用于量化样品中核酸序列的组合物和方法
【专利说明】用于量化样品中核酸序列的组合物和方法
[0001]相关申请的交叉引用
[0002]本申请要求2012年4月9日提交的美国临时申请号61/621，975的权益，所述申请通过引用以其全文结合在此。
[0003]发明背景
[0004]核酸扩增技术已经提供了理解复杂生物学过程，检测、鉴定、和量化病原性和非病原性有机体，法医犯罪学分析，疾病相关研宄，以及遗传上修饰过的有机体中的事件的检测等的手段。聚合酶链式反应(PCR)是用于扩增DNA的常用热循环依赖性核酸扩增技术，所述技术由多个循环的、用于DNA熔化和使用DNA聚合酶的DNA的酶复制的反应的重复加热和冷却组成。实时定量PCR(qPCR)是用于量化生物样品中给定核酸序列的拷贝数的技术。目前，qPCR利用了贯穿所述反应的实时反应产物检测，并且比较扩增图谱与在每个反应开始时包含已知量的核酸(或核酸与未知的所测试的核酸的已知相对比率)的对照的扩增。对照的结果用于构建标准曲线，典型地基于标准反应扩增曲线的对数部分。基于与标准对照量进行比较的它们的扩增曲线的情况，这些值用于插入未知物的量。
[0005]除了 PCR，现存的非热循环依赖性扩增系统或等温核酸扩增技术包括但不局限于:切口和延伸扩增反应(NEAR)、滚环扩增(RCA)、解旋酶依赖性扩增(HDA)、环介导扩增(LAMP)、链置换扩增(SDA)、转录介导扩增(TMA)、自动维持序列扩增(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、单引物等温扩增(SPIA)、Q-f3复制酶系统、以及重组酶聚合酶扩增(RPA)。
[0006]NEAR扩增具有与PRC热循环的相似性。类似于PRC，NEAR扩增采用与PCR中称为引物并且在NEAR中称为模板的靶序列互补的寡核苷酸序列。此外，靶序列的NEAR扩增导致靶序列的对数增长，就像它在标准PCR中的表现一样。不像PCR，NEAR反应是等温地进展。在标准PCR中，温度是增加的，用来允许两个DNA链分开。在NEAR反应中，靶核酸序列在测试样品中存在的特异性切口位点处是切口的。聚合酶渗入切口位点并且与现存互补DNA链的置换一起开始切口的靶核苷酸序列(添加的外源DNA)的互补链合成。链置换复制过程排除了对增加的温度的需求。此时，模板/引物分子从添加的外源DNA退火成置换的互补序列。聚合酶现在从模板的3’端延伸，产生先前置换的链的互补链。然后第二模板/引物寡核苷酸退火成新合成的互补链并且延伸，制成包括切口酶识别序列的NDA的双链体。所述链然后倾向于被切口，伴随通过聚合酶的随后的链置换延伸，这导致在原有革E DNA的任一侧上具有切口位点的DNA的双链体的产生。一旦这被合成，继续通过置换的链与新模板分子一起的复制指数地扩增所述分子。此外，还通过在模板引入的切口位点的切口翻译合成的重复动作，扩增从每个产物分子线性地继续进行。结果是靶信号扩增的非常迅速的增长；与PCR热循环相比，远远更快，其中扩增导致小于十分钟。
[0007]然而，量化已经成了问题。实时NEAR系统的最佳性能取决于特异性产物的产生和扩增。已知除了通过反应酶的特异性产物，NEAR系统产生显著水平的非特异性背景产物。这些背景产物可以用作可扩增实体，并且它们的产生会胜过特异性产物的产生。虽然可能设计特异性针对希望的靶的检测探针(并且因此在复杂背景中，特异性产物是可检测的)，但是显著水平的非特异性背景产物隔离了可能已经另外用于特异性产物的扩增的反应组分。因此，由于非特异性背景产物产生引起的反应组分隔离导致次优的反应。当靶核酸最初处于非常低的丰度时，并且在靶的可靠检测需要高度优化的反应的情况下，这是特别麻烦的。而且，次优的反应不会表示靶核酸的真实量化，即使它是可检测的。会有利的是，产生消除非特异性背景产物的扩增的优化的NEAR反应。这样做会通过基于标准曲线的系统抑或相对量化，提供适合量化的反应。
[0008]而且，通常的做法是使用质谱法来评价NEAR反应。高水平的背景产物会模糊质谱法数据的判读。例如，如果反应包含背景产物、源自非特异性扩增(来自仍相关的不相似的靶)的一种或更多种产物、以及特异性产物，则从背景产物鉴定这些基质衍生的产物将是挑战性的。背景产物的消除导致具体测定的性能/特异性的清晰确定。
[0009]额外地，高水平的背景产物会阻碍有意的双重或多重反应的最佳扩增。虽然多重的、差异化标记的检测探针是与实时检测相容的，但是由于非特异性产物形成，仍存在反应物限制的问题。对于双重或多重反应而言，这是特别真实的，其中这些反应包含可以潜在地形成背景产物的复杂群体的多于两种的模板/引物。消除了背景产物的扩增的NEAR反应系统还提供了用于实时检测有意的双重或多重反应的条件。会高度有利的是，提供了用来消除可扩增背景产物的手段，因此使NEAR反应中产生特异性产物的潜能最大化。会希望的是，是否可以通过反应进展的实时准确监测，提供定量结果。
[0010]发明概述
[0011]如以下描述，本发明特征在于用于实时检测样品中的靶寡核苷酸的组合物和方法，所述方法减少或消除了背景产物的产生，以允许所述样品靶寡核苷酸的量化。这些方法是与使用NEAR反应扩增靶寡核苷酸相容的。本发明至少部分基于以下发现:在单重NEAR反应中可以产生特异性产物，而不产生背景产物。这些反应组合物和方法提供了未知测试样品、双重反应、以及多重反应的相对量化，以及用于未知测试样品的绝对量化的标准曲线的产生。
[0012]在一个方面，本发明提供了量化切口和延伸扩增反应中特异性产物的方法，所述方法涉及:在基本上等温条件下，使靶核酸分子与以下接触:外切酶缺陷的聚合酶、两种或更多种引物/模板寡核苷酸(其中每一个特异性结合所述靶核酸分子上的互补序列)、切口酶、以及可检测的多核苷酸探针，其中每个引物/模板寡核苷酸在与所述靶核酸分子互补的序列中具有一个或更多个2’修饰的核苷酸；产生具有至少一部分所述靶核酸分子的多个扩增子；并且检测特异性针对与所述靶核酸分子或其扩增子杂交的寡核苷酸探针的信号，其中所述信号表明在所述样品中存在的靶核酸分子或其扩增子的量。
[0013]在另一个方面，本发明提供了用于检测在单个反应的过程中产生的多种不同反应产物的方法，所述方法涉及:在基本上等温条件下，使靶核酸分子与以下接触:外切酶缺陷的聚合酶、两种或更多种引物/模板寡核苷酸(其中每一个特异性结合所述靶核酸分子上的互补序列)、切口酶、以及可检测的多核苷酸探针，其中每个引物/模板寡核苷酸在与所述靶核酸分子互补的序列中具有一个或更多个2’修饰的核苷酸；产生具有至少一部分所述靶核酸分子的多个扩增子；并且检测特异性针对与所述靶核酸分子或其扩增子杂交的寡核苷酸探针的信号，其中所述信号表明在所述样品中存在的靶核酸分子或其扩增子的量。
[0014]在一个具体方面，本发明提供了量化切口和延伸扩增反应中特异性产物的方法，所述方法涉及:在基本上等温条件下，使靶核酸分子与以下接触:外切酶缺陷的聚合酶、两种引物/模板寡核苷酸(其中每一个特异性结合所述靶核酸分子上的互补序列)、切口酶、以及可检测的多核苷酸探针，其中每个引物/模板寡核苷酸具有定位在与所述靶核酸分子互补的序列的3’端(例如所述寡核苷酸的3’末端)或其附近的至少约5个连续的2’-0_甲基修饰的核苷酸；产生具有至少一部分所述靶核酸分子的多个扩增子；并且检测特异性针对与所述靶核酸分子或其扩增子杂交的寡核苷酸探针的信号，其中所述信号表明在所述样品中存在的靶核酸分子或其扩增子的量。
[0015]在一个方面，本发明提供了用于实时监测切口和延伸扩增反应的方法，所述方法涉及:在基本上等温条件下，使测试样品与以下接触:外切酶缺陷的聚合酶、两种或更多种引物/模板寡核苷酸(其中每一个特异性结合靶核酸分子上的互补序列)、切口酶、以及可检测的多核苷酸探针，其中每个引物/模板寡核苷酸在与所述靶核酸分子互补的序列中具有一个或更多个2’修饰的核苷酸；产生具有至少一部分所述靶核酸分子的多个扩增子；并且实时检测信号，由此量化所述一个或更多个靶核酸分子。
[0016]在另一个方面，本发明提供了用于实时监测NEAR反应中靶核酸分子的方法，所述方法涉及:在基本上等温条件下，使靶核酸分子与以下接触:外切酶缺陷的聚合酶、两种或更多种引物/模板寡核苷酸(其中每一个特异性结合所述靶核酸分子上的互补序列)、切口酶、异源双链特异性的切口酶、以及可检测的多核苷酸探针，其中每个引物/模板寡核苷酸在与所述靶核酸分子互补的序列中具有一个或更多个2’修饰的核苷酸；产生具有结合所述可检测寡核苷酸探针的靶序列的多个扩增子；并且实时检测信号，由此量化所述靶核酸分子。
[0017]仍在另一个方面，本发明提供了用于实时监测测试样品中靶核酸分子的方法，所述方法涉及:在基本上等温条件下，使靶核酸分子与以下接触:聚合酶、两种或更多种引物/模板寡核苷酸(其中每一个特异性结合所述靶核酸分子上的互补序列)、切口酶、修复酶或校正读码酶、以及可检测的多核苷酸探针，其中每个引物/模板寡核苷酸在与所述靶核酸分子互补的序列中具有一个或更多个2’修饰的核苷酸；产生具有结合所述可检测寡核苷酸探针的靶序列的多个扩增子；并且实时检测信号，由此量化所述靶核酸分子。
[0018]仍在另一个方面，本发明提供了用于检测NEAR反应中的靶序列的试剂盒，所述试剂盒包含一个或更多个引物/模板寡核苷酸，以及用于本发明的方法中的引物/模板寡核苷酸的用途的说明书，这个或这些引物/模板寡核苷酸特异性结合靶核酸分子上的互补序列并且在与所述靶核酸分子互补的序列中具有一个或更多个2’修饰的核苷酸。
[0019]在一个方面，本发明提供给了从5’至3’，具有第一区和第二区的分离的寡核苷酸，其中所述第一区具有切口酶识别序列；其中所述第二区具有特异性结合靶核酸分子上的互补序列的至少9个或更多个核苷酸(例如10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30个或更多个连续的核苷酸)；并且其中所述第二区具有一个或更多个2’修饰的核苷酸。在其他实施例中，所述分离的寡核苷酸是列出于图1中的那个。
[0020]在本文描绘的多个方面的不同实施例中，寡核苷酸(例如引物/模板寡核苷酸、分离的寡核苷酸)包含修饰的核苷酸，包括2’修饰的核苷酸。在本文描绘的任何方面的不同实施例中，2’修饰是以下中的一个或更多个:2’ -O-甲基、2'-甲氧基乙氧基、2 ' _氟代、2’-轻基、2'-稀丙基、2' -0-[2_ (甲基氨基)-2-氧代乙基]、4 '-疏基、4' -CH2-0-2'-桥、4' -(CH2)2-O^r -桥、2' _LNA、2’-烷基、以及'-0_(N-氨基甲酸甲酯)或修饰的核苷酸包含碱基类似物。在本文描绘的任何方面的不同实施例中，一个或更多个2’修饰的核苷酸定位在与靶核酸分子互补的序列的3’端(例如寡核苷酸的3’末端)或其附近。在本文描绘的任何方面的其他实施例中，一个或更多个2’修饰的核苷酸定位在与靶核酸分子互补的序列的5’端。在本文描绘的任何方面的不同实施例中，定位在与靶核酸分子互补的序列的5’端的一个或更多个2’修饰的核苷酸与切口位点隔开1、2、3、4、5或更多个未修饰的核苷酸。在本文描绘的任何方面的不同实施例中，两个或更多个2’修饰的核苷酸是连续的(2、3、4、5、或更多个)。在本文描绘的任何方面的其他实施例中，两个或更多个2’修饰的核苷酸是与未修饰的核苷酸交替的。在本文描绘的任何方面的不同实施例中，切口酶识别序列是5’ -GAGTC-3’。在本文描绘的任何方面的不同实施例中，5个连续的2’ -O-甲基修饰的核苷酸定位在与靶核酸分子互补的序列的3’端(例如寡核苷酸的3’末端)或其附近。在本文描绘的任何方面的其他实施例中，5个连续的2’ -O-甲基修饰的核苷酸定位在与靶核酸分子互补的序列的5’端。在本文描绘的任何方面的其他实施例中，与未修饰的核苷酸交替的2个或多个2’ -O-甲基修饰的核苷酸定位在与革El核酸分子互补的序列的5’端(即靶特异性区域)。
[0021]在本文描绘的任何方面的不同实施例中，检测步骤并不检测非靶分子的扩增子。在本文描绘的任何方面的不同实施例中，所述方法是实时进行的。在本文描绘的任何方面的某些实施例中，产生多个扩增子的步骤是实时进行的(例如用来确定存在于反应中的靶的量)。
[0022]在本文描绘的任何方面的不同实施例中，所述方法提供了确定在扩增前，生物样品中存在的核酸分子的量的半定量的和/或量阈值的方法。在本文描绘的任何方面的不同实施例中，将一个或更多个2’修饰的核苷酸定位为更接近在与靶核酸分子互补的序列的5’端增加了扩增的检测时间。在本文描绘的任何方面的不同实施例中，所述方法进一步涉及使用引物/模板寡核苷酸的比率，来提供由不同量的起始靶材料引起的反应产物的增加的分辨率。已经发现，增加在识别序列的3’端具有一个或更多个2’修饰的核苷酸的引物/模板寡核苷酸与在识别序列的5’端具有一个或更多个2’修饰的核苷酸的引物/模板寡核苷酸的比率收缩了信号曲线并且移位了曲线的斜率。
[0023]在本文描绘的任何方面的不同实施例中，所述方法进一步涉及使用扩增速率改性剂，来提供由于不同量的起始靶材料引起的反应产物的增加的分辨率。在本文描绘的任何方面的不同实施例中，革El核酸分子是DNA或RNA核酸分子。在本文描绘的任何方面的不同实施例中，可检测探针是SY