烯酰基-CoA转移酶、4-羟基丁-2-烯酰基-CoA水解酶、4-羟基丁-2-烯 酰基-CoA连接酶；4-羟基丁-2-烯酰基-CoA还原酶。或者，外源性核酸可编码高丝氨酸 CoA转移酶、高丝氨酸-CoA水解酶或高丝氨酸-CoA连接酶；高丝氨酸-CoA脱氨酶；和4-羟 基丁-2-烯酰基-CoA还原酶。在又一实施例中，外源性核酸可编码高丝氨酸脱氨酶；4-羟 基丁-2-烯酸酯还原酶；和4-羟基丁酰基-CoA转移酶、4-羟基丁酰基-CoA水解酶或4-羟 基丁酰基-CoA连接酶。或者，外源性核酸可编码高丝氨酸CoA转移酶、高丝氨酸-CoA水解 酶或高丝氨酸-CoA连接酶；高丝氨酸-CoA脱氨酶；和4-羟基丁-2-烯酰基-CoA还原酶。
[0154] 本文进一步揭示非天然微生物，包含具有BD0途径的微生物，所述BD0途径包含至 少一种编码BD0途径酶的外源性核酸，所述外源性核酸以足以产生B0D的量来表达，所述 BD0途径包含琥珀酰基-CoA还原酶（形成醇）、4_羟基丁酰基-CoA水解酶、4-羟基丁酰 基-CoA连接酶、4-羟基丁醛脱氢酶（磷酸化）（参见表15)。所述途径可进一步包含琥珀 酰基-CoA还原酶、4-羟基丁酸脱氢酶、4-羟基丁酰基-CoA转移酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸 转-4-羟基丁酰基酶、4-羟基丁酰基-CoA还原酶、4-羟基丁酰基-CoA还原酶（形成醇） 或1，4_丁二醇脱氢酶。
[0155] 本文另外揭示非天然微生物，包含具有BD0途径的微生物，所述BD0途径包含至少 一种编码BDO途径酶的外源性核酸，所述外源性核酸以足以产生BDO的量来表达，所述BDO途径包含谷氨酸脱氢酶、4-氨基丁酸酯氧化还原酶（脱氨）、4_氨基丁酸转氨酶、谷氨酸 脱羧酶、4-羟基丁酰基-CoA水解酶、4-羟基丁酰基-CoA连接酶、4-羟基丁醛脱氢酶（磷 酸化）（参见表16)。所述BD0途径可进一步包含a-酮戊二酸脱羧酶、4-羟基丁酸脱氢 酶、4-羟基丁酰基-CoA转移酶、4-羟基丁酸激酶、磷酸转-4-羟基丁酰基酶、4-羟基丁酰 基-CoA还原酶、4-羟基丁酰基-CoA还原酶（形成醇）或1，4- 丁二醇脱氢酶。
[0156] 上述途径仅具有实例性。所属领域技术人员可视需要容易地从那些本文所揭示的 途径选择合适途径来获得适宜BD0途径或其它代谢途径。
[0157] 本发明提供经遗传修饰的生物体，其通过增加产物或减少不需要的副产物来允许 诸如BD0等所需产物的改良产生。如本文所揭示，本发明提供非天然微生物，包含具有1， 4_丁二醇（BD0)途径的微生物，所述途径包含至少一种编码BD0途径酶的外源性核酸，所述 外源性核酸以足以产生BD0的量来表达。在一个实施例中，微生物经遗传修饰以表达外源 性琥珀酰基-CoA合成酶（参见实例XII)。例如，琥珀酰基-CoA合成酶可由大肠杆菌sucCD 基因编码。
[0158] 在另一实施例中，微生物经遗传修饰以表达外源性a-酮戊二酸脱羧酶（参见实 例XIII)。例如，a-酮戊二酸脱羧酶可由牛分枝杆菌sucA基因编码。在又一实施例中， 微生物经遗传修饰以表达外源性琥珀酸半醛脱氢酶和4-羟基丁酸脱氢酶和任选地4-羟基 丁酰基-CoA/乙酰基-CoA转移酶（参见实例XIII)。例如，琥珀酸半醛脱氢酶（CoA依赖 性）、4_羟基丁酸脱氢酶和4-羟基丁酰基-CoA/乙酰基-CoA转移酶可由牙龈卟啉单胞菌 W83基因编码。在另一实施例中，微生物经遗传修饰以表达外源性丁酸激酶和磷酸转丁酰基 酶（参见实例XIII)。例如，丁酸激酶和磷酸转丁酰基酶可由丙酮丁醇梭菌bukl和ptb基 因编码。
[0159] 在另一实施例中，微生物经遗传修饰以表达外源性4-羟基丁酰基-CoA还原酶 (参见实例XIII)。例如，4-羟基丁酰基-CoA还原酶可由拜氏梭菌aid基因编码。另外，在 本发明实施例中，微生物经遗传修饰以表达外源性4-羟基丁醛还原酶（参见实例XIII)。例 如，4-羟基丁醛还原酶可由热葡糖苷酶地芽孢杆菌adhl基因编码。在另一实施例中，微生 物经遗传修饰以表达外源性丙酮酸脱氢酶亚单元（参见实例XIV)。例如，外源性丙酮酸脱 氢酶可对NADH不敏感。丙酮酸脱氢酶亚单元可由肺炎克雷伯氏菌lpdA基因编码。在一特 定实施例中，微生物的丙酮酸脱氢酶亚单元基因可在丙酮酸甲酸裂解酶启动子的控制下。
[0160] 在又一实施例中，微生物经遗传修饰以破坏编码好氧性呼吸控制调节系统的基因 (参见实例XV)。例如，破坏可针对arcA基因。所述生物体可进一步包含破坏编码苹果酸脱 氢酶的基因。在又一实施例中，微生物经遗传修饰以表达对NADH不敏感的外源性柠檬酸合 成酶（参见实例XV)。例如，对NADH不敏感的柠檬酸合成酶可由gltA(例如gltA的R163L 突变体）编码。在又一实施例中，微生物经遗传修饰以表达外源性磷酸烯醇丙酮酸酯羧基 激酶（参见实例XVI)。例如，磷酸烯醇丙酮酸酯羧基激酶可由流感嗜血杆菌磷酸烯醇丙酮 酸酯羧基激酶基因编码。
[0161] 在另一实施例中，本发明提供具有4-羟基丁酸酯途径且能够产生4-羟基丁酸酯 的非天然微生物，其中所述微生物包含增加磷酸烯醇丙酮酸羧化酶表达的遗传修饰（参见 实例XXXI)。在增加磷酸烯醇丙酮酸酯表达的实施例中，微生物可相对于不存在遗传修饰的 亲本微生物展现乙醇、乙酸酯、丙酮酸酯或丙氨酸或其组合的产生减少。如本文所揭示，磷 酸烯醇丙酮酸酯（PEP)羧化酶的过表达导致较多磷酸烯醇丙酮酸酯转变为草酰乙酸酯，由 此减少从PEP到丙酮酸酯中且随后到乙酰基-CoA中的通量（实例XXXI)。减少从PEP到丙 酮酸酯和乙酰基-CoA的通量增加到TCA循环和随后4HB或BD0途径中的通量。
[0162] 在另一实施例中，本发明提供具有4-羟基丁酸酯途径且能够产生4-羟基丁酸酯 的非天然微生物，其中所述微生物包含增加a-酮戊二酸脱氢酶表达的遗传修饰（参见实 例XXXII)。相对于不存在遗传修饰的亲本微生物，a-酮戊二酸脱氢酶的表达增加可导致 谷氨酸酯的产生减少。所述微生物相对于不存在遗传修饰的亲本微生物还可展现乙醇、乙 酸酯、丙酮酸酯或丙氨酸或其组合的产生减少。如本文所揭示，谷氨酸酯的形成可导致碳损 失和产率降低。因此，a-酮戊二酸脱氢酶的表达增加可减少谷氨酸酯以及其它副产物，例 如乙醇、乙酸酯、丙氨酸和/或丙酮酸酯。
[0163] 在又一实施例中，本发明提供具有4-羟基丁酸酯途径且能够产生4-羟基丁酸酯 的非天然微生物，其中所述微生物包含增加非磷酸转移酶（PTS)葡萄糖吸收系统表达的遗 传修饰（参见实例XXXIII)。在所述实施例中，遗传修饰可包含增加通透酶、葡萄糖激酶或 葡萄糖促进剂（glucosefacilitator)或其组合的表达。另外，所述微生物相对于不存在 遗传修饰的亲本微生物可展现乙醇、乙酸酯、丙酮酸酯或丙氨酸或其组合的产生减少。非 PTS蔗糖吸收系统的引入先前已描述于美国公开案2011/0045575中，其作为一种方式用以 在利用蔗糖作为碳源的微生物中减少丙酮酸酯形成。相比之下，利用如本文所述非PTS葡 萄糖吸收系统旨在于可用草酰乙酸酯之间提供相较于乙酰基-CoA更优选的平衡（参见实 例XXXIII)。
[0164] 在另一实施例中，本发明提供具有4-羟基丁酸酯途径且能够产生4-羟基丁酸酯 的非天然微生物，其中所述微生物包含增加丁内酯酯酶表达的遗传修饰（实例XXXIV)。 所述微生物相对于不存在遗传修饰的亲本微生物可展现丁内酯的产生减少。如本文所 揭示，丁内酯是在糖到1，4_丁二醇发酵期间形成的副产物。丁内酯可从不稳定途径 中间体4-羟基丁酰基-CoA以及4-羟基丁酸酯的自发内酯化形成。如本文所揭示，丁 内酯的表达可加速丁内酯水解成BD0,由此改良BD0产物产率并消除副产物（参见实例 XXXIV) 。
[0165] 在本文所揭示的其它实施例中，遗传修饰可包括基因破坏或缺失以减少酶的表 达。例如，在又一实施例中，本发明提供具有4-羟基丁酸酯途径且能够产生4-羟基丁酸 酯的非天然微生物，其中所述微生物包含减少琥珀酰基-CoA合成酶表达的遗传修饰（实 例XXXV)。在所述实施例中，微生物相对于不存在遗传修饰的亲本微生物可展现4-羟基 丁酸酯的产生增加。如本文所述，经过TCA循环的重复轮通量导致碳作为C02损失。琥珀 酰基-CoA合成酶缺失阻断琥珀酰基-CoA下游的TCA循环，由此减少C02损失（参见实例 XXXV) 。
[0166] 在又一实施例中，本发明提供具有4-羟基丁酸酯途径且能够产生4-羟基丁酸酯 的非天然微生物，其中所述微生物包含降低酰基辅酶A硫酯酶表达的遗传修饰（参见实例 XXXVI) 。在所述实施例中，微生物相对于不存在遗传修饰的亲本微生物可展现丁内酯 的产生减少。在另一实施例中，所述微生物可包含至少两种降低至少两种酰基辅酶A硫酯 酶表达的遗传修饰。如本文所揭示，BD0途径中间体4-羟基丁酰基-CoA自发地且以酶促 方式环化以形成丁内酯（GBL)。通过缺失酰基辅酶-A硫酯酶，减少副产物GBL的形成 (参见实例XXXVI)。
[0167] 在另一实施例中，本发明提供具有4-羟基丁酸酯途径且能够产生4-羟基丁酸酯 的非天然微生物，其中所述微生物包含降低醇脱氢酶表达的遗传修饰（参见实例XXXVII)。 在所述实施例中，微生物相对于不存在所述遗传修饰的亲本微生物可展现来自4-羟基丁 酸酯途径的下游产物的回流减少。在高效价BD0(来自4-羟基丁酸酯的下游产物）下，高浓 度产物可导致途径内或经由副反应的回流，由此导致产物产率降低和/或诸如醛等毒性副 产物形成增加。如本文所述，发现若干内源性醇脱氢酶促成回流，而缺失一或多种内源性醇 脱氢酶减少回流，但不会减少4-羟基丁酸酯或BD0的产生，并且实际上增加BD0形成（参 见实例XXXVII)。
[0168] 在又一实施例中，本发明提供具有4-羟基丁酸酯途径且能够产生4-羟基丁酸酯 的非天然微生物，其中所述微生物包含降低非产能NADH脱氢酶表达的遗传修饰（参见实例 XXXVIII) 。非产能NADH脱氢酶的表达降低抑制由非产能NADH脱氢酶的活性所致NADH库的 消耗。另外，微生物相对于不存在遗传修饰的亲本微生物展现微生物的能量效率增加。如 本文所述，电子传递链具有将质子转位的能力不同的多种NADH脱氢酶和细胞色素氧化酶。 一些NADH脱氢酶消耗NADH而不将所述消耗与质子转位和能量产生关联，并且将所述NADH 脱氢酶视为非产能NADH脱氢酶。一个实例性非产能NADH脱氢酶是大肠杆菌的NADHII(参 见实例XXXVIII)。编码具有非产能NAD(P)H脱氢酶活性的酶的其它基因包括wrbA、yieF和 kefF。所属领域技术人员将容易地理解，非产能NADH脱氢酶的含义为不将NADH氧化与电 子传递和质子转位以及ATP形成偶合者。通过降低非产能NADH脱氢酶的表达，抑制细胞内 NADH库的消耗，由此使细胞更能量有效和/或允许NADH以所需合成途径利用。
[0169] 在又一实施例中，本发明提供具有4-羟基丁酸酯途径且能够产生4-羟基丁酸酯 的非天然微生物，其中所述微生物包含降低细胞色素氧化酶表达的遗传修饰（参见实例 XXXIX) 。在所述实施例中，微生物相对于不存在遗传修饰的亲本微生物可展现能量效率增 加。如本文所揭示，参与电子传递链的细胞色素氧化酶具有不同的节能效率。通过降低一 或多种细胞色素氧化酶的表达，可增加细胞的能量效率（参见实例XXXIX)。即使在某些条 件下来观察到产物产率增加的情况下（参见实例XXXIX)，所述遗传修饰仍可有利地提供对 一系列氧浓度范围的较大耐受性，特定来说在大型发酵器中更有效地产生产物，其中所述 发酵器内的可用氧有所变化。通过改良微生物的能量效率，生物体可耐受较低氧条件，这是 因为降低对来自电子传递链的能量产生的需要。因此，在本发明的特定实施例中，微生物相 对于不存在所述遗传修饰的亲本微生物可展现对一系列氧浓度范围的耐受性增加。
[0170] 因此，本发明提供具有4-羟基丁酸酯途径且能够产生4-羟基丁酸酯的非天然微 生物，其中所述微生物包含遗传修饰，所述遗传修饰选自：(A)增加磷酸烯醇丙酮酸羧化酶 表达的遗传修饰；(B)增加a_酮戊二酸脱氢酶表达的遗传修饰；(C)增加非磷酸转移酶 (PTS)葡萄糖吸收系统表达的遗传修饰；(D)增加丁内酯酯酶表达的遗传修饰；(E)降 低琥珀酰基-CoA合成酶表达的遗传修饰；(F)降低酰基辅酶A硫酯酶表达的遗传修饰；(G) 降低醇脱氢酶表达的遗传修饰；(H)降低非产能NADH脱氢酶表达的遗传修饰；（I)降低细 胞色素氧化酶表达的遗传修饰；和（J)以下的组合：(A)-(I)项的遗传修饰中的两种或更 多种，例如，三种或更多种、四种或更多种、五种或更多种、六种或更多种、七种或更多种、八 种或更多种或全部九种。在其它特定实施例中，（K) (A)、（B)或（C)项的微生物相对于不 存在所述遗传修饰的亲本微生物，乙醇、乙酸酯、丙酮酸酯或丙氨酸或其组合的产生减少； (L) (B)项的微生物相对于不存在所述遗传修饰的亲本微生物，谷氨酸酯的产生减少；(M) (C)项的微生物具有包含通透酶、葡萄糖激酶或葡萄糖促进剂或其组合的表达增加的遗传 修饰；(N) (D)项的微生物相对于不存在所述遗传修饰的亲本微生物，丁内酯的产生减 少；(〇) (E)项的微生物相对于不存在所述遗传修饰的亲本微生物，4-羟基丁酸酯的产生增 加； (P) (F)项的微生物相对于不存在所述遗传修饰的亲本微生物，丁内酯的产生减少； (Q) (F)项的微生物具有包含至少两种降低至少两种酰基辅酶A硫酯酶表达的遗传修饰的 遗传修饰；(R) (G)项的微生物相对于不存在所述遗传修饰的亲本微生物，从4-羟基丁酸酯 途径的下游产物的回流减少；（S) (H)项的微生物相对于不存在所述遗传修饰的亲本微生 物，NADH库消耗受到抑制或微生物中的能量效率增加或其组合；(T) (I)项的微生物相对于 不存在所述遗传修饰的亲本微生物，能量效率增加；或（U) (I)项的微生物相对于不存在所 述遗传修饰的亲本微生物，一系列氧浓度范围的耐受性增加。在又一实施例中，本发明提供 微生物，其中（D)或（F)项的微生物进一步包含4-羟基丁酰基-CoA途径。本发明进一步 提供利用所述微生物产生4-羟基丁酸酯的方法。应理解，所述遗传修饰包括（但不限于） 实例XXIV-XXXIX中所述的具体描述的基因添加和破坏。应理解，本文所述遗传修饰可视需 要单独使用或与其它遗传修饰、尤其那些本文所揭示者组合使用，以提供产生菌株的所需 特性。在基因破坏的情况下，应理解，所述破坏涉及破坏编码要降低活性的相应基因产物的 内源性基因。
[0171] 尽管上文刚刚描述的途径涉及4-HB途径，但应理解，如本文所揭示，4-HB是诸如 1，4- 丁二醇（BD0)等下游产物的前体。此外，如本文所揭示，具有4-HB途径的微生物可视 需要进一步包括将4-HB转变为诸如BD0等下游产物的酶。另外，即使还揭示途径中的其它 步骤，本文所述产生4-HB的任一途径仍应理解为提供4-HB途径，这是因为所述途径产生 4-HB。因此，本发明提供包含4-HB途径或BD0途径的微生物以及使用所述生物体产生4-HB 和/或BD0的方法，其中所述生物体包含本文所揭示的一或多种遗传修饰且产生4-HB、 4-HB-