EQIDN0 :80)。5'斜体序列显示在与pdh操纵子相反的方向上转录的 aroP基因的起点。3'斜体序列显示aceE基因的起点。大写体：pflBRBS。加下划线：FNR 结合位点。粗体：pflB-p6启动子序列。
[0046] 图39显示菌株ECKh-456中aceF-lpdA区的核苷酸序列（SEQIDNO:81)。
[0047] 图40显示菌株ECKh-439、ECKh-455和ECKh-456中的每一者的4-羟基丁酸酯、 BD0和丙酮酸酯的产生（分别为从左到右的条形）。
[0048] 图41A显示用于缺失mdh基因的重组位点的示意图。图41B显示氯霉素 (chloramphenicol)抗性基因（CAT)的扩增的PCR产物的核苷酸序列（SEQIDN0 :82)和所 编码氨基酸序列（SEQIDN0 :83)，所述抗性基因侧接来自质粒pKD3的mdh基因的FRT位 点和同源区。
[0049] 图42显示菌株ECKh-401中arcA缺失区的序列（SEQIDN0:84)。
[0050] 图43显示涵盖菌株ECKh-422的突变gltA基因的区域的序列（SEQIDN0:85)。
[0051] 图44显示野生型gltA基因产物和R163L突变体的柠檬酸合成酶活性。在0.4mM NADH不存在（菱形）或存在（正方形）下进行分析。
[0052] 图45显示菌株ECKh-401和ECKh-422中的4-羟基丁酸酯（左条形）和BD0 (右 条形）产生，所述两个菌株都在质粒上表达完整BD0途径的基因。
[0053] 图46显示来自代谢标记实验的中心代谢通量和相关95%信赖区间。各值是正规 化成lmmol/hr的葡萄糖吸收速率的摩尔通量。结果指示，碳通量在氧化方向上途经柠檬酸 合成酶，并且多数碳进入BD0途径，而非完成TCA循环。
[0054] 图47显示菌株ECKh-138和ECKh-422的细胞外产物形成，所述两个菌株都在质粒 上表达整个BD0途径。所测量产物是乙酸酯（Ace)、丙酮酸酯（Pyr)、4-羟基丁酸酯（4HB)、 1，4_ 丁二醇（BD0)、乙醇（EtOH)和其它产物，其包括丁内酯（GBL)、琥珀酸酯和乳酸酯。
[0055] 图48显示由流感嗜血杆菌（H.influenzae)磷酸烯醇丙酮酸酯羧基激酶（pepck) 置换PEP羧化酶（ppc)后的所述区的序列（SEQIDNO:86)。p印ck编码区加下划线。
[0056] 图49显示含有50mM NaHC03的最低培养基中生长的进化p印CK菌株的生长。
[0057] 图50显示在质粒pZS*13上表达牙龈卟啉单胞菌Cat2和拜氏梭菌Aid的菌株 ECKh-453中的产物形成。所测量产物是1，4_ 丁二醇（BD0)、丙酮酸酯、4-羟基丁酸酯 (4HB)、乙酸酯、丁内酯（GBL)和乙醇。
[0058] 图51显示两个菌株ECKh-453和ECKh-432的BD0产生。两者都含有表达牙龈卟 啉单胞菌Cat2和拜氏梭菌Aid的质粒pZS*13。使培养物在微好氧性条件下生长，其中用 27或18号针刺穿容器，如所指示。
[0059] 图52显示菌株ECKh-426的基因组DNA在插入含有启动子、sue⑶基因、sucD基 因、4hbd基因和终止子序列的多顺反子DNA片段的区中的核苷酸序列（SEQIDN0:87)。
[0060] 图53显示菌株ECKh-432的染色体区在插入含有启动子、sucA基因、克氏羧菌 (C.kluyveri)4hbd基因和终止子序列的多顺反子序列的区中的核苷酸序列（SEQIDN0: 88)。
[0061] 图54显示在最低培养基中在ECKh-432菌株中从葡萄糖合成BD0,所述菌株具有整 合到染色体中的编码上游BD0途径的基因且含有具有下游BD0途径基因的质粒。
[0062] 图55显示含有侧接与rrnC区同源的区的非磷酸转移酶（非PTS)蔗糖利用基因 的PCR产物（SEQIDN0 :89)。
[0063] 图56显示rrnC操纵子中的整合位点的示意图。
[0064] 图57显示在葡萄糖上生长的菌株ECKh-432和蔗糖上生长的菌株ECKh-463生长 48小时后正规化成培养物0D600的平均产物浓度。两者都含有表达牙龈卟啉单胞菌Cat2和 拜氏梭菌Aid的质粒pZS*13。数据涉及各菌株的6个相同培养物。所测量产物是1，4_ 丁 二醇（BD0)、4-羟基丁酸酯（4HB)、丁内酯（GBL)、丙酮酸酯（PYR)和乙酸酯（ACE)(分 别为从左到右的条形）。
[0065] 图58显示从琥珀酰基-CoA和a-酮戊二酸酯产生1，4- 丁二醇的实例性途径。 缩写：A)琥珀酰基-CoA还原酶（形成醛），B)a-酮戊二酸脱羧酶，C) 4-羟基丁酸脱氢酶， D) 4-羟基丁酸还原酶，E) 1，4- 丁二醇脱氢酶。
[0066] 图59A显示来自伊文思奴卡菌（Nocardiaiowensis)的羧酸还原酶（GNM_720)的 核苷酸序列（SEQIDN0 :90)，并且图59B显示所编码氨基酸序列（SEQIDN0 :91)。
[0067]图60A显示密码子优化磷酸泛酰巯基乙胺转移酶的核苷酸序列（SEQIDN0 :92)， 并且图60B显示所编码氨基酸序列（SEQIDNO:93)。
[0068] 图61显示质粒pZS*-13S_720721opt的质粒图谱。
[0069] 图62A和62B显示从琥珀酸酯、琥珀酰基-CoA和a-酮戊二酸酯产生1，4_ 丁二醇 的途径。缩写：A)琥珀酰基-CoA还原酶（形成醛），B)a-酮戊二酸脱羧酶，C)4-羟基丁酸 脱氢酶，D) 4-羟基丁酸还原酶，E) 1，4- 丁二醇脱氢酶，F)琥珀酸还原酶，G)琥珀酰基-CoA 转移酶，H)琥珀酰基-CoA水解酶，I)琥珀酰基-CoA合成酶（或琥珀酰基-CoA连接酶）， J)谷氨酸脱氢酶，K)谷氨酸转氨酶，L)谷氨酸脱羧酶，M) 4-氨基丁酸脱氢酶，N) 4-氨基丁 酸转氨酶，〇) 4-羟基丁酸激酶，P)磷酸转-4-羟基丁酰基酶，Q) 4-羟基丁酰基-CoA还原酶 (形成醛），R) 4-羟基丁酰基-磷酸酯还原酶，S)琥珀酰基-CoA还原酶（形成醇），T) 4-羟 基丁酰基-CoA转移酶，U) 4-羟基丁酰基-CoA水解酶，V) 4-羟基丁酰基-CoA合成酶（或 4-羟基丁酰基-CoA连接酶），W) 4-羟基丁酰基-CoA还原酶（形成醇），X)a-酮戊二酸还 原酶，Y) 5-羟基-2-氧代戊酸脱氢酶，Z) 5-羟基-2-氧代戊酸脱羧酶，AA) 5-羟基-2-氧代 戊酸脱氢酶（脱羧）。
[0070] 图63显示从琥珀酸酯、琥珀酰基-CoA和a-酮戊二酸酯产生腐胺的途径。缩写： A)琥珀酰基-CoA还原酶（形成醛），B)a-酮戊二酸脱羧酶，C) 4-氨基丁酸还原酶，D)腐 胺脱氢酶，E)腐胺转氨酶，F)琥珀酸还原酶，G)琥珀酰基-CoA转移酶，H)琥珀酰基-CoA 水解酶，I)琥珀酰基-CoA合成酶（或琥珀酰基-CoA连接酶），J)谷氨酸脱氢酶，K)谷氨 酸转氨酶，L)谷氨酸脱羧酶，M) 4-氨基丁酸脱氢酶，N) 4-氨基丁酸转氨酶，0)a-酮戊二酸 还原酶，P) 5-氨基-2-氧代戊酸脱氢酶，Q) 5-氨基-2-氧代戊酸转氨酶，R) 5-氨基-2-氧 代戊酸脱羧酶，S)鸟氨酸脱氢酶，T)鸟氨酸转氨酶，U)鸟氨酸脱羧酶。
[0071] 图64A显不来自耻垢分枝杆菌（Mycobacteriumsmegmatis)mc⑵155 (命名为 890)的羧酸还原酶的核苷酸序列（SEQIDN0 :94)，并且图64B显示所编码氨基酸序列（SEQ IDN0 :95)。
[0072] 图65A显不来自鸟分枝杆菌副结核亚种K-10(Mycobacteriumaviumsubspecies paratuberculosisK-10)(命名为891)的羧酸还原酶的核苷酸序列（SEQIDN0:96)，并且 图65B显示所编码氨基酸序列（SEQIDNO:97)。
[0073] 图66A显不来自海栖分枝杆菌M(MycobacteriummarinumM)(命名为892)的羧 酸还原酶的核苷酸序列（SEQIDN0:98)，并且图66B显示所编码氨基酸序列（SEQIDN0: 99)。
[0074] 图67显示大肠杆菌MG1655染色体在核苷酸760928与765930之间的示意图。
[0075] 图68A-68E显示用于构筑sue⑶缺失的序列和寡核苷酸的示意图。
[0076] 图69显示实例性BD0途径。各编号步骤的酶名称如下：（1)a-酮戊二酸脱羧酶； (2)CoA依赖性琥珀酸半醛脱氢酶；（3) 4-羟基丁酸脱氢酶；(4) 4-羟基丁酰基-CoA转移酶； (5) 4-羟基丁酰基-CoA还原酶；（6) 4-羟基丁醛还原酶。
[0077] 图70显示从葡萄糖形成BD0的实例性途径。缩写：G6P_葡萄糖-6-磷酸酯、 PEP-磷酸烯醇丙酮酸酯、PYR-丙酮酸酯、0A-草酰乙酸酯、ACC0A-乙酰基-CoA、CIT-柠檬 酸酯、ICIT-异柠檬酸酯、AKG-a-酮戊二酸酯、SUCC0A-琥珀酰基-CoA、SUCSAL-琥珀酸 半醛、4HB-4-羟基丁酸酯、4HBCoA-4-羟基丁酰基-CoA、4HBALD-4 羟基丁醛、BD0-1，4- 丁 二醇、GBL-y-丁内酯。所关注基因：ppc-PEP羧化酶、sue⑶-琥珀酰基-CoA合成酶、 sucAB-lpdA-AKG脱氢酶复合物的亚单元、ybgC、tesB-酰基-辅酶A硫酯酶。
[0078] 图71显示相较于对照菌株的4个重复的相应平均值，来自基因ppc过表达的产生 4HB的宿主菌株的4个重复的平均BD0和4HB数量。
[0079] 图72显示相较于对照，来自ppc过表达的菌株的4个重复的平均乙醇数量的降 低。
[0080] 图73显示相较于来自对照菌株的4个重复的对应平均值，来自在pZS*上过表达 基因sucAB和突变lpdA的产生4HB的宿主菌株的4个重复的平均BD0和4HB数量。ALD和 ADH是在质粒pPZSX23R上表达。
[0081] 图74显示来自基因sucAB和突变lpdA在pZS*上过表达且相较于那些来自对照 者的菌株的4个重复的平均谷氨酸酯数量的降低。
[0082] 图75显示4-HB内酯化成GBL的表观平衡常数随pH的变化（在22°C下）（来自埃 费（Efe)等人，生物技术与生物工程（Biotechnol.Bioeng.) 99:1392-1406 (2008))。
[0083] 图76显示相较于来自对照菌株（2237)的4个重复的相应平均值，来自整合有酯 酶的能够产生4-羟基丁酰基-CoA的宿主菌株（2387)的4个重复的平均BD0和4HB数量。
[0084] 图77显示相较于来自对照菌株（2237)的4个重复的相应平均值，来自整合有酯 酶的宿主菌株（2387)的4个重复的平均GBL数量。整合有酯酶的菌株观察到较低GBL。
[0085] 图78显示相较于来自4个对照菌株（4070)重复的相应平均值，来自缺失基因 sue⑶的4个宿主菌株（4269)重复的BD0和4HB平均数。
[0086] 图79显示相较于来自对照菌株（1136)的3个重复的相应平均值，来自缺失基因 ybgC和tesB的宿主菌株（1197)的3个重复的BD0和4HB平均数。
[0087] 图80显示相较于来自对照菌株（1136)的3个重复的相应平均值，来自缺失基因 ybgC和tesB的宿主菌株（1197)的3个重复的GBL平均数。
[0088] 图81显示各部分的阴离子交换洗脱、回流（backflux)活性以及SDSpage的概况。
[0089] 图82显示各部分的分子大小筛选色谱、回流活性以及SDSpage的概况。
[0090]图83显示分子大小筛选管柱和SDSpage的回流活性。
[0091]图84显示，利用抗生蛋白链菌素标签克隆yjgB基因，使其表达并纯化以表征其性 质。纯化结果是经由SDS-PAGE获得。
[0092] 图85显示在lOOmMBD0中的yjgB活性。
[0093] 图86显示菌株1872相对于菌株1889的平均BD0、4HB和GBL数量。
[0094] 图87显示菌株956相对于菌株879的平均BD0、4HB和GBL数量。
[0095]图 88 显示菌株 1889、2424、2611 和 2471 的平均BD0、4HB和GBL数量。
[0096] 图89A显示耶氏杆菌属（Yersinia)基因（基因座yinte0001_13710)的核苷酸序 列（SEQIDN0 :177)，并且图89B显示所编码氨基酸序列（SEQIDN0 :179)。
[0097] 图90A显示来自根癌土壤杆菌（Agrobacteriumtumefaciens)的基因的核苷酸序 列（SEQIDN0 :178)，并且图90B显示所编码氨基酸序列（SEQIDN0 :180)。
[0098] 图91显示对应于以下的代谢修饰的实例性组合：(A)增加磷酸烯醇丙酮酸羧化 酶表达的遗传修饰；(B)增加a-酮戊二酸脱氢酶表达的遗传修饰；(C)增加非磷酸转移酶 (PTS)葡萄糖吸收系统表达的遗传修饰；(D)增加丁内酯酯酶表达的遗传修饰；(E)降 低琥珀酰基-CoA合成酶表达的遗传修饰；(F)降低酰基辅酶A硫酯酶表达的遗传修饰；(G) 降低醇脱氢酶表达的遗传修饰；(H)降低非产能NADH脱氢酶表达的遗传修饰；（I)降低细 胞色素氧化酶表达的遗传修饰；(J)增加丙酮酸脱氢酶表达的遗传修饰；(K)降低好氧性呼 吸控制调节系统表达的遗传修饰；(L)增加对NADH不敏感的柠檬酸合成酶表达的遗传修 饰；(M)降低苹果酸脱氢酶表达的遗传修饰；(N)降低乳酸脱氢酶表达的遗传修饰；(0)降 低醇脱氢酶表达的遗传修饰；和（P)降低丙酮酸甲酸裂解酶表达的遗传修饰。
【具体实施方式】
[0099] 本发明涉及具有4-羟基丁酸（4-HB)、丁内酯、1，4_ 丁二醇（BD0)、4_羟基丁 醛（4-HBal)、4-羟基丁酰基-C〇A(4-HBC〇A)和/或腐胺的生物合成产生能力的细胞和生物 体的设计和产生。特定来说，本发明涉及通过引入一或多个编码BD0、4-HBal、4-HBC〇A和/ 或腐胺途径酶的核酸能够产生BD0、4-HBal、4-HBC〇A和/或腐胺的微生物的设计。
[0100] 在一个实施例中，本发明利用大肠杆菌代谢的计算机化学计量模型，其鉴别用于 4-羟基丁酸（4-HB)、1，4- 丁二醇（BD0)、4-HBal、4-HBC〇A和/或腐胺的生物合成产生的代 谢设计。本文所述结果指示，代谢途径可经设计并重组改造以在大肠杆菌和其它细胞或生 物体中生物合成4-HBal、4-HBCoA或4-HB和下游产物，例如1，4- 丁二醇或腐胺。生物合成 产生用于（例如）计算机设计的4-HB、4-HBal、4-HBCoA、BD0和/或腐胺可通过