Pcsk9肽疫苗的制作方法
【专利说明】PCSK9肽疫苗
[0001] 本发明涉及能在体内诱导针对PCSK9的抗体形成的疫苗。
[0002] 本发明涉及新肽，其能影响蛋白质原转化酶枯草杆菌蛋白酶/Kexin 9(ProproteinConvertaseSubtilisin/KexinType9，PCSK9)_ 介导的低密度脂蛋白 (LDL)受体（LDLR)的降解。所述的肽偶联于免疫原性载体配制成用于预防和/或治疗高脂 血症，高胆固醇血症，动脉粥样硬化引起的PCSK9-相关的病症的疫苗。
[0003] 心血管疾病（CVD)是世界范围内导致死亡的主要原因之一。高脂血症，高胆固醇 血症，高血压和动脉粥样硬化之类的因素与这些疾病有关联。在流行病学综合研究中表明， 血清胆固醇水平和CVD发生之间正相关。高LDL胆固醇（LDLc)水平构成高心血管风险，并 且与升高的动脉粥样硬化风险直接相关。
[0004]LDLR，主要是肝LDLR，是从血浆中去除LDLc的主要途径。循环中的LDLc结 合于LDLR，所形成的复合物通过网格蛋白-介导的胞吞作用（clathrin-mediated endocytosis)内化。随后，LDLc被降解，而LDLR循环返回细胞表面。
[0005]PCSK9是分泌型丝氨酸蛋白酶，其与LDLR结合并促进其降解。在2003年发现了与 常染色体显性高胆固醇血症（ADH)相关的第三基因座。PCSK9的"功能获得突变"（"Gain offunctionmutations"，G0F)增强其与LDLR的相互作用，导致LDLR水平降低和明显较 高的LDLc水平。因此，G0F与高胆固醇血症以及动脉粥样硬化倾向有关。相反，"功能丧失 突变"（"Lossoffunctionmutations",L0F)导致LDLR水平升高和LDLc急剧减少，冠心 病（CHD)风险随之减小。人PCSK9主要在肝脏，肠和肾脏中表达。其作为~72kDa的蛋白 质合成出来，进行自催化切割，之后以~65kDa成熟蛋白质形式分泌。
[0006] 循环PCSK9与LDLR的EGF-A结构域特异性结合。所述的复合物通过胞吞作用内 化，而不是LDLR再循环返回细胞表面，从而，LDLR在溶酶体中降解。PCSK9-LDLR相互作用 的净效果是可用于从血浆中清除LDLc的LDLR减少，表明PCSK9作为LDLR以至于LDLc代 谢的调节物的重要性。
[0007] 若干种动物研究证实PCSK9作为LDLc水平调节物的重要功能。在小鼠中腺病毒过 表达PCSK9引起显著的循环LDLc增加。相反，与野生型动物相比，PCSK9-/-小鼠显示LDLR 水平提高了 2. 8倍，LDLc减少至~50%。G0F和L0F突变指示PCSK9在调节人LDL代谢的 重要作用，使得PCSK9成为引人关注的药物干预靶标。值得注意的是，PCSK9中L0F人杂合 体似乎是健康的并具有正常的寿命。而且，有报道称，一位具有极低LDLc(14-34mg/dl)水 平的31岁的健康非洲裔美国母亲是在PCSK9中具有两个失活突变的复合杂合体且无循环 PCSK9。
[0008] 临床前和临床试验检测出了若干种降低循环PCSK9,或抑制其与LDLR相互作用 的化合物（如单克隆抗体，反义-寡核苷酸或自催化抑制剂）。尽管PCSK9在胞内和胞外 皆作用于LDLR，靶定循环PCSK9是LDLc降低治疗学的重要途径。小鼠中的异种共生实验 (Parabiosisexperiments)以及重组蛋白质的施用已表明胞外PCSK9足以减少肝LDLR的 数量。更重要地，利用PCSK9-特异性单克隆抗体（mAbs)的人临床实验研究结果表明，靶定 PCSK9能有效且安全地减少LDLc。此外，最近成功地完成了评估靶定PCSK9安全性和效力 的若干临床实验。
[0009]W0 2012/059573A1 和W0 2011/027257A2 公开了作为疫苗的PCSK9 多肽片段。Li 等，（Rec.Pat.DNA&GeneSeq. 3(2009)，201-212)和Wierzbicki等，（Exp.Op.Invest.Drugs 21 (2012)，667-676)报道了关于抑制PCSK9用于治疗高脂血症近期发展。
[0010] 综上，PCSK9是LDLR乃至于LDLc水平的主要调节物。尽管抑制素代表胆固醇调 控的第一线干预，对于某些受试者抑制素不足以或不适合实现所述目标。而且，发现PCSK9 被抑制素上调，抵消它们的药效。因此，鉴定出另外的或替代性的控制LDLc水平的药物疗 法非常重要。预期PCSK9抑制作为单药物治疗降低血浆LDLc，而且加强抑制素或其他物质 (诸如例如纤维酸类（fibrates)或烟酸）降低胆固醇的效力。
[0011] 本发明的目的在于提供在个体中降低LDLc的手段和方法。这一目的可通过提供 被称作模拟表位的、模拟各天然序列的肽来实现。此种模拟表位能诱导特异性结合人PCSK9 的抗体，并抑制PCSK9-介导的LDLR降解。
[0012] 因此，本发明涉及疫苗，疫苗组合物，或是包含至少一种由9到25个氨基酸残基组 成的、具有氨基酸序列XAXWARXdX^^KSEQIDNo. 1)的肽的组合物，其中
[0013] 乂1是选自不带电荷的氨基酸残基的氨基酸残基，优选地选自丝氨酸，苏氨酸，缬 氨酸和丙氨酸，
[0014] &是选自不带电荷的氨基酸残基的氨基酸残基，优选地选自异亮氨酸，缬氨酸， 甘氨酸，谷胺酰胺和丙氨酸，更优选异亮氨酸，缬氨酸，谷胺酰胺和丙氨酸，
[0015] &是选自不带电荷的氨基酸残基的氨基酸残基，优选地选自脯氨酸，苏氨酸，丙 氨酸和缬氨酸，优选脯氨酸，
[0016] \是选自天冬酰胺，丝氨酸，丙氨酸，谷胺酰胺和天冬氨酸的氨基酸残基，
[0017] x5是选自亮氨酸，甘氨酸，丙氨酸，酪氨酸，天冬氨酸，苯丙氨酸和缬氨酸的氨 基酸残基，优选亮氨酸，
[0018] x6是选自亲水的带负电的氨基酸残基的氨基酸残基，优选地是选自谷氨酸和天冬 氨酸的氨基酸残基，
[0019] &是选自不带电荷的氨基酸残基的氨基酸残基，优选地选自异亮氨酸，亮氨酸， 丙氨酸和苏氨酸，
[0020] &是选自不带电荷的氨基酸残基的氨基酸残基，所述不带电荷的氨基酸残基选自 苏氨酸，亮氨酸，谷胺酰胺，丙氨酸和丝氨酸，
[0021] \是X1(lXnX12或其C-末端截短的片段，所述片段由1或2个氨基酸残基组成，
[0022] X1(l是任意氨基酸残基，优选地选自不带电荷的氨基酸残基，优选地选自脯氨酸， 丙氨酸和丝氨酸，
[0023]Xn是任意氨基酸残基，优选地选自不带电荷的氨基酸残基，优选地选自脯氨酸， 丙氨酸，缬氨酸，苏氨酸和天冬酰胺，
[0024]X12是任意氨基酸残基，优选地选自精氨酸，丙氨酸，赖氨酸，丝氨酸和亮氨酸的氨 基酸残基，
[0025]m是 0 或 1
[0026] n是0或 1，和
[0027]SEQIDNo. 1不是SIPWNLERITPPR或其C-末端截短的片段，
[0028] 其中，所述的至少一种肽与药学上可接受的载体偶联或融合。
[0029] 用本发明的肽接种个体，导致与PCSK9结合的多克隆抗体的产生。此类抗体能够 与LDLR结合竞争。结果，肝LDLR水平升高，血浆LDLc和总胆固醇降低。因此，施用本发明 的疫苗可以治疗或预防由高脂血症，高胆固醇血症，和/或动脉粥样硬化引起的疾病。
[0030] 本发明的肽被称作模拟表位。模拟表位具有不同于衍生该模拟表位的原始蛋白质 /肽序列氨基酸序列。这些模拟表位被免疫系统认作外来物，因此无需破坏自体_耐受。
[0031] 本发明的肽是具有氨基酸序列SIPWNLERITPPR(SEQIDNo. 2)且由9到25个氨基 酸残基组成，优选由9到24, 9到23, 9到22, 9到21，9到20, 9到19, 9到18, 9到17, 9到 16, 9到15, 9到14, 9到13, 9到12, 9到11，9到10或9个氨基酸残基组成，更优选由9， 10, 11，12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21，22, 23, 24 或 25 个氨基酸残基组成的PCSK9 片段 的变体（氨基酸交换和可选择的截短）。结果，意外地，在SEQIDNo. 2第4位色氨酸残基 和SEQIDNo. 2第8位精氨酸残基的修饰（例如，突变）导致形成不能充分结合PCKS9的 抗体。本发明的新肽序列（尤其是如果其与免疫原性载体偶联和/或配制成疫苗）能诱导 形成针对PCSK9的抗体，因而有益地修饰所述PCSK9-介导的LDLR降解，由此降低血浆LDLc 水平。与天然PCSK9序列，甚至与W0 2012/059573A1和W0 2011/027257A2中所公开的 那些相比，本发明所定义的肽还令人惊讶地达到降低总胆固醇水平的优异结果。在本申请 的实施例部分利用代表性的动物模型进一步说明。由此，特别优选地提供9到13个氨基酸 残基长度的SEQIDNo. 1的肽（即，其中不存在X12，且其中m= 1 ;或者其中m= 0,X1Q是 脯氨酸，丙氨酸和丝氨酸，且111是脯氨酸，丙氨酸，缬氨酸，苏氨酸和天冬酰胺，且X12 是精氨酸，丙氨酸，赖氨酸，丝氨酸和亮氨酸）。
[0032] 由于本发明涉及具有氨基酸序列SIPWNLERITPPR(SEQIDNo. 2)的PCSK9片段的 特定变体，这一原始序列及其全部C-末端截短的片段被排除于本发明的SEQ.IDNo. 1的定 义内。这清楚地表明原始序列SIPWNLERITPPR或其C-末端片段化的形式，如具有氨基酸序 列SIPWNLERITPP,SIPWNLERITP,SIPWNLERIT,或SIPWNLERI(全部通过C-末端氨基酸的缺 失衍生自SEQIDNo. 2)的肽的全部形式均被排除在根据本发明SEQIDNO. 1的肽的定义 之外。因此，还清楚表明这些C-末端截短的肽被排除作为天然肽、通过或不通过接头与底 物偶联的肽、带有接头，如化学接头或Cys-接头等的肽，尤其是假如此类肽被作为疫苗提 供当然也被排除。
[0033] 本发明的疫苗可包含至少1种，至少2种，至少3种，至少4种，至少5种或至 少10种如本申请所定义的具有氨基酸序列SEQIDNo. 1的肽。由此，所述的疫苗可能包 含本申请所公开的两种或以上的肽的组合。但是，也可能，本发明的疫苗包含一种或以上 如本申请所定义的根据SEQIDNo. 1的肽，其次还包含其他肽，如模拟表位（S卩，PCSK9片 段的突变体）或PCSK9的片段（参见例如W0 2011/027257)。尤其优选的PCSK9的片段是 SIPWNLERITPPRYRADEYQPPDGGSLVEV的片段，具体而言，SIPWNLERIT,SIPWNLERI,SIPWNLERIT PPR,SIPWNLERITPP或SIPWNLERITP。
[0034] 本发明的肽可以通过本领域公知的方法化学合成。当然，也可以利用重组的方 法生产本发明的肽。所述的肽可以在微生物，如细菌，酵母或真菌，在真核细胞，如哺乳动 物或昆虫细胞，或重组病毒载体如腺病毒，痘病毒，疱疹病毒，Simliki森林病毒，杆状 病毒，噬菌体，辛德毕斯病毒或仙台病毒中生产。适合用于生产所述肽的细菌包括大肠 杆菌（E. coli)，枯草芽孢杆菌（B. subtilis)，或能够表达此类肽的任何其他细菌。适合 于表达本发明的肽的酵母细胞包括酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae),粟酒裂殖 酵母（Schizosaccharomyces pombe),假丝酵母（Candida),巴斯德毕赤氏酵母（Pichia pastoris)或能表达肽的任何其他酵母。相应的手段和方法是本领域已知的。用于分离和 纯化重组生产的肽的方法也是本领域公知的，包括凝胶过滤，亲和层析，离子交换层析等。
[0035] 为了便于分离本发明的肽，可以制备融合肽，其中所述的肽以融合（共价连接）于 能通过亲和层析分离的异源多肽的形式翻译出来。典型的异源多肽是His-Tag (例如His6 ; 6组氨酸残基），GST-Tag(谷胱甘肽-S-转移酶）等。所述的融合多肽不仅有利于所述肽 的纯化，还可以防止所述肽在纯化步骤中降解。如果需要在融合多肽纯化后去除异源多肽，