包含于所述组中的探针分子与靶RNA的靶区域互补；
[0042] iii)当与所述靶区域杂交时，所述两种或多种不同的探针分子在形成