制造4-羟基丁酸酯、1,4-丁二醇和相关化合物的微生物和方法
【专利说明】制造4-羟基丁酸酯、1，4- 丁二醇和相关化合物的微生物和 方法
[0001] 本发明申请案含有已经由EFS-Web以ASCII格式提交的序列表且其全部内容以引 用方式并入本文中。于2013年5月29日创建的所述ASCII拷贝命名为871943-228191_ SL. txt且大小为242, 819个字节。
[0002] 本申请案主张2012年6月4日申请的美国临时申请案第61/655, 429号的优先权 的权益，其全部内容以引用方式并入本文中。
[0003] 本发明大概来说涉及生物体的计算机的设计和生物体的改造，所述生物体更特定 来说为具有1，4-丁二醇、4-羟基丁酰基-CoA、4_羟基丁醛或腐胺生物合成能力的生物体。
【背景技术】
[0004]化合物4-羟基丁酸（4-羟基丁酸酯（4-hydroxybutanoate)、4-羟基丁酸酯 (4-hydroxybutyrate)、4_HB)是具有作为各种商品和特殊化学品的结构单元的工业潜力的 4_碳羧酸。特定来说，4-HB具有用作进入1，4-丁二醇化学品家族的新进入点的潜力，所述 家族包括溶剂、树脂、聚合物前体和特殊化学品。1，4_丁二醇（BD0)是聚合物中间体和工业 溶剂，全球市场为约30亿lb/年。BD0目前是从石油化学前体（主要为乙炔、马来酸酐和环 氧丙烷）产生。
[0005] 例如，使乙炔与2分子甲醛在R印pe合成反应中反应（克罗斯威克斯 (Kroschwitz)和格兰特（Grant)，化学工业技术百科全书（EncyclopediaofChem.Tech.), 约翰威利父子公司（JohnWileyandSons,Inc.)，纽约（1999))，之后进行催化氢化以形成 1，4_ 丁二醇。据估计，美国生产的乙炔90%用于生产丁二醇。或者，其可通过源自丁烷的 马来酸酐的酯化和催化氢化来形成。在下游，可进一步转化丁二醇；例如，通过氧化转化成 Y- 丁内酯，Y- 丁内酯可进一步转变为吡咯烷酮和N-甲基-吡咯烷酮，或者通过氢解而转 变为四氢呋喃。所述化合物具有作为聚合物中间体、溶剂和添加剂的各种应用，并且总市场 近20亿lb/年。需要研发通过替代手段产生所述化学品的方法，所述替代手段不仅代替用 于基于石油的原料的可再生品，并且还使用能量和资本较不密集的工艺。
[0006] 因此，相关技艺需要用于有效地产生商业量的1，4_ 丁二醇和其化学前体的替代 手段。本发明满足这种需要且还提供相关优点。
【发明内容】
[0007] 本发明提供具有4-羟基丁酸酯、1，4- 丁二醇或其它产物途径且能够产生4-羟基 丁酸酯、1，4-丁二醇或其它产物的非天然微生物，其中所述微生物包含一或多种遗传修饰。 本发明另外提供使用所述微生物产生4-羟基丁酸酯、1，4_ 丁二醇或其它产物或相关产物 的方法。
【附图说明】
[0008]图1是显示产生4-羟基丁酸酯（4-HB)和1，4_ 丁二醇的生物化学途径的示意图。 前5个步骤是大肠杆菌（E.coli)的内源性步骤，而其余步骤可异源表达。催化生物合成反 应的酶是：（1)琥珀酰基-CoA合成酶；（2)非CoA依赖性琥珀酸半醛脱氢酶；（3)a-酮戊 二酸脱氢酶；(4)谷氨酸：琥珀酸半醛转氨酶；（5)谷氨酸脱羧酶；(6)CoA依赖性琥珀酸半 醛脱氢酶；（7) 4-羟基丁酸脱氢酶；（8)a-酮戊二酸脱羧酶；（9) 4-羟基丁酰基CoA:乙酰 基-CoA转移酶；（10) 丁酸激酶；（11)磷酸转丁酰基酶；（12)醛脱氢酶；（13)醇脱氢酶。
[0009] 图2是显示大肠杆菌中的高丝氨酸生物合成的示意图。
[0010] 图3显示使用具有表达4-HB途径基因的各种组合的质粒的大肠杆菌菌株在葡 萄糖最低培养基中产生4-HB。（a)培养液中的4-HB浓度；(b)培养液中的琥珀酸酯浓 度；（c)在600nm下测量的培养物0D。条形簇代表24小时、48小时和72小时（如果测 量）时间点。沿x轴的代码指示所用菌株/质粒组合。第一索引是指宿主菌株：1，MG1655 lacIQ;2，MG1655AgabDlacIQ;3，MG1655AgabDAaldAlacIQ。第二索引是指所用 质粒组合：1，PZE13-0004-0035 与pZA33-0036 ;2,pZE13-0004-0035 与pZA33-0010n;3， PZE13-0004-0008 与pZA33-0036 ;4,pZE13-0004-0008 与pZA33-0010n;5,对照载体pZE13 与pZA33。
[0011] 图4显示在表达来自结核分枝杆菌（Mycobacteriumtuberculosis)的a-酮戊二 酸脱羧酶的大肠杆菌菌株中从葡萄糖产生4-HB。菌株1-3含有pZE13-0032和pZA33-0036。 菌株4仅表达空载体pZE13和pZA33。宿主菌株如下：1和4，MG1655lacIQ;2，MG1655AgabD lacIQ;3，MG1655AgabDAaldAlacIQ。条形是指在24小时和48小时的浓度。
[0012] 图5显示在重组大肠杆菌菌株中从10mM4-HB产生BD0。编号位置对应于使 用MG1655lacIQ的实验，其含有表达来自牙龈卟啉单胞菌（P.gingivalis)的cat2的 PZA33-0024 和在pZE13 上表达的以下基因：1，无（对照）；2,0002 ;3,0003 ;4,0003n;5， 0011 ;6,0013 ;7,0023 ;8,0025 ;9,0008n;10,0035。基因编号定义于表6中。对于各位置来 说，条形分别是指好氧性条件、微好氧性条件和厌氧性条件。微好氧性条件是通过密封培养 管但不将其抽空来产生。
[0013] 图6显示由在补加有4g/L未经标记葡萄糖（a、c、e和g)、均匀标记13c-葡 萄糖（b、d、f和h)的M9 最低培养基中生长的MG1655lacIQpZE13-0004-0035-0002p ZA33-0034-0036产生的4-HB和BD0的质谱图。（a)和（b)，衍生化BD0的质量116特征片 段，其含有2个碳原子；（c)和（d)，衍生化BD0的质量177特征片段，其含有1个碳原子； (e)和（f)，衍生化4-HB的质量117特征片段，其含有2个碳原子；(g)和（h)，衍生化4-HB 的质量233特征片段，其含有4个碳原子。
[0014] 图7是用于产生丁内酯的生物工艺的示意性工艺流程图。图（a)图解说明利 用分批分离的分批补料发酵且图（b)图解说明利用连续分离的分批补料发酵。
[0015] 图8A和8B显示实例性1，4_ 丁二醇（BD0)途径。图8A显示始于琥珀酰基-CoA 的BD0途径。图8B显示始于a-酮戊二酸酯的BD0途径。
[0016] 图9A-9C显不实例性BD0途径。图9A和9B显不始于4-氣基丁酸醋的途径。图 9C显示从乙酰乙酰基-CoA到4-氨基丁酸酯的途径。
[0017] 图10显示始于a-酮戊二酸酯的实例性BD0途径。
[0018] 图11显示始于谷氨酸酯的实例性BD0途径。
[0019] 图12显示始于乙酰乙酰基-CoA的实例性BD0途径。
[0020] 图13显示始于高丝氨酸的实例性BD0途径。
[0021] 图14显示大肠杆菌琥珀酰基-CoA合成酶的核苷酸和氨基酸序列。图14A显示大 肠杆菌sucCD操纵子的核苷酸序列（SEQIDN0:46)。图14B(SEQIDN0:47)和14C(SEQ IDNO:48)显示由sue⑶操纵子编码的琥珀酰基-CoA合成酶亚单元的氨基酸序列。
[0022] 图15显示牛分枝杆菌（Mycobacteriumbovis)a-酮戊二酸脱羧酶的核苷酸和氨 基酸序列。图15A显示牛分枝杆菌sucA基因的核苷酸序列（SEQIDN0:49)。图15B显示 牛分枝杆菌a-酮戊二酸脱羧酶的氨基酸序列（SEQIDN0 :50)。
[0023] 图16显示大肠杆菌在厌氧性（微好氧性）条件下在最低培养基中经由a-酮 戊二酸酯从葡萄糖生物合成4-羟基丁酸酯。宿主菌株是ECKh-401。实验基于存在 于质粒pZA33上的如下上游途径基因来标记：1) 4hbd_sucA;2)sucO)-sucD-4hbd;3) sucCD-sucD-4hbd_sucA。
[0024] 图17显示大肠杆菌在最低培养基中经由琥珀酸酯和a_酮戊二酸酯从葡萄糖生 物合成4-羟基丁酸酯。宿主菌株是野生型MG1655。实验基于存在于质粒pZE13和pZA33上 的如下基因来标记：1)空对照载体；2)空pZE13、pZA33-4hbd;3)pZE13-sucA、pZA33-4hbd。
[0025] 图18A显示来自牙龈卟啉单胞菌的CoA依赖性琥珀酸半醛脱氢酶（sueD)的核苷 酸序列（SEQIDN0:51)，并且图18B显示所编码氨基酸序列（SEQIDN0:52)。
[0026] 图19A显示来自牙龈卟啉单胞菌的4-羟基丁酸脱氢酶（4hbd)的核苷酸序列（SEQ IDNO: 53)，并且图19B显示所编码氨基酸序列（SEQIDNO: 54)。
[0027] 图20A显示来自牙龈卟啉单胞菌的4-羟基丁酸CoA转移酶（cat2)的核苷酸序列 (SEQIDN0 :55)，并且图20B显示所编码氨基酸序列（SEQIDN0 :56)。
[0028] 图21A显不来自丙酮丁醇梭菌（Clostridiumacetobutylicum)的憐酸转丁醜基 酶（ptb)的核苷酸序列（SEQIDN0:57)，并且图21B显示所编码氨基酸序列（SEQIDN0: 58)。
[0029]图22A显示来自丙酮丁醇梭菌的丁酸激酶（bukl)的核苷酸序列（SEQIDNO:59)， 并且图22B显示所编码氨基酸序列（SEQIDNO:60)。
[0030] 图23显示丙酮丁醇梭菌020 (磷酸转丁酰基酶）的替代核苷酸序列，其相对于丙 酮丁醇梭菌天然序列将密码子改变为更常见的大肠杆菌密码子。图23A-23D(020A-020D，分 别为SEQIDN0 :61-64)所含序列中经更常见密码子置换的罕见大肠杆菌密码子的数目递 增（A<B<C<D)。
[0031] 图24显示丙酮丁醇梭菌021 ( 丁酸激酶）的替代核苷酸序列，其相对于丙酮丁醇 梭菌天然序列将密码子改变为更常见的大肠杆菌密码子。图24A-24D(021A-021B，分别为 SEQIDN0 :65-68)所含序列中经更常见密码子置换的罕见大肠杆菌密码子的数目递增（A <B<C<D)。
[0032] 图25显示丁酸激酶（BK)和磷酸转丁酰基酶（PTB)的经改良表达，其密码子经优 化以供在大肠杆菌中表达。图25A显示用考马斯蓝（Coomassieblue)对蛋白质染色的十二 烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE);泳道1，无插入的对照载体；泳道2,丙酮丁醇 梭菌天然序列在大肠杆菌中的表达；泳道3,020B-021B密码子优化PTB-BK的表达；泳道4， 020C-021C密码子优化PTB-BK的表达。显示BK和PTB的位置。图25B显示天然丙酮丁醇 梭菌序列（2021n)相较于密码子优化020B-021B(2021B)和020C-021C(2021C)的BK和PTB 活性。
[0033] 图26显示BD0和丁内酯（GBL)在以下各种表达BD0产生酶的菌株中的产生： Cat2(034) ;2021n;2021B;2021C。
[0034]图 27A显不天然拜氏梭菌（Clostridiumbeijerinckii)aid基因（025n)的核苷 酸序列（SEQIDNO:69)，并且图27B显示所编码氨基酸序列（SEQIDNO:70)。
[0035] 图28A-28D显示拜氏梭菌aid基因的替代基因序列（025A-025D，分别为SEQID NO:71-74)，其中经更常见密码子置换的罕见密码子的数目递增（A<B<C<D)。
[0036] 图29显示天然拜氏梭菌aid基因和密码子优化变体的表达：无插入（无插入对 照）、025n、025A、025B、025C、025D。
[0037] 图30显示不同菌株中的BD0或BD0和乙醇产生。图30显示含有天然拜氏梭菌aid 基因（025n)的菌株或密码子经优化以供在大肠杆菌中表达的变体（025A-02OT)中的BD0 产生。图30B显示相较于密码子优化变体025B表达丙酮丁醇梭菌AdhE2酶（002C)的菌株 中的乙醇和BD0产生。第三组显示牙龈卟啉单胞菌sucD(035)的表达。在所有情况下，还 表达牙龈卟啉单胞菌Cat2 (034)。
[0038] 图31A显示来自热葡糖苷酶地芽胞杆菌（Geobacillusthermoglucosidasius)的 adhl基因的核苷酸序列（SEQIDNO:75)，并且图31B显示所编码氨基酸序列（SEQIDNO: 76)。
[0039] 图32A显示热葡糖苷酶地芽胞杆菌adhl基因在大肠杆菌中的表达。通过 SDS-PAGE分析全部细胞溶解物或上清液并用考马斯蓝对无插入质粒、具有083 (头状地霉 (Geotrichumcapitatum)N-苯甲基-3-批咯烧醇脱氢酶）插入的质粒和具有084 (热葡糖 苷酶地芽胞杆菌adhl)插入的质粒染色。图32B显示具有丁醛（菱形）或4-羟基丁醛（正 方形）作为底物的084的活性。
[0040]图33显示BD0在不同菌株中的产生：无插入质粒；025B ;025B-026n ;025B-026A ; 025B-026B；025B-〇26C；025B-050；025B-〇52；025B-〇53；025B-〇55；025B-〇57；025B-〇58； 025B-071 ;025B-083 ;025B-084 ;PTSlac〇-〇25B ;PTSlac〇-〇25B-〇26n。
[0041] 图34显示载体pRE118-V2的质粒图谱。
[0042] 图35显示涵盖aceF和lpdA基因的ECKh-138区的序列（SEQIDNO:77)。肺炎 克雷伯氏菌（K.pneumonia)lpdA基因加下划线，并且Glu354Lys突变体中改变的密码子带 阴影。
[0043] 图36显示天然大肠杆菌lpdA(SEQIDN0 :78)与突变肺炎克雷伯氏菌lpdA(SEQ IDNO:79)的蛋白质序列比较。
[0044] 图37显示菌株AB3、MG1655AldhA和ECKh-138中的4-羟基丁酸酯（左条形） 和BD0(右条形）产生。所有菌株都表达中等拷贝质粒pZA33上的大肠杆菌sucCD、牙龈卟 啉单胞菌sucD、牙龈卟啉单胞菌4hbd和高拷贝质粒pZE13上的牙龈卟啉单胞菌Cat2、丙酮 丁醇梭菌AdhE2。
[0045] 图38显示融合到pflB_p6启动子和核糖体结合位点（RBS)的aceE基因的5'末 端的核苷酸序列（S