。由于直接包含了抗杂交体结合剂，由此抗杂交体结合剂相应存在于 RNA变性和杂交期间，这是特别方便的，因为节省了处理步骤。在此实施方式中，步骤a)和 b)同时进行。变性条件的选择应尽可能降低RNA降解。此外，杂交期间可以存在RNA酶抑 制剂，以便尽可能降低RNA酶导致所含RNA的降解。可将RNA酶抑制剂，例如掺入杂交缓冲 液。
[0065] 在步骤a)中，在靶RNA与探针分子之间产生序列特异性双链杂交体。因此，每使 用一组探针分子形成一双链杂交体。如上所述，所述双链杂交体可以在邻近的探针分子之 间包括小间隙。然而，出于上述原因，优选毗连的探针设计，其中杂交的探针分子之间相应 不存在核苷酸缺口。如果利用相应设计多组探针分子和由此的探针集合靶向于靶RNA内的 几个靶区域的话，可对较长的靶RNA进行标记以便通过几个相应的双链杂交体消除。在能 使一组或多组的探针分子中的探针分子与相应的互补RNA退火形成双链杂交体的条件下 发生杂交。采用适合于所用的特定探针分子和杂交缓冲液的杂交条件。例如，所述探针分 子和含RNA的组合物可以温育合适的杂交时间，优选至少为约5至约120分钟、约10至约 100分钟、约15至约80分钟、约20至约60分钟、约25分钟至约40分钟以及列举范围内的 任何数字，因此时间足以允许探针分子与它们的靶RNA退火。杂交条件可包括至少约40°C、 优选至少约45°C、更优选至少约50°C的杂交温度。合适的杂交温度还取决于所用探针分子 的长度和所用的杂交溶液。合适的杂交溶液如上所述，也可由技术人员确定。合适的杂交 温度-特别适合于长度范围在20-35nt的探针分子-可选自一范围，包括但不限于45°C至 65°C，优选50°C至约60 °C，以及列举范围内的任何数字。对于给定的靶RNA和给定的探针 分子，本领域普通技术人员不难通过常规实验确定所需的杂交条件和杂交时间。本领域普 通技术人员将进一步了解，杂交的时间和温度可以相对彼此进行优化。可以通过降低或升 高温度或降低或升高盐浓度/离子强度，通过加入去污剂或有机溶剂（例如DMSO,甲酰胺 等）来控制严格杂交条件，不限于此。
[0066] 步骤b)
[0067] 在步骤b)中，所产生的双链核酸杂交体由结合所形成的双链核酸杂交体（分别结 合众多形成的杂交体）的分子捕获。此类分子在本文中称为抗杂交体结合剂。由此，形成 了杂交体/结合剂复合物，其中此类复合物可以包括由至少一个抗杂交体结合剂结合的至 少一个双链杂交体。如本文所述，两种或多种抗杂交体结合剂分子可结合于一种双链杂交 体。步骤a)和b)可以同时进行（也参见实施例），或者可单独进行。
[0068] 双链核酸杂交体的特异性结合剂包括但不限于，抗体、抗体片段和蛋白，例如RNA 酶H。在一方面，与所形成的双链杂交体结合的抗体被用作抗杂交体结合剂，相应的抗体也 称为抗杂交体抗体。由于特异性较高，相比于，例如RNA酶H，优选利用抗杂交体抗体。抗 杂交体抗体不与包含错配的杂交体良好结合，另外，利用抗杂交体抗体对在从上述单个探 针分子形成杂交体的情况中进行的捕获效率不高。RNA酶H可消化包含在错配杂交体中的 RNA。因此，本发明优选利用长度为35nt或更小的探针分子的组合，特别是当将上述毗连探 针设计与抗杂交体抗体连联用四时，对于提高特异性，同时实现高消除效率特别有利。所 以，可以用双链杂交体特异性的抗体或抗体片段捕获本发明形成的双链杂交体。随后，我们 将参考抗杂交体抗体描述合适的和优选的实施方式。然而，所述的描述同样适用于抗杂交 体抗体片段，例如Fab片段或能够特异性结合所形成的杂交体的其它合适的抗杂交体结合 剂。
[0069] 抗杂交体抗体对于双链杂交体，优选RNA/DNA杂交体具备特异性。为确保不结合 双链RNA，对RNA/DNA杂交体的高特异性是有利的。本领域技术人员会理解，可利用多克隆 或单克隆抗杂交体抗体。在一方面，利用单克隆抗体，其支持捕获步骤中的高严格温育温 度。
[0070] 在本发明的一方面，利用衍生自杂交瘤细胞系的单克隆抗RNA/DNA杂交体抗体。 此类杂交瘤细胞系描述于美国专利号4, 865, 980、美国专利号4, 732, 847和美国专利号 4, 743, 535。杂交体特异性单克隆抗体也可以采用本领域的标准技术制备。杂交体特异性 单克隆抗体可同时用于捕获和检测靶核酸。适于特异性结合形成杂交体的其它结合剂也可 用作结合剂用于杂交体的捕获。
[0071] 形成的杂交体与抗杂交体结合剂温育足够长的时间，从而使抗杂交体结合剂能结 合并由此捕获双链杂交体。藉此，形成了双链杂交体/结合剂复合物。抗杂交体结合剂可 以游离存在于溶液中或可固定于固体载体上。在一方面，利用固定于支持物上的抗杂交体 结合剂，如抗杂交体抗体。可采用本领域的标准技术实现固定化。支持物包括但不限于：反 应容器，包括微量滴定板（其中一个或多个孔用抗杂交体结合剂官能化，优选用抗杂交体 抗体官能化）、颗粒、磁性颗粒、柱、板、膜、滤纸和试纸条或可在分离技术中使用的任何其它 固体支持物。可以利用任何支持物，只要它能分离液相。优选小且具有高表面积的颗粒，例 如直径约 0? 1 y m 至 20 y m、0. 25 y m 至 15 y m、0. 5 y m 至 10 y m 和 0? 75 y m 至 5 y m 的颗粒。 当利用磁性颗粒作为抗杂交体结合剂的固体支持物时，例如具有超顺磁性、顺磁性、铁磁性 或铁磁特性，可借助磁场，例如利用永磁体方便地分离结合有杂交体/结合剂复合物的相 应磁性颗粒。还可以通过过滤分离颗粒。
[0072] 抗杂交体抗体可以是单克隆或多克隆的。在一个方面，所述抗体是单克隆抗体。在 一个方面，所述抗体通过1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亚胺盐酸盐（EDAC)接头偶 联于支持物。在一方面，所述支持物由聚合物颗粒，如聚苯乙烯珠提供。在一方面，用颗粒 稀释缓冲液稀释偶联于结合剂，优选抗体的颗粒。颗粒稀释缓冲液有助于尽可能降低珠上 蛋白的变性。合适的颗粒稀释缓冲液是现有技术中已知的。
[0073] 如上所述以及实施例所示，抗杂交体结合剂还可以游离在溶液中。然后可由第二 结合剂捕获形成的杂交体/结合剂复合物以简化复合物的分离，这将结合步骤c)中进行说 明。第二结合剂可以固定于适用于分离技术的固体支持物，也可以存在于步骤a)和/或步 骤b)期间。基本上可利用任何固体支持物，包括上文结合实施方式描述的，其中抗杂交体 结合剂直接固定于固体支持物上。此外，以下也落在本发明的范围内：由另一结合剂结合杂 交体/结合剂复合物，例如包含在该复合物内的抗杂交体结合剂，所述另一结合剂游离在 溶液中以便实质性标记复合物以供消除，然后使用结合所述另一结合剂的第二结合剂，从 而也间接结合，相应捕获杂交体/结合剂复合物。
[0074] 在一方面，进行温育步骤用于将抗杂交体抗体与形成的双链杂交体结合。温育可 以在室温下或在升高的温度下进行。如果形成的杂交体的结合以及由此的捕获与探针分子 和靶RNA的杂交同时发生，可采用上述升高的温度。温育时间可以为足以进行捕获的约5 至约120分钟、约10至约100分钟、15至约80分钟、20至约60分钟或约25至约50分钟， 以及所述范围内的任何数字。此外，如上所述，也可同时进行杂交和捕获，如此减少了准备 时间。在所述温育期间，可以对组合物并且优选进行搅拌，例如振荡。本领域技术人员应该 理解，温育时间、温度和/或振荡条件可以视需要改变以实现其它捕获动力学特征。
[0075] 根据一实施方式，该方法优选包括在有探针分子的存在下，最好也在有抗杂交体 结合剂存在下，在合适的杂交溶液，例如2XSSC缓冲液中，在至少70°C下对纯化的总RNA 进行至少3分钟、优选至少5分钟，但更优选少于lOmin的变性。将所得混合物在50°C温 育30分钟，优选同时搅拌该混合物。在该实施方式中，杂交和捕获（步骤a)和b))同时发 生，考虑到处理时间，这是有利的。如果抗杂交体结合剂不固定于固体支持物上，变性的杂 交混合物与包含固定的第二结合剂的固相接触，并如上所述对得到的混合物进行温育，所 述第二结合剂能结合并由此捕获抗杂交体结合剂，因此能捕获所形成的杂交体/结合剂复 合物。可将与固定的杂交体/结合剂复合物所结合的固体支持物与剩余样品分离。例如， 如果颗粒，如磁性颗粒用作固体支持物，可在步骤c)中利用磁体或通过过滤方便地除去颗 粒和相应结合的复合物，从而提供消除了不需要的靶RNA的RNA组合物。如果使用柱作为 固体支持物，复合物被保留在柱中，而不需要的靶RNA消除的组合物可以作为流出物收集。
[0076] 步骤 c)
[0077] 在双链杂交体结合以及由此的捕获之后，捕获的杂交体与剩余的组合物分开，从 而提供靶RNA消除的组合物。如果抗杂交体结合剂与相应形成的杂交体/结合剂复合物固 定在固体支持物上，分离是特别容易的。上文描述了合适的固体支持物，本领域技术人员可 以利用这些固体支持物和合适的分离程序，从而能将固体支持物与剩余样品分开。如上所 述，可将抗杂交体抗体，例如偶联于固相，然后可将结合于固体支持物的杂交体/结合剂复 合物与剩余的样品分开，从而提供靶RNA消除的组合物。例如，可将抗杂交体抗体偶联于磁 性颗粒，这可以利用磁体或通过过滤分离。该实施方式是优选的，因为它与已有的手工或机 器人系统兼容。为利用磁场处理磁性颗粒，现有技术中存在不同的系统可与本发明联用来 处理结合有杂交体/结合剂复合物的磁性颗粒。根据一实施方式，磁性颗粒收集在反应容 器的底部或侧面，而剩余的液体样品从反应容器中除去，留下结合有杂交体/结合剂复合 物的所收集磁性颗粒。可通过，例如倾析或抽吸取出相当于靶RNA消除组合物的剩余样品。 此类系统是现有技术中熟知的，因此无需在此详细描述。在已知用于处理磁性颗粒的替代 系统中，将磁体投入反应容器来收集磁性颗粒，所述磁体通常覆有包覆或外壳。然后可除 去携带所结合的杂交体/结合剂复合物的磁性颗粒，从而留下靶RNA消除的组合物。由于 相应的系统是现有技术中熟知的，也可以商品化购得（例如QIASYMPHONY?;凯杰公 司-QIAGEN)，无需在此详细描述。在已知用于处理磁性颗粒的进一步替代系统中，可将包含 磁性颗粒的样品吸入移液管尖端，通过将磁体应用于，例如移液管尖侧，从而将磁性颗粒收 集在移液管尖端。然后，可从移液管尖端释放对应于靶RNA消除组合物的剩余样品，而携带 所结合的杂交体/结合剂复合物的所收集磁性颗粒因磁体而保持在移液管尖端。此类系统 也是现有技术中熟知的，并且也可商品化购得（例如BioRobot EZ1，凯杰公司），因此，在此 无需任何详细的描述。然而，与任何其它颗粒一样，还可通过其它方式，例如过滤来分离磁 性颗粒。还可以利用自动化系统（例如，QIAcube，凯杰公司）进行过滤。
[0078] 根据另一实施方式，以下方案是可行的，如果抗杂交体结合剂未固定于固体支持 物，利用以第二结合剂官能化的固相支持物，所述第二结合剂结合杂交体/结合剂复合物。 细节及适宜的固体支持物如上所述。例如，该第二结合剂可结合抗杂交体结合剂，由此能将 杂交体/结合剂复合物与剩余的组合物分离。例如，第二结合剂可以是G蛋白或A蛋白，如 果利用抗杂交体抗体作为抗杂交体结合剂，它们是合适的。固定于固体支持物的所述第二 结合试剂也可以是步骤a)和/或b)中已经存在的，考虑到处理时间，这是有利的。也有可 能有实现分离的其它结构，这些结构是本领域技术人员熟知的。
[0079] 通过将杂交体/结合剂复合物与剩余的组合物分离，从剩余的RNA组合物中有效 地除去了不需要的靶RNA。由此，获得靶RNA消除的组合物，以供进一步使用，例如用于扩增 方法、微阵列分析、表达分析和/或用于NGS应用。例如，靶RNA消除的RNA组合物可用于 构建测序文库。
[0080] 靶 RNA
[0081] 靶RNA可以是初始RNA组合物中存在的任何不希望的RNA。靶RNA可包括任何序 列，只要它凭借其序列可以与剩余的感兴趣RNA群体相区分，从而能序列特异性地设计探 针分子。靶RNA可基于任何标准进行选择，包括序列、功能或它们的组合。如本文证实的， 可以采用本发明的方法从初始的含RNA组合物中同时消除多种靶RNA。
[0082] 根据一实施方式，待消除的靶RNA选自：rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA和丰富的蛋白 质mRNA。优选地，一类或多类rRNA作为靶RNA，相应的靶RNA得到消除。
[0083] 处理真核样品时，待消除的rRNA优选是真核rRNA，宜选自：28S rRNA、18S rRNA、 5. 8S rRNA、5S rRNA、线粒体12S rRNA和线粒体16S rRNA。优选消除上述rRNA类型中的至 少两种、至少三种、更优选至少四种，其中在靶rRNA中优选消除18S rRNA和28S rRNA。根 据一实施方式，靶向并由此消除所有上述的rRNA类型。可利用各靶rRNA类型特异性的一 组探针分子或探针集合消除所述靶rRNA。如上所述，对于较长的靶RNA，例如18S rRNA和 28S rRNA，优选利用相应包含两组或多组探针分子的探针集合，从而靶向并由此消除所述 靶RNA。优选地，用于消除特定rRNA的探针分子组或探针集合适合于消除不同真核样品中 相应的rRNA，所述样品优选至少来自人、小鼠和大鼠样品，优选还包括其它哺乳动物样品。 由于rRNA在这些物种之间高度保守，因此可设计能特异性消除相应靶rRNA的探针集合的 两组或多组探针分子或一组探针分子，而无论物种来源。
[0084] 此外，除了 28S rRNA和18S rRNA外，优选还靶向并由此消除其它非编码rRNA物 质，如12S和16S真核线粒体rRNA分子。因此，根据一实施方式，利用靶向并由此消除12S 和16S真核线粒体rRNA分子的一组或多组探针分子或探针集合。此外，可消除质体rRNA， 例如叶绿体rRNA作为靶RNA，例如在处理植物样品中总RNA的情况下。
[0085] 根据一实施方式，消除靶RNA，所述靶RNA选自：23S、16S和5S rRNA原核rRNA。处 理原核样品时，这是特别可行的。优选地，利用相应rRNA类型特异性的一组或多组探针分 子或探针集合消除所有这些rRNA类型。
[0086] 此外，如上所述，还可采用本发明方法来特异性消除丰富的蛋白质编码mRNA。根据 所处理的样品，包含在样品中的mRNA可能主要对应于某些特定的丰富mRNA类型。例如，要 进行分析，例如测序血样的转录组时，包含在样品中的大多数mRNA会对应于球蛋白mRNA。 然而，许多应用对于所包含的球蛋白mRNA的序列不感兴趣，因此，即便是蛋白质编码mRNA， 球蛋白mRNA也代表了此应用不需要的靶RNA。为了除去此类不需要的丰富mRNA序列，优 选使用一组探针分子，或根据待消除的丰富mRNA的长度，使用特异性靶向各丰富的mRNA作 为靶RNA的探针集合。由此，各丰富的mRNA，例如在血液样品中的球蛋白mRNA，可以容易地 从样品中消除，因此，不会增加后续测序反应的负担。在此，为用户提供除去丰富的蛋白质 mRNA序列（一种特定的样品类型，例如在血液样品中的蛋白质mRNA)所设计的探针分子组 或特异性探针集合也落在本发明的范围内。此类探针分子组或探针集合还可用于从初始的 含RNA组合物中消除不同类型rRNA的探针分子组和/或探针集合。
[0087] 如上所述，如果要从初始的含RNA组合物中消除两类或更多类靶RNA，优选利用一 组探针分子，或者，特别是在靶RNA较长的情况下，待消除的各靶RNA利用一探针集合。因 此，根据一实施方式，利用多组探针分子和/或探针集合，其中的每一个都旨在从含RNA的 初始样品中除去不同类型的靶RNA。如上所述，探针集合包含两组或多组的探针分子，其中 各组中包含的探针分子靶向并由此与特定靶RNA内的特定靶区域杂交。优选利用多组探针 分子和/或探针集合从初始的含RNA组合物中消除三种或更多种，优选四种或更多种，最优 选所有的 28S rRNA、18S rRNA、5.8S rRNA、5S rRNA、线粒体 12S rRNA 和线粒体 16S rRNA。 此外，如果需要的话，可以利用单一探针分子，例如，可掺入待消除的特定靶RNA的探针集 合中。
[0088] 实施例中还描述了可用于本发明方法并适合消除28S rRNA和18S rRNA的探针集 合以及适合消除5. 8S rRNA和5S rRNA的探针分子组，具体参见表1。
[0089] 根据其中至少28S rRNA作为靶RNA被消除的实施方式，利用28S rRNA探针集合， 其中，包含在28S rRNA探针集合中的至少一组，优选至少两组，至少四组，至少六组，至少八 组，至少十组，最优选所有探针分子组包含两种或多种毗连的探针分子。在此实施方式中， 包含在相应毗连组中的至少两种探针分子是毗连的。此外，优选在28S rRNA探针集合的至 少三组中，优选在至少六组中，所有包含的探针分子与它们的组成员是毗连的。根据一实施 方式，包含在28S rRNA探针集合的各组中的至少75 %、至少80 %、更优选至少85 %、更优选 至少90%、最优选至少95%的所有探针分子与它们的组成员是毗连的。包含在28S rRNA 集合中的探针分子优选长度为50nt或更小，优选35nt或更小，更优选30nt或更小，最优选 在20nt-25nt的范围内。28S rRNA探针集合优选包含表1所示28S rRNA探针集合的各探 针分子组中的至少一组，优选至少两组，至少四组，至少六组，更优选至少八组，至少十组， 最优选所有组。
[0090] 根据其中至少18S rRNA作为靶RNA被消除的实施方式，利用18S rRNA探针集合， 其中，包含在18S rRNA探针集合中的至少一组，优选至少两组，更优选至少三组，至少四组， 最优选所有探针分子组包含两种或多种毗连的探针分子。在此实施方式中，包含在相应毗 连组中的至少两种探针分子是毗连的。此外，优选在18S rRNA探针集合的至少两组中，优 选在至少三组中，所有包含的探针分子与它们的组成员是毗连的。优选地，包含在18S rRNA 探针集合的各组中的至少75 %、至少80%、更优选至少85%、更优选至少90%、最优选至 少95%的探针分子与它们的组成员是毗连的。包含在18S rRNA探针集合中的探针分子优 选长度为50nt或更小，优选35nt或更小，更优选30nt或更小，最优选在20nt-